大肠杆菌菌体蛋白质残留量的测定方法！

               大肠杆菌菌体蛋白质残留量的测定方法！

本法系采用酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统生产的重组制品中菌体蛋白质残留量。

⒈试剂

（1)包被液（P H9.6碳酸盐缓冲液） 称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0 .5 8 6 g ,置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。

(2 )磷酸盐缓冲液（p H 7 . 4 )称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至500ml, 121°C灭菌15分钟。

(3 )洗涤液（pH7.4) 量取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸盐缓冲液至500ml。

(4 )稀释液（p H 7 . 4 )称取牛血清白蛋白0.5g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(5 )浓稀释液称取牛血清白蛋白l.O g , 加洗涤液溶解并稀释至100ml。

(6 )底物缓冲液（pH 5 .0枸橼酸-磷酸盐缓冲液） 称取磷酸氢二钠（Na2HP04 . 12H20 )1 . 84g、枸橼酸 0. 51g，加水溶解并稀释至100ml。

(7 )底物液取邻苯二胺8mg、30%过氧化氢30^1，溶于底物缓冲液20ml中。临用时现配。

(8 )终止液lm o l/L硫酸溶液。

⒉标准品溶液的制备  

按菌体蛋白质标准品说明书加水复溶，精密量取适量，用稀释液稀释成每lm l中含菌体蛋白质500ng、250ng、125ng、62. 5ng、31. 25ng、15. 625ng, 7. 8125ng的溶液。

⒊供试品溶液的制备  

取供试品适量，用稀释液稀释成每l m l中约含2 5 0 ug 的溶液。如供试品每l m l中含量小于500ug时，用浓稀释液稀释1倍。

⒋测定法 

取兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体适量，用包被液溶解并稀释成每lm l中含10ug 的溶液，以100ul/ 孔加至9 6孔酶标板内，4 °C放置过夜（16~1 8小时）。用洗涤液洗板3次；用洗涤液制备1%牛血清白蛋白溶液，以200u1/孔加至酶标板内，37°C放置2 小时；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3 次；以100u1/孔加人标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入2 孔空白对照（稀释液），37°C放置2 小时；用稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体1000倍，以100u1/ 孔加至酶标板内，37°C放置1 小时，用洗涤液洗板1 0次，以l00ul/孔加人底物液，3 7 °C避光放置4 0 分钟，以5 0 p l /孔加入终止液终止反应。用酶标仪在波长4 9 2 n m 处测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。

以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白质含量，

⒌按以下公式计算：

供试品菌体蛋白质残留量（％) = (c×n)/（T×106）×100

式中 c为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng/ml;

     n为供试品稀释倍数；

     T为供试品蛋白质含量，mg/ml。

注：也可采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定。

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