血液增菌培养基的实验方法与应用！

                   血液增菌培养基的实验方法与应用！

一、背景

血液增菌培养基用于血液、胸、腹水等无菌液体标本需氧菌的增菌实验时使用，满足各种需氧菌的培养需求。

原理：该培养基营养成分丰富，加入指示剂，在无菌的情况下显红色，有菌生长的情况下为黄色，如有产硷细菌生长显深红色。

成分(g/L)：蛋白胨10.0；牛肉浸出粉3.0；氯化钠5.0；葡萄糖3.0；枸橼酸钠3.0；对氨基苯甲酸0.05；硫酸镁2.4；酚红0.024；pH值7.4±0.1，25℃。

用法：称取本品26.5g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,分装每瓶50-100ml,121℃高压灭菌15分钟,备用。

二、实验方法

1、集标本和接种

接种前仔细检查培养瓶内是否被污染（由红变黄）。黑色血红蛋白颗粒属正常。

打开瓶上的铝盖进行严格消毒，无菌采集标本5-10ml，直接用针头穿入橡胶塞中心部位入瓶内，加入标本（不可将注射器中空气注入瓶内），取出针头再次消毒瓶塞。

轻摇培养瓶使液体充分混匀。然后在瓶上写好病人的姓名、接种日期等。

2、培养

将培养瓶放入35-37度培养箱中培养。

以后每天取出观察，看瓶中液体是否变色。

3、结果判读

一周内任何时间发现有培养基变色；血液层上有絮状沉淀；血液层表面或深层有白色颗粒；液体培养基凝固等细菌生长迹象，应立即做菌种的分离鉴定及初步药敏分析。

三、应用

用于动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法研究：

目前对食品中致病菌检测的方法以微生物常规培养法为主,需要37天,操作繁琐,所用试剂复杂多样,费用很高,不能满足实际商品流通需要。PCR（聚合酶链式反应）技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速的特点,使用PCR技术检测食品中致病菌的研究方兴未艾。大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌是污染动物性食品的四种重要的致病菌。

结合通用前增菌技术研究,建立了一种多重PCR检测新方法,可以在LB培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的这四种致病菌。该方法具有特异性良好、简便快速、经济实用的优点。研究结果如下:（1）对大肠埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、伤寒沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、单增李氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、荧光假单胞菌等九种食源性致病菌进行通用前增菌方法研究,实验表明,在LB肉汤培养基36℃培养18 h,增菌效果最好,且增菌数量级均衡一致,达108 cfu/mL。

（2） LB、NB和UPB培养基中30℃、33℃、36℃培养12h,大肠埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、伤寒沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、单增李氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、荧光假单胞菌等九种菌增菌数量级达到106以上,也能够满足PCR等检测方法的需要。但这几种培养基在36℃的培养时间应选在1218 h左右,不宜超过18 h。

（3） 根据大肠埃希氏菌O157:H7的eaeA基因,单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因,小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因,荧光假单胞菌的htpX基因设计了4对引物。实验证实具有良好的特异性。

（4）建立了大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌的单重和多重PCR检测方法,并确定了多重PCR体系和热循环参数。经实验证实了所建立的方法特异性很强。

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