单核增生李斯特菌的生化反应与检测方法！

                单核增生李斯特菌的生化反应与检测方法！

单核增生李斯特菌，简称单增李斯特菌，革兰氏阳性小杆菌，大小为（0.4-0.5）μm×（0.5-2）μm，直或稍弯，多数菌体一端较大，似棒状，常呈V字型排列，有的呈丝状，偶尔可见双球状。在22℃-25℃环境可形成4根鞭毛。本菌对理化因素抵抗力较强。在士壤、粪便、青贮饲料和干草内能长期存活:对碱和盐抵抗力强，对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺等均敏感。本菌营养要求不高，兼性厌氧。菌落初期极小，水滴样，经37℃数天培养后，直径可达2mm，初期菌落光滑、透明，后变灰暗。血平板上的菌落有β-型溶血环本菌耐碱不耐酸，在4℃-45℃均能生长，最适生长温度30℃-37℃。 它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李斯特氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

一、菌种简介

拉丁属名：Listeria monocytogenes

菌种名称：单核增生李斯特菌

其它编号：ATCC19115

培养基编号：75

培养温度：37.0℃

培养时间：18-24-小时

用途：质量控制菌种

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用。

二、菌种来源

李斯特氏菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的。为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827-1912），1940年，在第三届国际微生物学大会上将其命名为李斯特氏菌。 

三、菌种种类

国际上公认的李斯特菌共有以下七个菌株：

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊李斯特菌（Listeria iuanuii）、英诺克李斯特菌（Listeria innocua）、威尔斯李斯特菌（Listeria welshimeri）、西尔李斯特菌（Listeria seeligeri）、格雷李斯特菌（Listeria grayi）、默里李斯特菌（Listeria murrayi）。其中，单核细胞增生李斯特氏菌是唯一能够引起人类疾病的，它是一种人畜共患病的病原菌，中毒严重的可引起血液和脑组织感染。单核细胞增生李斯特氏菌简称单增李斯特氏菌，为革兰阳性菌，属厚壁菌门。 

四、细菌分型

根据菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原，将单增李斯特氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 个血清型。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b，后两型尤多。该菌与多种革兰阳性菌有共同抗原，故血清学诊断无意义。 

本菌的抗原结构与毒力无关，且本菌与葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌等多数革兰氏阳性菌和大肠杆菌有共同抗原，故血清学诊断无意义。

五、形态与染色

该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm，直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。 

幼龄培养物为革兰氏阳性，陈旧培养物可转为革兰氏阴性，呈两极着色，易误认为双球菌。 

六、培养特性

该菌营养要求不高，在20-25℃培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌的生长范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8-4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂（TSAYE）和改良Mc Bride（MMA）琼脂上，用45角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。 

七、生化反应

该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。 

八、抵抗力

该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活，对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。 

九、分布范围

单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，该菌在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有存在，所以动物很容易食入该菌。 

十、检测方法

1、细菌培养法

该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围—1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。在血琼脂平板上有β溶血环。在显色培养基上呈蓝绿色。

食品中李斯特氏菌的传统检验方法是进行前增菌或选择性增菌，以分离培养得到的可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验（CAM P）等免疫学检测，被确定为李斯特氏菌后进一步进行血清分型。该方法中增菌和选择性增菌是不可缺少的步骤。增菌的方法主要包括：冷增菌法和常温培养方法。冷增菌法是在4℃培养30d ，有时甚至长达一年。常温增菌需培养24h 至7d 。故传统检测方法需要7-11d 才能分离鉴定出李斯特氏菌，故传统方法检测周期较长。 

2、血清凝集法

根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。抗原结构与毒力无关，对人致病的主要为血清型1/2a、1/2b、4b，占全球本病病例约90%。

3、分子生物学检测方法

随着核酸探针杂交技术的应用，使对单核细胞增生性李斯特氏菌的检测进入了分子水平。 

①探针检测技术

这一技术是最早应用于李斯特氏菌检测的分子生物

学技术。早在1988年，Atin 等就克隆出李斯特氏菌β溶血素基因的一个500bp DNA 片断并测序，以此序列合成4种寡核苷酸探针，以32P 标记该探针，经斑点杂交实验证实，该探针只与李斯特氏菌反应，与其他种的李斯特氏菌和属外的细菌均呈阴性，表现出很好的特异性。但探针杂交无法分辨死菌和活菌，尽管通过增菌可使死菌比例减少，相对地减少假阳性，但并不能完全杜绝假阳性结果。随着探针技术的逐渐成熟，人们开始关注将多个DNA 特异性探针固定到芯片上，制成基因芯片。基因芯片的特点是可同时检测多种菌，可以减少实验次数，并且检测所需的引物较少。 

②聚合酶链式反应（poly merase chain reaction ，PCR）检测技术

PCR 的发展已经相当成熟，广泛应用于李斯特氏菌的检测。PCR 扩增特异性引物一种是依据李斯特氏菌的特异毒力基因序列而设计，一种是依据李斯特氏菌基因组中特异序列而设计。常用的靶序列为hly A 、iap 、inl 、Dth-18等毒力基因。利用PCR 方法来检测李斯特氏菌的优点是方法的特异性好，不足之处是灵敏度较低；将样品培养物经化学抽提后再进行扩增，提高了样品的检出率；并且可以检测到传统增菌方法不能检出的“活的非可培养”的李斯特氏菌。PCR 技术还可对李斯特氏菌进行定量检测。例如Nogva 等运用5′-核酸酶PCR 对单增李斯特氏菌定量；Choia 等运用cPCR 对李斯特氏菌进行定量；Long 等以hly 为靶基因，采用PCRELISA联合检测技术。