人BURKITT'S淋巴瘤细胞的培养操作步骤及应用！

                 人BURKITT'S淋巴瘤细胞的培养操作步骤及应用！

一、背景

人BURKITT'S淋巴瘤细胞是由E·Klein和G·Klein于1967年5月从一位16岁黑人男性Burkitt's淋巴瘤患者建立的。Daudi细胞表面免疫球蛋白阳性(sIg+)、Β2-微球蛋白阴性，EBNA阳性，并有衣壳抗原VCA；Daudi细胞携带EB病毒。Daudi细胞是典型的B淋巴母细胞，广泛应用于白血病发生机理的研究。

二、人BURKITT'S淋巴瘤细胞培养操作

1)复苏人BURKITT'S淋巴瘤细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后轻轻吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人BURKITT'S淋巴瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心3-5min分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:4的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)人BURKITT'S淋巴瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人BURKITT'S淋巴瘤细胞可以用于DAPT影响Burkitt's淋巴瘤细胞株（Raji细胞）的Notch信号通路了解Raji细胞内Notch信号通路激活情况;探索DAPT对Raji细胞生存的影响及其对Raji细胞Notch分子的作用;探讨在Raji细胞中Notch分子对NF-κB信号通路的影响,进一步认识Notch和NF-κB信号通路之间的相互作用。

方法：以正常人外周血单个核细胞(PBMC)为阴性对照,T-ALL细胞株Jurkat细胞为阳性对照,利用Western blot检测Raji细胞Notch1 transmembrane subunit(NTM)蛋白水平,q RT-PCR检测Notch1下游靶分子Hes1的转录水平;不同浓度DAPT作用Raji细胞后,利用CCK-8法检测Raji细胞增殖情况;DAPT作用Raji细胞48h后,利用流式细胞术检测细胞周期及其细胞凋亡情况;DAPT作用Raji细胞48h后,利用q RT-PCR检测Notch1、Hes1、c-myc、p65、p50 m RNA的改变,利用Western blot检测NTM蛋白水平变化,Rel A(p65)、p50在胞浆和胞核蛋白水平变化。

结果：

1、Western blot结果显示,相比正常人外周血单个核细胞(PMBC),Raji细胞可检测到较高的NTM蛋白,但二者均低于阳性对照Jurkat细胞;q RT-PCR结果提示,与正常对照相比,Raji细胞和Jurkat细胞内表达高水平的Hes1 m RNA;

2、DAPT作用Raji细胞后,其增殖受到抑制,且随着浓度的增加和作用时间的延长,抑制作用明显增强;

3、DAPT能促进Raji细胞凋亡比例增多;

4、DAPT作用后,Raji细胞增殖阻滞在S期;

5、DAPT作用Raji细胞后,Western blot结果显示NTM的蛋白水平轻度升高;

6、DAPT作用Raji细胞后,胞核内的p50和p65蛋白水平均增高,c-myc的m RNA水平增高。

结论：

1、Raji细胞表达较高的NTM蛋白和Hes1 m RNA;

2、DAPT可抑制Raji细胞增殖、促进细胞凋亡和促使细胞增殖阻滞于S期;

3、上述现象可能的机制是DAPT抑制NTM蛋白的酶切从而下调Hes1 m RNA的表达,同时增强NF-κB的活性。

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