小鼠结肠癌细胞的传代方法与应用！

                   小鼠结肠癌细胞的传代方法与应用！

一、背景

CT-26细胞是以N-nitroso-N-methylurethane-(NNMU)诱导形成的未分化结肠癌细胞株。它克隆形成的细胞株命名为CT26.WT(ATCC CRL-2638)。用包含编码典型肿瘤相关抗原(TAA)beta-半乳糖苷酶(beta-gal)的lacZ基因的逆转录病毒载体LXSN稳定转染CT26。即使CT26.CL25表达了典型的TAA beta-半乳糖苷酶，在正常小鼠中CT26.CL25和CT26.WT的生长率与致死率也保持基本一致。与CT26.CL25(ATCC CRL-2639)一起可用作测试免疫治疗程序的模型，并用于研究宿主免疫反应。

二、培养步骤

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

三、传代方法

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3、轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

四、应用

用于胡桃醌及胡桃醌与5-FU联合应用对小鼠结肠癌CT-26细胞的体内作用研究：

建立小鼠结肠癌CT-26细胞移植瘤模型,按体重随机分为6组:模型组、阳性药组（20.0mg/kg 5-氟尿嘧啶）、胡桃醌低剂量组（2.5mg/kg胡桃醌）、胡桃醌高剂量组（5.0mg/kg胡桃醌）、联合给药低剂量组（5.0mg/kg胡桃醌+10.0mg/kg 5-氟尿嘧啶）、联合给药高剂量组（5.0mg/kg胡桃醌+20.0mg/kg 5-氟尿嘧啶）。

连续给药9天后,进行动物处理和样本采集。检测指标包括:瘤重及肿瘤HE染色形态学观察、胸腺指数、脾脏指数,血清中白介素-2、血管内皮生长因子、干扰素-γ含量,免疫组化检测ki-67蛋白、E-钙粘蛋白、突变型P53蛋白及Bcl-2蛋白表达量。胡桃醌高和胡桃醌低剂量组抑瘤率分别为40.38%和31.73%,联合高和联合低剂量组抑瘤率分别为75.01%,高于胡桃醌单独应用组及阳性药组,说明胡桃醌具有非常明确的体内抗结肠癌作用,且胡桃醌能增强5-FU抗结肠癌效果。胡桃醌能明显提高血清中白介素-2、干扰素-γ这两种与肿瘤免疫相关的细胞因子含量。

免疫组化结果显示胡桃醌单独应用及胡桃醌与5-氟尿嘧啶联合应用均能显著降低肿瘤细胞增殖抗原ki-67和原癌基因Bcl-2基因的表达、增强与细胞粘性相关的E-钙粘蛋白表达量及血管内皮生长因子含量,说明能通过降低Bcl-2基因诱导肿瘤细胞凋亡,同时能够提高肿瘤细胞黏性,降低肿瘤转移的风险。胡桃醌对于小鼠结肠癌CT-26细胞生长具有明确的体内抑制作用,且能抑制血管生成,增强细胞粘性,降低肿瘤细胞转移和扩散的风险。胡桃醌能增强机体免疫水平达到抗肿瘤的作用。

胡桃醌能增强5-FU对结肠癌的抑制作用,且胡桃醌与5-FU合用能明显改善由于5-FU单独用药所引起的免疫器官指数降低和骨髓抑制所造成的白细胞数减少等副作用。胡桃醌可能的抗肿瘤机制是通过下调Bcl-2抑癌基因的表达,进而诱导结肠癌细胞凋亡。