海豚链球菌的检测技术与防治方法！

                   海豚链球菌的检测技术与防治方法！

海豚链球菌是一种世界性分布的致病菌，高温期易流行，感染宿主广、传染性强、死亡率高，危害严重。海豚链球菌可以引起鱼类患链球菌病，也会影响人类健康，是一种人畜共患病的致病菌。

一、海豚链球菌概述

海豚链球菌(Streptococcus iniae)最初由Pier等[1]自亚马逊淡水海豚化脓病灶分离得到，因此被命名为海豚链球菌。随后该菌便在北美洲、中东、亚太地区以及欧洲蔓延开来，主要感染淡水和海水鱼。海豚链球菌能引起多种野生和养殖经济鱼类患链球菌病，是链球菌病的主要病原之一，可引起大批量鱼类死亡，给世界水产养殖业造成巨大的经济损失，而且海豚链球菌已经威胁到人类的健康与安全，目前已有多例人因接触病鱼而感染的报道。

海豚链球菌菌株分型复杂，具有scpI、simA、cpsD、sagA、pdi、pgm 和 cfi 等多种毒力因子，因此致病性具有差异性。海豚链球菌隶属于链球菌科、链球菌属，呈圆形或卵圆形，二链或链锁状的球菌，无运动力，有荚膜，革兰氏阳性，兼性厌氧，具有感染宿主广、传染性强、死亡率高等特点。海豚链球菌发育的温度范围为10-45℃，最适温度为20-37℃。发育的盐度范围为0-70，最适盐度为0。发育的pH为3.5-10，最适pH为7.6。

海豚链球菌是一种条件性人畜共患病病原菌，它不仅能感染几乎所有淡、海水鱼类，还可以感染人，引起局部蜂窝组织炎，心内膜炎。目前主要用微生物学、分子生物学及免疫学等检测技术进行诊断，以便对症施治。

二、流行病学和临床症状

1、流行病学

目前，鱼类海豚链球菌病在主要鱼类养殖国家均有发生，但温带和热带、亚热带地区尤其严重。根据国内外相关报道显示，海豚链球菌可感染30余种鱼类，致其发病。链球菌病全年均可发生，但7-9月高温期容易流行，水温降至20℃以下时则较少，在日本全国流行，危害较大。链球菌有时会与其他病原性细菌形成混合感染，造成严重危害。

链球菌为典型的条件致病菌，平常生存于养殖水体及底泥中。在富营养化或养殖自身污染较为严重的水域中，此菌能长期生存，当养殖鱼体抵抗力降低时，易引起疾病。该病的发生与养殖密度大、换水率低、饵料鲜度差及投饵量大密切相关。体表损伤、水环境条件恶劣等常是导致鱼类感染发病的重要因素。

传播途径：链球菌通过水体、摄饵或接触等方式侵染鱼体，但临床发病尚未明确是由哪种具体方式引起；鱼类的相互感染表现为个体之间的水平传播，对于亲本之间的垂直传播暂未发现。其自然感染通过口腔与人工感染有腹腔、肌肉注射或鼻、鳃接种。

2、临床症状

①鱼感染海豚链球菌

从上世纪80年代起，海豚链球菌感染了日本、新加坡、以色列等地，为降低经济损失，以色列率先实行了罗非鱼的疫苗应用计划，然而在短期的疗效后，大批海豚链球菌感染重新爆发，新分离株与之前的海豚链球菌毒株生化特性存在差异，病理损伤上也表现出新变化。海豚链球菌感染的临床症状分为急性和亚急性型，主要表现症状为鱼类的脑膜脑炎。急性感染的鱼类常出现爆发性死亡，但无典型症状。亚急性感染的病鱼常出现体色发黑、吻端发红、食欲减退、嗜睡、单侧或双侧眼球突出、角膜混浊；鳃盖下缘、胸鳍基部、体表的其他部位有出血现象；鳍条边缘褪色、肛门红肿，腹水（图1b）；池边离群漫游，间歇螺旋状或旋转游动，泳姿不平衡，脊骨呈“C”形或逗号样弯曲，死前出现间断性狂游、翻滚或转圈等症状。有些病鱼脑部充血，腹腔有血色腹水，肝、脾、肾等脏器充血肿胀、变色，严重者肝脏和肾脏糜烂。并非所有鱼类感染海豚链球菌都会出现症状，Bromage等（1999）从眼观健康的肺鱼大脑分离到了细菌，结果证实，可以在无病原症状的情况下携带细菌。

②人感染海豚链球菌

研究发现，在有外伤的情况下接触带菌鱼和易感鱼类后，很容易感染链球菌。主要感染症状为手的蜂窝织炎，并伴有发热反应。近年来，随着研究的深入，人感染海豚链球菌主要表现为菌血症、蜂窝织炎、脑膜炎和关节炎。

三、检测技术

1、使用选择培养基筛选

选择培养基是根据海豚链球菌对不同抗菌物质的耐受性，选择合适的抗菌物质来抑制其他菌的生长，进而从养殖水体或病鱼中检出海豚链球菌。Nguyen等设计了醋酸铊—噁喹酸和硫酸黏杆菌素—噁喹酸两种选择性培养基，将其应用于褐牙鲆海豚链球菌的分离。而后Nguyen等将培养基配方进行了改良，以Todd-Hewitt肉汤代替脑心浸液作为基础培养基，硫酸黏杆菌素—噁喹酸培养基中加入醋酸铊0.5g/L，并将其用于日本褐牙鲆养殖场的海豚链球菌的调查,发现醋酸铊—硫酸黏杆菌—噁喹酸培养基比硫酸黏杆菌素—噁喹酸培养基对杂菌的抑制效果更好。

2、微生物学检测技术

微生物学检测技术主要是从病鱼的脑、心脏、肾脏、脾脏或肝脏中取样，通过培养、分离，对典型菌落的形态特征、培养特性、生化特性、致病特性、对药物的敏感性等进行试验，以明确致病原。现已开发出商品化的生化鉴定试剂盒可进行无乳链球菌、海豚链球菌等的鉴定，专属性较强，操作方便，大大缩短诊断时间。

海豚链球菌在10℃生长，45℃不生长；接触酶阴性；可水解七叶灵和精氨酸，Ｖ－Ｐ试验和马脲酸试验阴性等。微生物鉴定系统能够自动测定多种生化反应，依据其自带的数据库进行鉴定后输出结果。

早期对海豚链球菌的鉴定主要依赖于分离菌株的生理生化特性及临床症状。但海豚链球菌不同的地理株系在生化特性上存在差异，不同株的水解酶活性不同。由于海豚链球菌定种较晚，很多商品化的生化鉴定系统并没有将该菌列入其中，而Biolog GP生化鉴定系统不能完全正确鉴定出全部海豚链球菌菌株。生化试验是检测海豚链球菌的主要手段，但其过程大约需要 1～2 d，仅用生化鉴定的方法鉴定海豚链球菌极不可靠。

3、分子生物学检测技术

分子鉴定具有快速、简便以及灵敏度高的优点，是微生物鉴定的发展趋势。分子生物学检测技术，目前主要有基于通用引物的16S rRNA序列分析技术、靶向于某些编码基因的特异性PCR诊断方法和核酸杂交技术等。采用传统的16S rRNA基因进行鉴定，对于亲缘关系较近的细菌常因分辨率不够而较难区分。以提取的分离菌株基因组DNA为模板扩增细菌16S rRNA基因及海豚链球菌lct O基因，扩增产物经１％的琼脂糖凝胶电泳检测后送至公司进行测序。测序结果在NCBI上BLAST比对分析，确定该分离菌株的种类。

多重PCR法是常用的鉴定方法，即在同一反应体系中加入多对引物，扩增同一模板或不同模板的特定区域，因此具有高效、快捷、特异、敏感和低成本等优点。

PCR、核型分型、RAPD和 PFGE等也可用于海豚链球菌检测，然而这些方法也比较耗时，并且可能由于检测过程中多次添加试剂而导致污染。环介导等温扩增技术（Loop－mediated isothermal amplification，LAMP）作为一种敏感、快捷、低成本的检测方法，其扩增可在1h内完成，通过荧光染料的浊度或颜色变化即可检测产物，检测时间大幅缩短。有研究建立了1种基于海豚链球菌Sim基因检测的高效、敏感的LAMP检测方法，并对部分鱼类海豚链球菌的感染状况进行了检测。LAMP检测灵敏度研究结果显示，LAMP对海豚链球菌DNA检测的最低浓度为 5.32拷贝/μL。PCR检测结果显示，其检测最低浓度为 5.32×102 拷贝/μL。

4、免疫学检测技术 

免疫性检测技术主要是基于抗体能特异性地识别、结合相应的抗原，包括双抗夹心法、间接法、竞争法、捕获包被法、酶联免疫吸附法(ELISA)等，其中以 ELISA为代表的免疫学检测技术是目前检测鱼类链球菌较常用的手段。陈善真等制备纯化罗非鱼无乳链球菌特异性IgM和兔抗罗非鱼无乳链球菌Ig的IgG，利用原核表达纯化的无乳链球菌ScpB蛋白质作为包被抗原，建立检测无乳链球菌特异性IgM抗体的ELISA方法，结果表明，该方法仅能够特异性地检测罗非鱼的血清抗体，而与其他鱼类的血清抗体无交叉反应，特异性良好，其敏感性为 1∶800；同时抗体水平的变化与相对免疫保护率变化具有正相关性。

Klesius等筛选了一个对海豚链球菌特异的单克隆抗体，并利用该单抗建立了一种专门诊断海豚链球菌的间接免疫荧光抗体技术，利用该技术，能够成功地对实验或自然条件下的海豚链球菌感染进行诊断。该技术具有较好的特异性，能够较好的将海豚链球菌的感染与其他细菌分辨开来。

四、防治方法

鱼类链球菌病的发生是由环境因素、鱼体抵抗力和病原菌共同作用的结果，对于链球菌病的防治，主要使用改善水体养殖环境、免疫预防和药物治疗等方法。

1、疾病预防

Aruety等研究设计了零排放循环水产养殖系统的污泥消化器，降低污泥中病原菌的含量。Iwashita等通过在饲料中添加微生态制剂增强罗非鱼鱼苗的免疫力，提高了罗非鱼对海豚链球菌和嗜水气单胞菌的抵抗力，Shiau等则通过在低鱼粉和高豆粕的饲料中补充核苷酸，提高了罗非鱼对海豚链球菌的免疫力。

接种疫苗是预防链球菌病的有效方法。目前关于海豚链球菌疫苗的研究主要有灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗。Eldar等利用福尔马林灭活疫苗免疫虹鳟，使得由海豚链球菌引起的虹鳟的死亡率由50%降至5%。张生等利用自患病罗非鱼分离到的海豚链球菌菌株制备的灭活疫苗，通过腹腔注射免疫尼罗罗非鱼，使用8倍半数致死量的剂量攻毒获得100%的相对保护率。Locke将编码毒力因子M蛋白的simＡ基因敲除，构建了一株simＡ突变菌株，使该菌株的毒力大大减弱，对条纹鲈和斑马鱼均显示出较好的保护效应。有一些研究人员研究出针对海豚链球菌的烯醇化酶亚单位疫苗，也有一些研究者构建了一个针对海豚链球菌的DNA疫苗。

2、药物治疗

鱼类海豚链球菌病的治疗，目前主要使用抗菌药物和中草药。

药敏试验结果显示，海豚链球菌对恩诺沙星、诺氟沙星、头孢噻肟、头孢拉定、头孢唑啉、卡那霉素、强力霉素、依诺沙星、红霉素、链霉素、四环素、阿奇霉素、环丙沙星等药物较为敏感，可用于海豚链球菌的治疗。

相关研究表明，中草药对细菌性疾病的防治有积极的效果，中草药通过多靶点机制抑制病原菌生长或杀死病原，常见的作用机制为中草药及其有效成分通过抑制病原菌肽聚糖及细胞壁的合成，使细胞壁裂解；抑制菌体蛋白质的合成使细菌死亡；干扰菌体的酶系，抑制酶的活性，使菌体的新陈代谢发生紊乱而死亡；

抑制细菌的呼吸代谢，使病原菌无法完成正常的呼吸代谢而死亡。吴颖瑞等研究表明，罗非鱼源海豚链球菌对羌活低度敏感，而黄芩、连翘、白芷、仓术对罗非鱼海豚链球菌无抑菌效果。张彬等研究发现，黄连、黄芩、大黄和黄柏对海豚链球菌的抑制作用较强；同时黄柏与黄连、大黄与黄芩联用抗菌作用增强，大黄与黄连联用不变，而黄柏与黄芩、黄柏与大黄、黄芩与黄连联用抑菌能力降低。

药物通过合理的配伍组成方剂，可以增强或改变其原来的功用，并调其偏胜，制其毒性，消除或缓解其对机体不良反应，发挥药物间相辅相成或相反相成等综合作用，使各具特性的药物组合成一个整体，从而发挥更好的预防与治疗效果。

五、总结与展望

海豚链球菌是一种世界性分布的致病菌，每年都会造成巨大的经济损失。防止鱼类海豚链球菌病的发生，首先要探明海豚链球菌的传播途径和致病机制，目前海豚链球菌的致病机理还仅限于对部分毒力因子的研究，有关致病机制还有待深入研究。海豚链球菌病的治疗，目前主要使用抗菌药物，由于抗生素的使用存在许多问题，人们已将防治焦点聚集在疫苗的研发和使用上，并且逐步成为渔业水产养殖领域有效预防传染性疾病的重要途径。尽管目前对链球菌疫苗的研究越来越多，但是上市产品仍较少，大部分处于试验阶段，临床效果还有待检验。中草药具有抑菌、抗菌的效果，而且具备来源广泛、价格低廉、毒副作用小、药物残留少、无耐药性等特点，因此备受养殖企业和科研人员的关注，但其对病原菌的抑菌机理目前尚未明了，有待于进一步证实。