HEP3B 人肝癌细胞的处理方法与应用！

                 HEP3B 人肝癌细胞的处理方法与应用！

一、背景

HEP3B人肝癌细胞系于1979年，源自一位患有肝癌的7岁黑人男童。该细胞产生甲胎蛋白（alpha-fetoprotein)、乙肝表面抗原（BHsAg)、白蛋白、巨球蛋白、α-抗胰蛋白酶（alphal-antitrypsin)、转铁蛋白、补体（C3)、C3活性载体，纤维原等，具有广泛的研究价值。

二、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

三、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

四、应用

用于LI-cadherin对人肝癌细胞株Hep3B生长的影响及其机制研究：

应用siRNA干扰技术下调人肝细胞肝癌细胞株Hep3B中肝肠钙粘连蛋白（LI-cadherin,CDHl7）的表达,研究LI-cadherin对人肝癌细胞生长的影响,并初步探讨其机制。

方法：

1、按Lipofectamine脂质体转染法,将si RNA转染入Hep3B中,使用(G418液筛选稳定转染的Hep3B-LI-cadherin-SiRNA细胞株,并利用荧光倒置显微镜观察其转染效率。

2、用Western Bloting（蛋白质印迹）方法检测各组细胞中Ll-cadherin蛋白及细胞周期相关蛋白CyclinDl表达量变化情况。

3、用MTT（四唑盐比色法）法检测LIcadherin对肝癌细胞生长的作用并绘制细胞生长曲线；4运用Pl/Rnase染色-流式细胞分析法检测各组细胞周期分布；

结果：1利用倒置荧光显微镜观察,发现SiRNA转染组细胞中大部分可见明显的绿色荧光,证实已成功转染。并且通过计算得出视野内发出荧光的细胞占全部细胞的85%,即转染效率为85%,符合本实验的基本条件。