小鼠肠微血管细胞试剂盒的应用！

                 小鼠肠微血管细胞试剂盒的应用！

一、背景

小鼠肠微血管细胞试剂盒适合于培养小鼠的肠微血管细胞。

本试剂盒包含：

（1）OptiTDSTM小鼠肠微血管细胞组织解离液

（2）小鼠肠微血管细胞组织处理缓冲液

（3）FibrOutTM小鼠肠微血管细胞成纤维抑制剂

（4）小鼠肠微血管组织洗液

（5）小鼠肠微血管细胞生长因子及血清

（6）小鼠肠微血管细胞基础培养基

（7）小鼠肠微血管组织预备液。

微血管是指心血管系统的微细血管，它们在显微镜下才能见到。微血管指通连小动脉和小静脉间的细小血管，分布于各种组织和器官中，分支通连成网，故也称终末血管床。小鼠肠微血管细胞可以保持原代细胞的分化状态，进而可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。虽然肠微血管组织机械韧性很强，但利用小鼠肠微血管细胞试剂盒中提供的肠微血管组织分离体系来分离，EDTA/EGTA处理过的肠微血管组织能使得肠微血管组织中微血管细胞的一些功能特性发生改变，从而将肠微血管细胞分离开来。

二、应用

用于巨噬细胞金属弹力酶基因转染CT-26细胞对小鼠原位结肠癌生长及微血管生成的影响

巨噬细胞金属弹力酶(mouse macrophage metalloelastase,MME)是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)家族成员之一,也称MMP-12。与其它MMP成员不同,MME可以分解纤溶酶原,产生具有抑制血管内皮细胞增殖作用的血管抑素(angiostatin),进而抑制体内肿瘤细胞的生长,在抗肿瘤血管生成中具有重要作用。方法PCR扩增编码MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体中,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切及PCR鉴定。再将构建的真核细胞表达载体pcDNA3.1-MME稳定转染小鼠CT-26结肠癌细胞。采用RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot方法,鉴定MME mRNA和重组蛋白在CT-26细胞中的表达。

采用体外分解Ⅰ型胶原蛋白和明胶酶谱方法,鉴定MME重组蛋白的酶活性。建立MME转染组及对照组小鼠原位结肠癌种植模型,观察MME对原发性结肠癌生长的影响,采用免疫组织化学、原位杂交及Western blot方法检测肿瘤组织中微血管密度(microvessel density,MVD)和VEGF的表达。结果以重组质粒pUC9-MME cDNA为模板进行PCR扩增,PCR产物经纯化后,在1%琼脂糖凝胶电泳中可见一条清晰的条带,位于750bp和1000bp之间,与预期的840bp目的基因片段长度相符。pGEM-T-MME用BamHI和XbaI双酶切,产生2个大小分别为3.0kb和832bp左右的条带,与预期结果基本一致。pGEM-T-MME核苷酸序列正向测序和反向测序结果表明,与小鼠MME cDNA序列的碱基符合率为99.63%。

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