人肝正常细胞的培养步骤与注意事项！

                人肝正常细胞的培养步骤与注意事项！

一、基本信息

平台编号：bio-73052

拉丁属名：HL-7702(L-02)

规格：1×10?cells/T25培养瓶

细胞名称：HL-7702 [L-02]（人正常肝细胞）

种属：人

生长特性：贴壁

细胞形态：上皮细胞样

背景描述：HL-7702 [L-02]细胞是人正常肝细胞；HL-7702 [L-02]细胞群体倍增时间约为20小时，细胞形态呈上皮样细胞。在电子显微镜下，亦显示上皮细胞所具有的桥粒和张力原纤维，HL-7702 [L-02]细胞增殖迅速，AFP与CK-19表达阴性，ALB表达在10μg/ml水平，部分细胞多次传代后发生形态变异，ALB表达缺失。

生长培养基：RPMI-1640(货号:PM150110)＋10% FBS(货号:164210-500)＋1% P/S(货号:PB180120)

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5% 温度：37℃

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用。

细胞用途：仅供科研使用。

二、细胞介绍

L-02细胞建系鉴定于1980年。该细胞是一株正常肝细胞系,具有典型的肝细胞形态学特征,可用于多种实验研究。

三、细胞特性

1)来源：*

2)形态：上皮细胞样,贴壁生长

3)含量：>1x106 个/mL

4)污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

5)规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

四、细胞的运输和保存

可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式：(1)干冰运输,收到后立即转入液氮冻存或直接复苏;(2)存活细胞,收到后应继续生长,传代达到细胞生长状态良好时,再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

五、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备

1)准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号21875-091);北美胎牛血清,20%;双抗1%。

2)培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。液氮储存。

2、细胞处理

1)复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代：如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

3)细胞冻存：待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。

对于贴壁细胞,传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

下面T25瓶为例；

1、细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入2ml完全培养基终止消化,可使用血球计数板计数。

2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮,加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀,按每1ml的数量分配到冻存管中,注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3、将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

六、注意事项

1、收到细胞后,若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染,请立即与我们联系。

2、收到细胞先不开瓶盖,瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置2-4小时(视细胞密度而定)稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对细胞进行不同倍数拍照(建议收细胞时就整体外观拍一张照片,观察培养基的颜色和是否有漏液情况,随后在显微镜下拍下细胞状态,100*,200*各一张),观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。

3、由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素影响,故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态,故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后客服人员沟通的时间证明,期间间隔时间不能大于7天。

4、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性,必须在二级生物安全台内操作,并请注意防护,所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。