对鲍曼不动杆菌耐药性及耐药基因的研究！

              对鲍曼不动杆菌耐药性及耐药基因的研究！

⒈目的：研究鲍曼不动杆菌耐药性与耐药基因之间的关系 

⒉方法：用VITEK-2型全自动微生物分析仪,检测331株鲍曼不动杆菌和42株重耐药菌的药敏情况,用PCR方法检测多重耐药菌的耐药基因。

⒊结果：鲍曼不动杆菌对21抗生素的平均耐药率分别59.8%和62.8%；对头孢曲松、头孢唑啉和头孢替坦的耐药率均为；42株多重耐药菌株（）对头孢曲松、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、头孢唑啉、头孢替坦和氨苄西林完全耐药,且均检测有TEM-1和ampC基因;38株多重耐药菌均检测到TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA型基因。

⒋结论：鲍曼不动杆菌已成为医院重要致病菌, 且多重耐药率很高，与携带的TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA型基因有关。

鲍曼不动杆菌已成为医院获得性肺炎的重要致病菌,且很容易在监护病房流行。由于鲍曼不动杆菌在自然界的广泛存在及其复杂的耐药机制,对β内酰胺类、氨基糖苷类以及喹诺酮类抗生素已呈现多重耐药，给临床治疗其所致感染带来很 困难。为能好地指导临床选择合适的抗生素，本文对本院2005～2006年住院患者标本分离的331株鲍曼不动杆菌进行药敏分析,并对2006年分离的42株多重耐药鲍曼不动杆菌的基因进行测序和研究,现报告如下。

一、材料与方法

⒈菌株来源  

331株鲍曼不动杆菌均为我院临床标本中分离并按全国统一操作规程。标本主要包括血液、尿液、痰和其他分泌物。

⒉仪器试剂  

VITEK-2型全自动微生物分析仪、ID-GN 鉴定卡、AST-GN09药敏卡由法国Bio-Merieux公司生产; VITEK 比浊计（V 1210） 由日本生产；PCR扩增仪为美国PERKIN ELMER公司9600型基因扩增仪；日本三洋MDF型超低温冰箱;德国Hettich公司22R型低温超速离心机;美国水套式恒温培养箱。

⒊菌种鉴定、药敏  

所有实验菌株分离纯化后按VITEK-2的使用要求配制成菌悬液和稀释液, 分别填充到ID-GN和AST-GN09卡中, 用VITEK-2仪器自动完成细菌的鉴定和药敏实验。

⒋质控菌株  

由卫生部临床检验中心提供的标准菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）, 药敏质控结果符合NCCLS 药敏质控要求。

⒌统计学处理  

细菌耐药性分析用 WHONET5软件进行分析，耐药率显著性差异用SPSS10.0统计软件分析,两组耐药率比较应用χ2检验。

⒍耐药基因的检测  

采用碱裂解法和蛋白酶K法提取被测细菌的质粒和染色体基因,提取方法根据不同引物设立不同PCR条件；以ATCC700603肺炎克雷伯菌和TEM-26型大肠埃希菌分别作SHV型和TEM型阳性对照；其余 ampC、PER-1、OXA-23基因阳性对照均为北京华明公司基因检测室经基因测序后比对的阳性菌株。

⒎PCR耐药菌基因  

根据GenBank提供的耐药基因，采用Primer软件设计引物。反应体系均为25μl,其中缓冲液2.5μl,10mmol/L 4×dNTP 0.5μl,50μmol/上下游引物各1μl,DNA多聚酶0.25μl,DNA模板1μl,超纯水18.75μl 。根据不同引物设立不同PCR反应条件。以ATCC700603肺炎克雷伯菌作SHV型阳性对照，以TEM-26型大肠埃希菌作TEM型阳性对照,产物经电泳,在紫外线下观察结果,并在凝胶上成像。

二、结果与分析

⒈鲍曼不动杆菌的临床分布  

本文鲍曼不动杆菌均来源于本院的住院病人，其中2006年160株,按标本分为血（6株）、痰（136株）、尿（6株）和其他分泌物12株；2005年171株, 按标本分为尿（5株）、痰（82株）和其他分泌物（89株）。

⒉鲍曼不动杆菌对常用5大类21种抗生素的药敏结果 

2006年和2005年鲍曼不动杆菌对21种抗生素的平均耐药率分别为62.8%和59.8%，经χ2检验，差异无显著性（P>0.05）。2006年鲍曼不动杆菌对头孢曲松、头孢唑啉和头孢替坦的耐药率均为；对头孢他啶、头孢吡肟、头孢呋辛钠和头孢呋辛酯的耐药率分别为57.7%、44.6%、98.0%和98.0%；对β内酰胺和碳青霉烯类如氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐药率分别为、48.3%、54.4%、17.7%和75.8%，对亚胺培南和美洛培南的耐药率分别为23.5%和38.3%。2005年鲍曼不动杆菌对头孢曲松和头孢替坦的耐药率均为；对头孢他啶、头孢吡肟、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯和头孢唑啉的耐药率分别为43.9%、37.2%、92.1%、92.1%和96.5%；对β内酰胺和碳青霉烯类如氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐药率分别为、49.5%、55.2%、15.2%和86.9%，对亚胺培南和美洛培南的耐药率分别为28.9%和34.9%。2006和2005年鲍曼不动杆菌对呋喃妥因的耐药率均为，对左旋氧氟沙星和环丙沙星的耐药率分别为8.4%、21.5%和75.4%、54.4%。

⒊多重耐药菌的药敏结果  

从2006年分离的42株多重耐药鲍曼不动杆菌对18种抗生素的药敏结果见表3。42株（）菌株对头孢曲松、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、头孢唑啉、头孢替坦和氨苄西林完全耐药,35株（83%）菌株对氨曲南耐药；25株（60%）菌株对亚胺培南敏感,23株（55%）菌株分别对哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素和美洛培南敏感,17株（40%）菌株对庆大霉素和哌拉西林敏感。

⒋耐药基因检测  

在42株多重耐药的鲍曼不动杆菌中,均检测有TEM-1和ampC基因,5株（12%）检测到ESBLs, 说明鲍曼不动杆菌对β- 内酰胺类抗生素有极高的耐药性;38株（90%）多重耐药菌均检测到TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA型基因;19株（45%）检测有TEM-1、PER型基因。所有菌株均未检出SHV、PER-1、VEB-1、IMP、VIM、OXA-23、OXA-24型基因。

⒌测序结果  

将PCR型阳性扩增产物做双向基因测序,并与GenBank 据库公布的相关基因序列进行比对分析, 所有与产超广谱酶的目标基因（Z21957）的PCR产物同源性为;将OXA -23型PCR扩增阳性的4份标本产物做单向测序,结果与OXA -23产碳青霉烯酶基因（AF201828）序列的同源性达到99%； 另8份Ampc酶PCR阳性产物作单向测序,结果与染色体介导的高产Ampc酶目标基因（AJ009979） 的同源性为;6份gyrA型基因扩增产物测序与目标基因（X82165）比对显示,在83位点的丝氨酸均被亮氨酸取代。

三、讨论

⒈本组鲍曼不动杆菌85%来自呼吸道标本，说明不动杆菌虽然是呼吸道的寄居菌，但在人体内成为优势菌时，也能引起呼吸道感染，而且可导致多脏器、多系统感染,尤其容易发生于危急重症病人。大量广谱抗生素的应用,使耐药的鲍曼不动杆菌得到优势生长,也成了鲍曼不动杆菌肺部感染的危险因素。

⒉本组鲍曼不动杆菌对常用5大类21种抗生素的平均耐药率为59.8%和62.8%，对头孢曲松等5 种头孢菌素和氨苄西林的耐药率几乎达，对亚胺培南和美洛培南也有23.5%和38.3%的耐药率，说明本组鲍曼不动杆菌产生了严重的多重耐药性。

⒊本组鲍曼不动杆菌对氨苄西林/舒巴坦加酶抑制剂的耐药率为48.3%和49.5%，明显低于氨苄西林的耐药率。对哌拉西林/他唑巴坦加酶抑制剂的耐药率仅为17.7%和15.2%，说明舒巴坦和他唑巴坦均能有效抑制β内酰胺酶。由于鲍曼不动杆菌对β内酰胺类抗生素的耐药主要是产生β- 内酰胺酶，而且不动杆菌极易经质粒结合,并与多种耐药质粒共存。可以是质粒介导的TEM - 1 和TEM - 2β-内酰胺酶,也可以由染色体介导的β- 内酰胺酶，或由于青霉素结合蛋白（PBPs） 的改变等原因导致耐药。所以本组鲍曼不动杆菌对氨苄西林加舒巴坦后的耐药率由降至48.3%，对哌拉西林加他唑巴坦后的耐药率由54.4%降至17.7%。因此在对鲍曼不动杆菌感染的治疗时,可选用加舒巴坦或他唑巴坦的β内酰胺类抗生素。不加酶抑制剂的抗生素已不适合临床应用，不能作为经验用药。

⒋鲍曼不动杆菌产生耐药的机制比较复杂,且多重耐药率很高，还能诱导革兰阴性杆菌产ESBLs 与高产AmpC 酶的作用。 在本组42株多重耐药的鲍曼不动杆菌中,均检测有TEM-1和ampC基因,5株（12%）检测到ESBLs, 说明鲍曼不动杆菌对β内酰胺类抗生素有极高的耐药性。尤其AmpC酶的普遍存和过量表达，表现出对β- 内酰胺酶极高的水解活性,可水解第三代头孢菌素。由于AmpC酶为非诱导酶,无论诱导剂是否存在,均可高产此水解酶。所以在抗感染治疗中，要严格禁止随意使用第三代头孢菌素，以防止或延缓各种高耐药株细菌的产生与蔓延。

⒌本组多重耐药的鲍曼不动杆菌均产生氨基苷乙酰转移酶［aac（3）-1 和aac（3）-2］,而普通株均不产该酶,说明aac（3）基因与鲍曼不动杆菌的多重耐药有密切关系。另外,由gyrA和gyrB分别编码的2 A或B亚单位是喹诺酮类药物靶位的DNA旋转酶,其主要功能是催化革兰阴性菌的DNA超级结构。是否耐药取决于DNA旋转酶的1个或2个基因点的突变, 本组多重耐药株在83位点上的丝氨酸（TCA）被亮氨酸（TTA）取代是喹诺酮类药物的耐药原因。

⒍本研究说明,鲍曼不动杆菌的多重耐药与同时产TEM型广谱酶,高产AmpC酶, aac（3）基因编码的氨基苷乙酰转移酶和gyrA基因编码的DNA旋转酶突变有密切关系。