小鼠正常肝细胞的处理方法与应用！

                   小鼠正常肝细胞的处理方法与应用！

一、背景

小鼠正常肝细胞是从对人TGFα进行转基因的小鼠（CD1株，MT42系）的肝细胞中建立的贴壁上皮样细胞。

通过电子显微镜，这些细胞表现出典型的肝细胞特征，例如过氧化物酶体和胆小管样结构。AML12细胞保留表达血清（白蛋白，α1抗胰蛋白酶和转铁蛋白）和间隙连接（连接蛋白26和32）蛋白的高水平mRNA的能力，并且仅包含乳酸脱氢酶的同工酶5。细胞表达高水平的人TGFα和较低水平的小鼠TGFα。肝特异性蛋白的表达随培养时间的延长而降低，但会通过在无血清培养基中生长细胞而重新激活。

肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构：如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。

二、细胞处理方法

1、弃去培养液，加少量消化液润洗一次。

2、弃去液体，再加入适量的消化液，25cm2细胞瓶可加入1-1.5ml消化液，75 cm2细胞瓶可加入3ml消化液。

3、置室温或37℃放置至细胞变圆或细胞分散为单个细胞，不要摇动以免细胞成团。

4、加入新鲜培养液，吹打混匀并加置新瓶中。

三、应用

用于纳米化诱癌剂诱发小鼠肝癌的机制研究：

建立了小鼠肝癌模型,并对其致癌机制进行了初步研究。目的:制备稳定、高效的纳米化诱癌剂-nanoDEN,通过长期、低频经口给予纳米化诱癌剂建立良好、快捷、稳定的小鼠肝癌模型,研究其致癌机制。

方法：

1、采用高压均质法制备纳米化诱癌剂-nanoDEN,利用激光粒径仪测定其粒径、zeta电位及稳定性,采用扫描电镜观察其微观形态,通过透析袋法测定纳米化诱癌剂的体外释放,完成纳米化诱癌剂的制备与表征。

2、在体的动物水平方面,经口给予16.5 mg/kg纳米化诱癌剂等诱发小鼠肝癌,通过记录小鼠体重变化、观察肝脏大体观（是否出现肿瘤结节）、检测肝功能生化指标（包括ALT、AST等）和镜下对肝脏组织染色（H&E及Masson）进行评分,比较纳米化诱癌剂与DEN致癌效果。

3、分子水平方面,利用免疫组织染色法检测β-catenin（肿瘤发生过程中关键因子）、COX-2（炎症相关因子）、PCNA（与肿瘤发展密切相关的蛋白）的表达量变化情况及TUNEL染色法检测细胞凋亡的变化,分析纳米化诱癌剂的致癌作用。

4、离体的细胞水平方面,采用MTT法检测纳米化诱癌剂及DEN对肝癌细胞株HepG-2、正常肝细胞株L02的毒性作用,比较纳米化诱癌剂与DEN的致癌能力。通过nanoRhod B处理HepG-2及L02细胞,模拟肝癌细胞及正常肝细胞对纳米化诱癌剂的胞吞作用过程。

5、通过小鼠尾静脉注入nanoRhod B实验,模拟纳米化诱癌剂的体内分布情况。

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