两步法荧光定量RT-PCR试剂盒

两步法荧光定量RT-PCR试剂盒

Two-Step qRT-PCR Kit

本试剂盒是整合cDNA第一链合成试剂（RT试剂盒）和即用型qPCR试剂而得的qRT-PCR试剂盒。cDNA第一链合成反应和qPCR反应分别在两个离心管中进行。

试剂盒特点：
1．即开即用，足够50次RT反应（10μL体系）和50次qPCR反应（20μL体系）。
2．RT和PCR分开进行，方便优化RT和qPCR条件，也方便一个RT反应用于多个不同引物的qPCR扩增。
3．RT mix中含除酶、模板和引物以外的RT成分，简化了反应设置步骤。
4．qPCR mix是2×预配液，也简化了反应设置步骤。
5．qPCR mix含qPCR染料，无需另外加入相关荧光PCR染料。
6．扩增效率高, 最长可扩增5kbp以上的RNA。
7．提供定量PCR专用模板稀释液，保证在制作标准曲线时低浓度样品的准确性。

试剂盒组成：

保存条件：-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：样品RNA、PCR引物、ROX染料

使用方法：

一、样品RNA的制备（本试剂盒不提供相关试剂）
1．可用自本公司各种RNA 提取方法提取样品的RNA，也可以选用其他供应商的产品，但得到的RNA一定要溶解在 RNase-free的超纯水中。
2．如果需要用RNA制备标准曲线，则需在此步用定量PCR专用模板稀释液将RNA样品稀释不同梯度，并分别作为下步RT反应的模板。
3．由于污染的gDNA会严重影响RNA的定量，因必须彻底去除RNA样品中的gDNA污染。用户可以另购DNase(RNase-free)来消化RNA样品，也可以合成只识别外显子的引物。

二、RT（逆转录）反应合成cDNA
4．按下表配制RT反应体系(10μL体系），在每个管中加入下列成分：

5．42℃保温60分钟。此步为RT反应。
6．85℃保温5秒以终止反应，然后放置在冰上待用。
7．合成的cDNA可以直接作为下步 qPCR模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。如果需要用cDNA制备标准曲线，则需在此步用定量PCR专用模板稀释液将cDNA样品稀释不同梯度，并分别作为下步qPCR反应的模板。

三、qPCR（20μL体系）
8．在每个PCR管中加入下列成分：

注意：如果使用ABI公司的7500，7700和7900三种型号的荧光PCR仪器，则需用自备的ROX进行Ct值校正。对ABI7700和7900，ROX的最佳浓度为1×（即在每20μL反应体系中加2μL 10×ROX）。对ABI7500，ROX的最佳浓度为0.05-0.1×（每20μL反应体系加0.1-0.2μL 10×ROX；也可将10×ROX 稀释到1×，然后每个反应体系加入1-2μL 1×ROX）。ROX会在溶解曲线中产生噪音，因此，如果出现了杂峰，将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾，然后重新分析数据。
对于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000，RotorGene6000和LightCycler480等型号的荧光PCR仪器，ROX不是必须的，但加入的话也不会影响整个PCR分析。
9．PCR反应参数(需要用户根据模板和引物决定，下面参数的只做参考)：

10．实验结果分析：反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，制作标准曲线。具体方法随仪器不同而不同，请参考qPCR仪器手册。

浓度3 mM),Mn2+ (50X)

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！