人成纤维肉瘤细胞的冻存与复苏方法及应用！

             人成纤维肉瘤细胞的冻存与复苏方法及应用！

一、背景

HT1080人成纤维肉瘤细胞来源于一位日本病人的手术切除的肿瘤组织。电镜下可以看到细胞间典型的桥粒和细胞质中大量的张力丝。1975年发现有支原体污染，而后被去除。该细胞整合有HPV16基因组，每个细胞中有1~2个拷贝。

二、细胞的冻存方法

1、细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。

2、计数：按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数，令细胞密度达5×106/ml，离心去上清，吸入离心管中。

3、冻存液：先用培养液9分＋DMSO 1分（或甘油）配成10％的DMSO冻存液，按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。

4、分装：分装入无菌安剖中，每安剖加1.5毫升细胞悬液。

5、封口：用塑料安剖时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安剖口后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安剖缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找。

三、细胞复苏的方法

1、从液氮罐中取出安剖；有时因安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。

2、迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。

3、剪开纱布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮。

4、低速离心（500～1000转/分）5分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心。

5、加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。

四、应用

用于Netrin4和Neogenin在成纤维肉瘤细胞HT1080中的作用及其机制探讨研究：

NTN4和NEO在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用,并进一步研究和探讨NEO是否介导NTN4的体外功能。HT1080是高转移性的人成纤维肉瘤细胞系,是研究肿瘤侵袭转移的理想模型。

首先通过RNAi技术分别建立NTN4和NEO基因敲低细胞系,研究在体外NTN4及NEO对HT1080细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。其次,体内实验采用斑马鱼肿瘤外植体模型研究HT1080-NTN4和HT1080-NEO敲低细胞系在生物体内转移能力。研究发现敲低NTN4基因的HT1080细胞增殖能力增强,迁移和侵袭能力降低,MMP-9表达量降低,MMP-2无明显变化。而敲低NEO基因的HT1080细胞增殖能力降低,迁移和侵袭能力增强,MMP-2和MMP-9表达量升高。

同样,体内转移结果与体外一致。然而在对NEO是否介导NTN4的体外功能的初步研究中,我们发现细胞中添加外源NTN4蛋白可抑制细胞增殖,促进细胞迁移和侵袭,但在敲低NEO后的细胞中再添加等浓度NTN4蛋白,这种抑制增殖和促进迁移和侵袭的作用表现的更为显著,且与只敲低NEO的细胞系相比也更明显。

这又说明,在体外NTN4确实有抑制HT1080细胞增殖和促进迁移侵袭的作用,且此作用可能受NEO的介导。此外,在对一些与肿瘤生长以及侵袭转移相关蛋白的检测中发现,HT1080细胞敲低NTN4后Vimentin和P-ERK1/2表达降低,P-p38表达增强；而敲低NEO后则导致Vimentin和P-ERK1/2表达增强,P-p38表达无显著变化。