动物肝星状细胞分离培养试剂盒的应用！

               动物肝星状细胞分离培养试剂盒的应用！

一、背景

动物肝星状细胞分离培养试剂盒适合于培养肝星状细胞。试剂盒包含：（1）肝星状细胞组织解离液（2）肝星状细胞组织处理缓冲液（3）肝星状细胞成纤维抑制剂（4）肝星状细胞组织洗液（5）肝星状细胞生长因子及血清（6）肝星状细胞基础培养基（7）肝星状细胞组织预备液。

肝星形细胞分离自肝脏组织；肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用；肝脏也制造消化系统中之胆汁。肝脏是机体内脏里最大的器官，位于机体中的腹部位置，在右侧横隔膜之下，位于胆囊之前端且于右边肾脏的前方，胃的上方。肝脏是机体消化系统中最大的消化腺，为一红棕色的V字形器官。

肝星形细胞分布于肝脏的间隙内，是合成、分泌细胞外基质的主要来源，在肝纤维化的发生中处于最重要地位。肝星形细胞是肝脏特有的间充质细胞，约占肝脏细胞总数的8%-13%。作为肝脏合成细胞外基质的主要细胞群，肝星形细胞不仅能分泌蛋白多糖、糖蛋白等细胞外基质成分，合成一定量的胶原酶以维持正常的基底膜结构，还能通过其突起的收缩参与肝窦的微循环调节。此外，肝星形细胞能通过合成肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子等促进肝细胞增殖和肝再生。

二、应用

用于醛固酮经非基因组途径激活氧化应激通路调控大鼠肝星状细胞收缩迁移的机制研究：

研究醛固酮经小窝所介导的非基因组通路,调控HSC内氧化应激水平,激活RhoA/Rock等相关信号通路的机制,深入探讨醛固酮经cav-1相关的非基因组通路调控HSC活化、收缩、迁移的机制,为阐明醛固酮在门脉高压形成过程中的调控机制提供新线索,为探寻门脉高压及肝纤维化的防治靶点提供新的思路。

研究方法：

1、分离培养原代大鼠肝星状细胞：原位灌注结合离体灌注、密度梯度离心结合差速贴壁法分离并培养原代大鼠肝星状细胞,以肝星状细胞标记蛋白a-SMA免疫荧光染色鉴定细胞纯度,选择体外培养第2-5代大鼠肝星状细胞进行相关体外细胞试验。

2、小窝蛋白提取实验：以10cm细胞培养皿培养原代大鼠肝星状细胞,待培养皿内细胞融合度达80%时,进行12小时饥饿处理,并给予相关药物干预,处理完成后裂解细胞并匀浆,蔗糖密度梯度离心分离蛋白并以冷丙酮沉淀纯化,蛋白免疫印迹实验检测目的蛋白含量变化。

3、胆固醇耗竭与重装填实验：向贴壁生长且状态良好的原代大鼠肝星状细胞培养皿中加入终浓度为5nM的MCD溶液,于37℃恒温细胞培养箱孵育30min后,以温PBS缓冲液轻轻冲洗细胞,即可去除细胞内胆固醇；以5m1浓度为50nM的MCD溶液溶解lmg胆固醇,取该溶液加入胆固醇耗竭处理后的细胞培养基内,使MCD终浓度为5nM,细胞置于37℃恒温细胞培养箱孵育30min,即完成胆固醇重装过程。

4、Transwell细胞迁移实验：将制备好的原代大鼠肝星状细胞悬液计数后加入Transwell上室内,于上、下室中分别加入无血清培基和含20%胎牛血清的完全培养基,施加相应药物干预后将细胞置于孵箱内培养适当时间,孵育完成后,弃培基,以PBS清洗细胞并以甲醇固定细胞,随后进行结晶紫染色并于显微镜下计数迁移细胞数目。