血液基因组DNA提取试剂盒的应用！

                血液基因组DNA提取试剂盒的应用！

一、背景

血液基因组DNA提取试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取全血基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为新型材料，能够高效、专一吸附DNA，可zuida限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

二、使用方法

1、样本处理（1.5 ml EP管中处理）

抗凝全血：吸取200~500μl抗凝全血加入到800 ul红细胞裂解液中上下颠倒混合均匀，13000rpm离心30s，去上清，留细胞沉淀，用50μl水重悬细胞沉淀。

淋巴细胞分离液分离出的白细胞：直接吸取50μl白细胞。

有核红细胞抗凝全血（禽血）：吸取5μl抗凝全血加入到50μl无菌水中，漩涡震荡混合均匀。

2、向上述准备好的样品溶液中加入100μl gDNA LB1和20μl蛋白酶K漩涡混合均匀10s，56℃水浴锅中消化5min。

3、加入700μl gDNA BB2漩涡震荡混合均匀1min，13000rpm离心3min。

4、将上清液倒入到吸附柱中，13000rpm离心1min。

5、倒掉废液。向吸附柱中加入500μl Washing Buffer，13000rpm离心15s。重复此步骤一次。

6、将吸附柱重新放回离心机，13000rpm空离心2min，将残留的乙醇彻底甩干。

7、将吸附柱芯放入到1.5ml收集管中，向吸附柱芯中加入60~150μl DNA Elution Buffer（DNA Elution Buffer预热到65℃将提高洗脱产量），室温放置1min，13,000rpm离心1min，洗脱液即为基因组DNA，冷冻保存。

三、应用

用于非小细胞肺癌患者血液循环DNA含量及完整性的研究：

肿瘤患者血液中的游离DNA(cell free DNA,cfDNA)包括循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，主要来源于细胞的凋亡和坏死。血液循环中的癌细胞和远处转移的癌细胞同样释放cfDNA,可以通过检测cfDNA含量来估算肿瘤负荷、评价治疗效果。DNA的完整性(Integrity)有别于非肿瘤人群是肿瘤患者cfDNA的另一个显著特征。

目前定量常用PCR方法，diyi步需要提取血液循环DNA，这是一个极容易产生误差的步骤。即便不考虑操作者的因素，提取方法和试剂的不同就会造成巨大误差。目的研究一种方法，不经过DNA提取步骤,直接对血液中的循环DNA进行定量，可以去除DNA提取试剂盒和操作人员差异造成的DNA提取误差。方法通过提取和免提取cfDNA直接定量的两种方法来对比检测cfDNA，比较两者的扩增效率,精密度及准确度。

结果通过特殊的技术工艺处理，可以直接用血清进行定量PCR，不影响PCR反应,扩增效率与提纯DNA一致，可精确检测出低至ng水平的血清游离DNA，检测范围1-10000ng/ml，本方法具有较高的准确度及精密度。相比先用试剂盒提取cfDNA，在定量结果的稳定性、重复性等方面都有显著改善。

非小细胞肺癌患者cfdna含量及完整性的研究背景近年来，血液循环dna(cfdna)作为一种潜在的肿瘤标志物已经受到越来越多人的关注，因为它的检测创伤很小而且方便，所以比较容易被人们接受。cfdna的水平在健康人和良性疾病病人中较低，但是在非小细胞肺癌患者的血液中有非常明显的增加。癌症病人的循环肿瘤dna的完整性也是其重要特征之一。因此联合cfdna的含量和完整性可能是诊断癌症的一个很好的指标。

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