肾小管上皮细胞的培养与应用！

                    肾小管上皮细胞的培养与应用！

一、背景

肾小管上皮细胞是指肾小管的外面的一层细胞，是研究肾脏疾病的一项重要材料，该细胞分离方法有酶分离法、化学分离法筛网分离法、显微解剖分离法、流式细胞仪分离法、免疫分离法。

肾小管上皮细胞的主要作用是重新吸收。血液经过肾小球，在肾小球内滤出到肾小囊内的为原尿，里面含有水，葡萄糖，氨基酸，尿酸，尿素和电解质。但是在终尿中，并不含有氨基酸和葡萄糖，是因为原尿经过肾小管，被肾小管上皮细胞重新吸收，原尿中99%的水，全部的葡萄糖和氨基酸，部分电解质被重新吸收，尿素也被部分重新吸收，而肌酐则不被吸收。由此完成了一个重新吸收的作用。

二、肾小管上皮细胞的培养

1、取材：取肾小管上皮，切成0.5～1平方厘米小块。

2、EDTA处理：先置入0.02%EDTA中室温置5分钟。

3、冷消化：换入0.25%胰蛋白酶中，置4℃过夜。

4、分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。

5、温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25%胰蛋白酶中，37℃再消化30～60分钟。

6、用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。

7、培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20%小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2温箱培养。

三、应用

用于自噬对镉致大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响及其调控机制研究：

肾脏是镉毒性作用的靶器官,国内外学者从环境污染、职业性暴露和动物试验等多等方面对镉所致肾毒性机理进行了广泛、深入地研究;但这些研究多集中于凋亡机理的探究,而对镉所致肾脏毒性过程中自噬的机理、作用及其与凋亡关系的探究较少。

1、镉诱导大鼠肾脏皮质和肾小管上皮细胞发生自噬分为体外和体内两部分。体外试验采用机械筛网结合酶消化法建立原代大鼠肾小管上皮细胞（rPT cells）培养模型,在传一代细胞增殖活性最强时间进行镉染毒处理,同时选择NRK-52E细胞株进行同样处理。

2、CCK-8法测定不同浓度的镉在不同染毒时间对rPT细胞和NRK-52E细胞活性的影响;MDC荧光探针法检测不同浓度的镉在不同染毒时间对rPT细胞和NRK-52E细胞自噬水平的影响;2.5μ和5μM镉处理rPT细胞、5⒚M和10μM镉处理NRK-52E细胞6 h,免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62和Beclin-1表达水平变化。

结果表明,2.5μM和5μM镉处理rPT细胞、5μM和10μ镉处理NRK-52E细胞6h,细胞活性最强,自噬水平最高,极显著高于对照组（P<0.01）;2.5μM和5μM镉处理rPT细胞、5μM和10μM镉处理NRK-52E细胞12h,细胞自噬水平最低,极显著低于对照组（P<0.01）。

体内试验选择SD大鼠32只,随机分为4组:对照组（DDW）和镉组（CdAc2,50mg/kg·bw）,饲养1周;对照组（DDW）和镉组（CdAc2,50mg/kg·bw）,饲养8周。取肾脏皮质,RT-PCR法检测自噬相关基因LC3、p62和Beclin-1表达量变化;免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62和Beclin-1表达水平变化。

结果表明,镉染毒处理1周后,大鼠肾脏皮质自噬水平极显著高于对照组（P<0.01）;与对照组相比Beclin-1表达水平极显著升高（P<0.01）。