iScience：CRISPR-Cas12a蛋白复合体切割双链DNA的动态调控机制

Cas12a蛋白（又称Cpf1）在哺乳动物的基因编辑中展现出了比Cas9蛋白更高的切割特异性。因此Cas12a切割双链DNA的分子机制受到了研究者的广泛关注。

来自华大学生命科学学院陈春来研究组发表了题为“crRNA和DNA的匹配度对Cas12a蛋白复合体切割双链DNA的动态结构和切割位点的调控”（Conformational dynamics and cleavage sites of Cas12a are modulated by complementarity between crRNA and DNA）的研究论文，利用单分子荧光共振能量转移技术（single-molecule FRET）直接观测Cas12a复合体切割过程中动态构象变化，建立了相应的定量动力学模型，并揭示了crRNA和DNA的匹配度对复合体动态结构和切割位点调节机制。

这一研究发现公布在8月6日Cell期刊新推出的子刊《iScience》上。文章的通讯作者为清华大学生命科学学院陈春来研究员，第一作者为张璐嘉。

在这项研究中，研究人员利用单分子荧光共振能量转移技术，通过标记在crRNA和DNA上的荧光FRET对，来直接观测LbCas12a复合体在切割双链DNA过程中的动态构象变化，最终构建的定量动力学模型如图。

首先，Cas12a/crRNA二元复合物识别靶标DNA序列，形成三元复合物，并在PAM序列近端开始形成R-loop（low FRET态）。随着R-loop的进一步延伸，Cas12a蛋白的核酸酶活性被激活，并且使得非互补链（NTS）从双链DNA结构解开，将切割位点暴露出来，以完成NTS链的切割（medium FRET态）。断裂的NTS链稳定了Cas12a复合体的互补链(TS)切割构象（high FRET态），以完成对TS链的切割。

通过以上模型，研究人员揭示了Cas12a切割双链DNA过程中的重要分子机制。

1）Cas12a结合和切割DNA过程中高度可逆的动态过程是导致其高特异性的重要因素之一；
2）非互补链（NTS）从双链DNA上解开以暴露其切割位点这一过程，晚于Cas12a核酸酶活性的激活过程，是切割中重要的校验步骤；
3）只有断裂的NTS链，才能稳定Cas12a复合体的互补链(TS)切割构象，从而确保了Cas12a利用单个结构域对两条DNA链有序的切割过程；
4）Cas12a复合体存在多个互补链(TS)切割构象，可切割产生不同长度的产物，而切割构象的相对稳定性受到crRNA和DNA的匹配度的调控。