纤维素酶的种类、发酵工艺及应用！

                   纤维素酶的种类、发酵工艺及应用！

纤维素酶cellulase 是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用，利用真菌纤维素酶成为提高畜禽生产性能和饲料利用率的重要措施之一。

细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木酶属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。

产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。

纤维素酶在食品行业和环境行业均有广泛应用。在进行酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对酒质有所提升。

由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等 纤维素酶种类繁多，来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

一、真菌纤维素酶的种类

自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶。由许多具有高协同作用的酶组成，习惯上，将纤维素酶分成三类： 内切葡聚糖酶(Cx )、外切葡聚糖酶(C1 )、β一葡萄糖苷酶(βG )。

1、C1-酶：这是对纤维素最初起作用的酶，它破坏纤维素链的结晶结构，起水化作用。即C1-酶是作用于不溶性纤维素表面，使结晶纤维素链开裂、长链纤维素分子末端部分游离，从而使纤维素链易于水化。

2、Cx-酶：这是作用于经C1-酶活化的纤维素、分解β-1，4键的纤维素酶。主要包括内切-1,4-β-葡聚糖酶和外切-1,4-β-葡聚糖酶。前者是从高分子聚合物内部任意位置切开β-1,4键，主要生成纤维二糖、纤维三糖等。后者作用于低分子多糖，从非还原性末端游离出葡萄糖。

3、β-葡萄糖苷酶：即为将纤维二糖、纤维三糖及其它低分子纤维糊精分解为葡萄糖。

上述三种纤维素酶在分解纤维素时，任何一种酶都不能裂解晶体纤维素，只有三种酶共同存在并协同作用时，才能完成水解过程。

二、纤维素酶菌种选育

菌种选育是纤维素酶生产的基础性工作，国内外许多专家进行了大量研究，为了生产高质量的纤维素酶产品，王家林等（1996）在吸收国内外经验的基础上，先后引进了绿色木霉木10、绿色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15、黑曲霉XX-15A，在此基础上，采用了紫外线、特定电磁波辐射、线性加速器，亚硝基胍等物理、化学的诱变方法，获得了高产菌株NT15-H、NT15-H1、XT-15H、XT-15H1。其中木霉NT-15H固体培养活力经轻工部食品质量监督检测中心南京站检测表明，滤纸活力为3670u/g, C1-酶活力24460u/g，Cx-酶活力1800u/g，已达到国际先进水平。此菌种在工厂化生产中性能稳定。张苓花等（1998）采用康氏木霉W-925，J-931，经过浓度为2%硫酸二乙酯和紫外线（15W、30cm、2min）复合诱变后，得到了产酶活性高的Wu-932菌种，该菌种CMC糖化力达到2975，滤纸糖酶活性为531，比出发菌W-925分别提高了81%。化工部饲料添加剂技术服务中心王成书等（1997）采用该中心的里氏木霉A3先进行紫外线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双层平板上，30℃培养5-8天，15℃放置7-10天，挑选透明圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再筛选，得到了产纤维素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。

纤维素酶菌种易退化，退化后其产酶力明显降低，其原因可能有三个方面：①经诱变筛选的菌种发生回复突变。②自然负突变。③菌种长时间低温斜面保藏，会在分生孢子上长出次生菌丝，而次生菌丝所形成的分生孢子生命力弱，这可能是菌种退化的主要原因。为了避免纤维素酶菌种退化，张苓花等（1998）报道，采用砂土管保藏菌种。即将过筛洗净的砂子与土以3：2比例混合分装在试管内，用1kg/cm2压力灭菌30分钟共三次，将欲保存的斜面菌种制备成1000ml孢子悬浮液，每个砂土管注入0.5ml，摇匀，放入盛有无水CaCl2真空干燥器内保存。经测定，在所测的121天内，酶的活性基本不变；酶活性下降50%的时间，由常规方法的60天延长至160天，明显地减缓了菌种退化速度。

三、发酵工艺

纤维素酶的生产工艺主要有两种，即固体发酵和液体发酵，其工艺如下(见下页)：

1、影响产酶量和活力的因素：影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。张中良等（1997）采用均匀设计Cl12(1210)，以绿色木霉（T.ViriclePers.expr）为菌种，研究了影响产纤维素酶的五大因素对产酶量和活力的作用，认为基质粗纤维含量为40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃条件下培养45h可获得zuida产酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g·h。王成华等（1997）也研究了其诱变筛选的里氏木霉91-3的产酶条件，结果表明该菌种以7：3的秸秆粉和麦麸，另添加4%硫酸铵、0.4%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁为zuijia培养基，28-32℃为适宜培养温度，30℃为zuijia温度，4%为zuijia接种量，96h到达发酵高峰。张苓花等（1998）研究了以康氏木霉W-925为出发菌，经诱变后得到的Wu-932纤维素酶高产菌的zuijia发酵条件。结果表明，以1：2的麦麸和稻草粉为培养基，5%的接种量，稻草粉碎平均长度3-5mm，初始pH4-5，温度在28-35℃，发酵时间72h为zuijia发酵条件。

2、污染菌的控制：在用康氏木霉发酵生产饲用纤维素酶中，普遍存在一种俗称的“白毛菌”污染。污染后轻者酶活性下降，重者发酵失败。为此，研究控制发酵污染意义很大。张苓花等（1998）研究“白毛菌”的菌落特征、来源、生长和生理特征及控制方法，找到了一种与康氏木霉Wu-932呈共生关系，而与“白毛菌”呈竞争性抑制关系的热带假丝酵母菌J-931。利用此菌进行混合发酵，可有效地控制“白毛菌”的污染。其微生态关系如下：

四、纤维素酶在畜禽生产中的应用

常见的畜禽饲料如谷物、豆类、麦类及加工副产品等都含有大量的纤维素。除了反刍动物借助瘤胃微生物可以利用一部分外，其它动物如猪、鸡等单胃动物则不能利用纤维素。国内外利用真菌纤维素酶成为提高畜禽生产性能和饲料利用率的重要措施之一。

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