果蝇胚胎细胞的培养操作与注意事项！

                 果蝇胚胎细胞的培养操作与注意事项！

一、细胞简介

平台编号：bio-51705

规格：暂不提供

拉丁属名：S2

细胞株名称：果蝇胚胎细胞

种属：果蝇

组织来源：胚胎

生长特性：悬浮贴壁混合生长。

形态特征：上皮细胞样

微生物，支原体检测：阴性

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用

二、细胞说明

1、细胞培养条件是26°C–28°C，空气中即可，不用二氧化碳。在培养皿中是半贴壁细胞，在摇瓶中是悬浮细胞。

2、S2果蝇细胞的完全培养基是：

Schneider's  Drosophila medium + 10% 热灭活胎牛血清+ 0.1% Pluronic F-68. 这个完全细胞培养基在瞬时表达和稳表达细胞系构建的时候，都可以使用。

Pluronic F-68在悬浮培养的时候需要加入，但是在贴壁培养的时候不用添加。可以选择性的加入终浓度为50 单位/ml的青霉素和50 ug/ml的链霉素。细胞转染和冻存的时候，需要确保细胞的活力大于95%。

3、S2果蝇细胞培养时倍增的时间是24小时，细胞进行传代的时候在细胞对数生长期。

4、S2果蝇胚胎细胞的冻存条件是：45% 用过的完全培养基（条件培养基）+45% 新鲜完全培养基+10% DMSO，液氮储存。用过的完全培养基（条件培养基）中含有S2果蝇细胞的生长因子，有助于S2细胞的生长，所以一定要保留一点用过的培养基在里面。

5、培养S2细胞的时候，如果使用未灭活的胎牛血清，会抑制S2细胞的生长。

6、果蝇Schneider 2（s2）细胞可以转染表达载体用于蛋白瞬时表达或共转染一个筛选载体（例如pcohygro或pcoblast）构建稳表达细胞系。我们建议你测试一下你的蛋白的瞬时表达情况，然后再构建稳表达细胞系。一旦你证明你的蛋白质在s2细胞中表达，你可以构建稳表达细胞株，增加蛋白表达，扩大蛋白表达的生产规模。果蝇S2稳表达细胞系通常包含多拷贝基因插入，形成500多个-1000个拷贝数，首尾相接，插入的基因拷贝数可以通过改变表达质粒和选择质粒的比例来控制。我们建议使用表达质粒与选择质粒比例是的19:1（w/w）。你可以改变比率以优化特定基因的表达。质粒转染建议使用磷酸钙，但一些脂基转染试剂，例如Lipo2000转染试剂同样适用。

7、果蝇表达系统的筛选载体是pCoHygro载体和pCoBlast载体，他们分别含有潮霉素（Hygromycin）和杀稻瘟菌素（Blasticidin）筛选抗性。在这两个载体中，抗性基因都是在Copia启动子的作用下调控的。

8、构建稳表达细胞系时，使用pCoHygro筛选质粒和表达质粒一起共转染S2果蝇细胞的时候，潮霉素的筛选浓度是300ug/ml, 一般要筛选3-4个星期。使用使用pCoBlast筛选质粒和表达质粒一起共转染S2果蝇细胞构建稳表达细胞系的时候，杀稻瘟菌素的筛选浓度是25 ug/ml, 一般要筛选2个星期就可以了。在筛选过程中，细胞死亡会经常发生。   

三、细胞特征如下

1、用于蛋白质的瞬时表达或构建稳表达细胞系

果蝇s2细胞可单独用重组表达载体进行瞬时表达研究，或使用载体（如pcohygro或pcoblast）以构建稳表达细胞系。有多种果蝇表达系统试剂盒可用于在S2细胞中表达感兴趣的重组蛋白。

2、细胞株质控标准

每批S2细胞都经过冷冻后细胞生长和活力测试。此外，还对S2细胞株进行了细菌、酵母菌、支原体和病毒污染检测，并对其进行了同工酶和核型分析。

四、接受后处理

1) 收到细胞后，请检查是否漏液，如果漏液，请拍照片发给我们。

2) 请先在显微镜下确认细胞生长状态，去掉封口膜并将T25瓶置于37℃培养约2-3h。

3) 弃去T25瓶中的培养基，添加6ml本公司附带的完全培养基。

4) 如果细胞密度达80%-90%请及时进行细胞传代，传代培养用6ml本公司附带的完全培养基。

5) 接到细胞次日，请检查细胞是否污染，若发现污染或疑似污染，请及时与我们取得联系。

五、培养操作

1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入 4mL 培养基混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2.加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消 化。

3.按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

六、注意事项

1、收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2、仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致。若由于培养条件不一致而导致细胞出现问 题，责任由客户自行承担。

3、用 75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养 4~6 小时,再取出观察。此时多数细胞均 会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及时和我们联系，信息确认后我们为您再免费寄送一次。

4、静置细胞贴壁后，请将细胞瓶内的培养基倒出，留 6~8mL 维持细胞正常培养，待细胞汇合度80%左右时正常传代。

5、请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件。

6、建议客户收到细胞后前 3 天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。