大鼠心肌细胞的培养操作与应用！

                    大鼠心肌细胞的培养操作与应用！

一、背景

H9C2(2-1)细胞该细胞由KimesB和BrandtB从BD1X大鼠胚胎心脏组织的克隆细胞株亚克隆得到；表现出许多骨骼肌的特性。这个细胞株中的成肌细胞能融合形成多核的肌管，并对乙酰胆碱的刺激发生反应。如果培养基中的血清浓度下降到1%，融合发生得很快。

二、H9C2(2-1)细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

用于肢体缺血预适应大鼠血清对HUVEC和H9c2（2-1）细胞H2O2损伤的保护作用及机制研究：

观察LIPC大鼠的血清是否可以减轻H2O2所导致的人脐静脉内皮细胞HUVEC和鼠胚胎心肌细胞H9c2（2-1）的氧化应激损伤，分析Nrf2所调控的抗氧化基因是否参与了该过程，以及有可能所涉及的信号通路。

材料和方法：

（1）成年健康SD大鼠，用改良的大鼠尾动脉血压测定仪套管套在大鼠右后肢，加压至200mmHg阻断股动脉造成右后肢短暂缺血，持续5分钟，放气减压恢复血流，持续10分钟，共3个循环。预适应结束后立即腹主动脉无菌采血获得大鼠早期肢体预适应血清。预适应后间隔24小时采血，获得大鼠延迟肢体预适应血清，分装冻存于-80℃。

（2）建立HUVEC和H9c2（2-1）细胞的H2O2损伤模型，参考IC50作为后续实验造模浓度。HUVEC和H9c2（2-1）细胞分为5组，对照组（control，C），模型组（model，M），大鼠早期预适应血清组（preconditioning serum,PS），大鼠延迟预适应血清组（delayed preconditioning serum,DPS），正常大鼠血清组（normal rat serum,NRS），预先用2.5%,5%（V/V）各种血清孵育6小时和12小时，然后用H2O2处理2小时，用MTT法检测各种血清预处理对HUVEC和H9c2（2-1）细胞活性的影响。

（3）应用AnnexinV-FITC和PI双染进一步检测细胞的凋亡情况。

（4）细胞处理完成后，用8μM的DHE孵育45分钟，荧光显微镜下检测ROS的含量。

（5）应用LDH，MDA，CK检测试剂盒检测细胞培养上清液中LDH，CK的活性及MDA的浓度。

（6）采用SOD，CAT，GSH-Px检测试剂盒检测细胞培养上清液中SOD，CAT，GSH-Px的活性。

（7）采用免疫荧光法和激光共聚焦显微镜检测各组细胞Nrf2的核转位情况。

（8）采用real-time RT-PCR检测各组细胞中抗氧化基因CAT，HO-1，SOD1，SOD2，GSH-Px1mRNA的水平。

（9）采用Western Blot法检测各组细胞中CAT，HO-1，SOD1，SOD2的蛋白表达情况。

（10）用25μM PI3K的抑制剂LY294002和26μM MEK1/2抑制剂U0126提前1小时处理细胞，观察这两种抑制剂对PS和DPS作用的影响。

（11）各实验组数据采用mean±SD表示，利用SPSS13.0统计软件分析，组间差异比较采用单因素方差分析。P<0.05认为有显著差异。

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