小鼠脂肪干细胞的背景与应用及使用方法！

                 小鼠脂肪干细胞的背景与应用及使用方法！

一、背景

小鼠脂肪干细胞分离自脂肪组织；脂肪组织主要由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶；贮存的脂肪，在需要时可迅速分解成甘油和脂肪酸，经血液输送到各组织以供利用。它们影响胰岛素敏感性、血压水平、内皮功能、纤溶活动及炎症反应，参与多种重要病理生理过程；脂肪组织已由过去单纯作为能量储存的器官而成为一个极其重要的内分泌系统。脂肪干细胞(ADSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞，主要恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。

小鼠脂肪干细胞具有很多优点：①具有自我更新及多向分化的潜能；②来源充足；③对供区的创伤较小；④获得率及体外扩增速率高。脂肪干细胞是目前被广泛应用于组织工程领域中理想的种子细胞。

二、小鼠脂肪干细胞使用方法

1、收到细胞后，请按照以下方法进行操作：

取出25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置4-6小时或过夜，以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。

2、小鼠脂肪干细胞传代：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.125%胰蛋白酶消化液约2ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1500rpm/min，离心5min；

3）弃上清，沉淀细胞用12ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，最后放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

3、小鼠脂肪干细胞冻存：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.125%胰蛋白酶消化液约2ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后轻轻吹打细胞使之脱落，再加入完全培养液终止消化，然后将悬液转移至15ml离心管中，1500rpm/min，离心5min；

3）用适当量的冻存液（基础培养基：FBS：DMSO=7:2:1）重悬细胞，并放置于冻存管中；

4）先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。

4、小鼠脂肪干细胞复苏：

1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

2）将冻存管中的细胞移至15ml无菌离心管中，滴加入完全培养液5ml混匀细胞，然后将细胞悬液转移至适当面积大小的培养皿中；

3）放置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

三、应用

小鼠脂肪干细胞可以用于促进脂肪干细胞移植后存活和自体脂肪移植存活的研究：

壳聚糖支架负载SHH和CM-Dil标记的脂肪干细胞移植后存活分化研究：

目的：观察SHH、壳聚糖支架联合或分别使用对体内移植的脂肪干细胞存活和分化的影响。

方法：将健康C57BL/6小鼠随机分为A组(PBS+ADSCs)、B组(SHH+ADSCs)、C组(壳聚糖+ADSCs)、D组(壳聚糖+SHH+ADSCs)。将各组混合物分别注射到小鼠背部皮下。术后1、2、4、8周处死小鼠,通过对移植组织一般观察、荧光显微镜观察、HE染色、免疫组化染色、TUNEL染色来评价移植细胞存活分化的情况。[结果]术后八周,壳聚糖支架完全降解,大体观察、HE染色、免疫组化染色、TUNEL凋亡染色均说明壳聚糖支架同时搭载SHH和ADSCs脂肪干细胞存活率较高,血管新生增加,效果均优于A、B、C三组。

结论：壳聚糖支架同时负载SHH和ADSCs可有效促进干细胞存活,显著增加血管组织数量。

第二部分硫化氢提升小鼠脂肪移植存活率的研究：

目的：探讨提高血硫化氢(hydrogensulfide,H2S)浓度是否可以提高自体脂肪移植的存活率。

方法：选取18只6周龄健康BALB/c小鼠,将其随机分为3组.即空白组(单纯颗粒脂肪)、H2S组(单纯颗粒脂肪)、SHH(Sonichedgehog,SHH)组(颗粒脂肪混合SHH,混合后SHH浓度为500μg/L),每组6只。将各组混合物注射入BALB/c小鼠背部皮下,H2S组术后每日腹腔注射硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)溶液50μmol/kg。术后1、2、4周处死小鼠,通过对手术取出的移植组织包块进行一般观察、流式细胞仪检测、HE染色、免疫组化染色来评价移植组织存活及血管新生的情况。

结果：大体观察、annexin V-FITC/Pi细胞凋亡实验流式结果显示第一周凋亡率SHH组低于H2S组,H2S组低于空白组,具有统计学意义(P<0.01)。第二周凋亡率H2S组与SHH组结果相近,无统计学差异,H2S组与SHH组均低于空白组,具有统计学意义(P<0.01)。HE染色镜下细胞计数结果显示SHH组与H2S组无统计学差异,SHH组、H2S组数量均大于空白组,具有统计学意义(P<0.01)及免疫组化染色均说明H2S可以提高移植组织存活率,减少细胞凋亡,促进新生血管增殖。

结论：提高血H2S浓度可以有效抑制移植组织细胞凋亡坏死,促进血管新生。

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！