NIH:OVCAR-3人卵巢癌细胞的应用！

                 NIH:OVCAR-3人卵巢癌细胞的应用！

一、背景

NIH:OVCAR-3人卵巢癌细胞是由T·C·Hamilton在1982年建系，取材于患进行性卵巢腺癌病人的恶性腹水。NIH:OVCAR-3[OVCAR3]细胞与107细胞联合皮下接种5只裸鼠21天后全部成瘤。NIH:OVCAR-3[OVCAR3]细胞是研究卵巢癌药物抗性的一个合适的模型系统且由于存在激素受体，这对于激素治疗的评估或许是有用的。

二、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，20%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于GSK-3β稳定错配修复蛋白PMS2抑制卵巢癌的探索研究：

检测PMS2,GSK-3β和p-GSK-3β在人卵巢癌细胞株A2780,Angle,NIH:OVCAR-3,Caov3,SKOV3中的表达与相互关系及意义。

方法：

1、实时荧光定量PCR法检测PMS2和GSK-3βmRNA水平在A2780,Angle,NIH:OVCAR-3,Caov3,SKOV3细胞及正常卵巢组织中的表达。

2、Western blot免疫印迹法检测PMS2,GSK-3β和p-GSK-3β的蛋白水平在A2780,Angle,NIH:OVCAR-3,Caov3,SKOV3细胞中的表达。

3、免疫组化双染法检测卵巢组织中PMS2和p-GSK-3β的表达。

4、分析PMS2与GSK-3βmRNA水平的相关性和PMS2与GSK-3β磷酸化水平（p-GSK-3β/GSK-3β）的相关性。

5、MTT法检测LiCl阻断GSK-3β活性后,细胞增殖的改变。

结果：

1、PMS2 mRNA在A2780,Angle,NIH:OVCAR-3,Caov3,SKOV3细胞的表达相对量分别为正常卵巢组织的74.59±41.376,1.85±0.369,50.16±30.316,1.65±0.901,3.04±0.887倍;GSK-3βmRNA在A2780,Angle,NIH:OVCAR-3,Caov3,SKOV3细胞的表达相对量分别为正常卵巢组织的54.27±32.137,0.47±0.010,92.04±30.316,17.44±2.621,5.08±0.256倍。

2、PMS2,GSK-3β和p-GSK-3β在人卵巢癌细胞株A2780,Angle,NIH:OVCAR-3,Caov3,SKOV3中均有表达。

3、PMS2和GSK-3βmRNA在人卵巢癌细胞株和正常卵巢组织中的表达呈正相关性,R=0.853,P<0.001;PMS2与p-GSK-3β呈负相关,R=-0.402,P<0.001。4.不同浓度的LiCl作用于卵巢癌细胞株后,细胞增殖被抑制,且抑制率呈LiCl的浓度依赖性。

结论：PMS2,GSK-3β和p-GSK-3β在人卵巢癌细胞株A2780,Angle,NIH:OVCAR-3,Caov3,SKOV3中均有表达,PMS2的表达可能受GSK-3β的调控。

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