内皮细胞培养基的背景与应用！

                    内皮细胞培养基的背景与应用！

一、背景

内皮细胞培养基是专门为正常人类微血管内皮细胞体外培养设计的最适于其生长的完全培养基。是经灭菌的液体培养基，包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(5%)。该培养基缓冲体系为重碳酸盐，在含5%CO2的细胞培养箱中平衡后pH值为7.4。该培养基的配方能够选择性的促进正常人类微血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长，并为其达到最理想营养平衡状态。

内皮细胞是一薄层的上皮细胞，由一层扁平细胞所组成，呈多边形，细胞的边缘呈锯齿状，相互嵌合。内皮细胞也称血管内皮细胞，通常指衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮，它形成血管的内壁。它们具有吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，还参与机体免疫活动功能。

血管内皮细胞（EC）位于血浆与血管组织之间，它不仅能完成血浆和组织液的代谢交换，并且能合成和分泌多种生物活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力，调节血压以及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。抗凝血材料表面内皮细胞化，可以减少血栓的形成和血小板激活。

完整内皮细胞化是zuihao的抗凝血，表面血管内皮组织是天然的抗凝血组织。内皮细胞膜上有天然的抗凝血成分，比如肝素，前列腺素（PGI），一氧化氮等，内皮细胞能够合成和分泌多种内皮衍生舒张因子。

二、应用

用于角膜内皮细胞体外培养模型的建立：

通过对四个部分结果的综合分析得出角膜内皮细胞的体外培养模型。

1、剥离带后弹力层的兔角膜内皮片，用双酶消化法（胰蛋白酶和胶原酶）及组织片法对角膜内皮细胞进行分离培养，倒置显微镜下观察角膜内皮细胞生长情况，经观察分析得出的细胞数量多、污染少的较好分离方法，为后续阶段采用。

2、选取F99培养基、DMEM/F12培养基、KSFM培养基三种培养基分别对兔角膜内皮细胞进行原代及传代培养，倒置显微镜下观察角膜内皮细胞生长情况。经分析讨论得出细胞增殖快、细胞形态好的培养基，后续阶段沿用。

3、采用消化法、与3T3细胞共培养法、细胞克隆培养法对兔角膜内皮细胞进行培养，倒置显微镜下观察角膜内皮细胞生长情况，得出细胞传代快、传代较久的培养方法。

4、对人、猪、小鼠、兔角膜内皮细胞进行体外培养，并进行细胞形态学观察及免疫荧光鉴定，选出细胞形态维持好、传代时间长的一种角膜内皮细胞。

三、结果

1、经双酶消化法培养20天后，兔角膜内皮细胞呈多边形或多角星形，细胞形成单层，未见长梭形的兔角膜基质细胞。组织片法培养2周后可见及部分呈长梭型放射状生长的兔角膜基质细胞生长其中。

2、F99培养基中培养的原代兔角膜内皮细胞在第25天融合成单层，细胞呈多角形、细胞数量多，在三种培养基中细胞形态最规则，细胞数目最多，融合时间最快。第2次传代的第4天，F99培养基培养的兔角膜内皮细胞数最多，且形态规则。

3、消化法中经消化后细胞贴附快，细胞形态好，消化传代后，细胞培养4-5天即形成新的单层细胞，在传至第10代后仍维持较好的生长态势。而兔角膜内皮细胞与3T3细胞共培养后，第5天可见明显的兔角膜内皮细胞团，细胞呈密集的“鹅卵石”样形态。培养至第14天细胞团内细胞数明显减少，剩余的细胞呈细胞核体积增大、颜色加深的衰老迹象。克隆培养法中角膜内皮细胞在培养7天后形成克隆球，扩大培养2代后细胞体积变大，增殖缓慢。

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