免疫印迹是研究蛋白质功能和定位的常用技术。通常,蛋白质样品可在SDS-PAGE上分离并转印至硝酸纤维素膜(NC膜)或PVDF膜上,然后用特异性抗体进行检测。与可重复利用Southern和Northern印迹的核酸技术不同,免疫印迹很难重复使用。
免疫印迹的剥离和重新检测技术具有以下几个优点:
1.有利于昂贵或量少或珍稀样本的多次杂交;
2.有利于用不同抗体分析单次印迹上的不同蛋白,比如不同亚型的抗体;
3.有利于对异常结果进行重分析或确认;
4.有利于纠正孵错的抗体;
5节约试剂成本,并节约时间。
目前已经公布了几种用于从免疫印迹上剥离抗体的方案,包括低pH、加热和去垢剂以及离液剂等方法。以下是三种推荐方案。第一种方案适用于任何化学发光底物系统,即通过加热和去垢剂的组合来解离抗体。第二种常用于抗体必须与抗原分离的应用,即采用低pH值来改变抗体的结构,使结合位点失活。
第三种方案利用具有特殊配方的Western Blot Stripping Buffer(蛋白质印迹剥离缓冲液)从免疫印迹膜上剥离抗体。该方法的优势在于:
避免吸入与β-巯基乙醇有关的刺激性气味。
可在室温条件下处理。
可在15分钟内剥离抗体。
这些方法都不能去除显色检测系统所产生的有色沉淀(如BCIP、4CN、DAB和TMB)。但是,仍可以利用靶向不同目标蛋白的另一种抗体来分析印迹。
通常,这些方案仅能用于定性用途,除非已经确定剥离过程不会影响指定抗原的定量结果。许多抗原将经历至少5次剥离循环,具体取决于所用的方法和膜类型。但是,应该考虑到在每个剥离循环中,都将洗去少量的膜固定蛋白。如果需要连续检测几种抗原,建议从预期丰度较低或产生信号较少的抗原开始。
在设计具有一轮或多轮抗体剥离的免疫印迹实验时,可参考以下建议。
PVDF膜比硝酸纤维素膜更坚韧,因此推荐用于任何涉及抗体剥离的方案。
从SDS-PAGE凝胶转印完成后立即干燥PVDF膜,可改善蛋白质与膜的结合,特别推荐用于涉及多次剥离的实验。在第一轮免疫检测之前,必须使用乙醇将干燥的PVDF膜润湿。
优先检测低丰度抗原。
先使用亲和力低的抗体,再使用高亲和力抗体。
重要提示:尽管建议在转印后立即干燥PVDF印迹,但不可在两轮免疫检测之间干燥印迹,否则,任何残留的抗体分子将与膜永久结合。
方案1:通过加热和去污剂剥离
所需设备和溶液
标准印迹或印迹条,在硝酸纤维素或PVDF膜上。
封闭液。
剥离溶液:100 mM 2-巯基乙醇 (M301574)、2% (w/v) SDS (S108346)、62.5 mM Tris-HCl (T105291), pH 6.7。
磷酸盐缓冲盐(PBS):10 mM 磷酸钠、pH 7.2,0.9%(w/v)NaCl。
浅托盘,能容纳膜
阳性和阴性剥离对照。
操作流程
1.在通风橱内,将印迹放入剥离溶液中,50 °C摇动孵育30分钟。
2.将印迹放入缓冲液中,摇动10分钟。使用新鲜的缓冲液重复一次。
3.可选: 重复初始检测操作(省略一抗步骤),
4.以确保抗体已失活或从膜上剥离。
5.将印迹放入缓冲液中,摇动10分钟。
6.继续进行封闭步骤,进行下一轮的免疫检测。
方案2:通过低PH值剥离
所需设备和溶液
标准印迹或印迹条,在硝酸纤维素或PVDF膜上。
封闭液。
磷酸盐缓冲盐(PBS):10 mM 磷酸钠、pH 7.2,0.9%(w/v)NaCl。
浅托盘,能容纳膜
阳性和阴性剥离对照。
操作流程
1.将印迹放入剥离溶液中,摇动孵育30分钟。
2.将印迹放入缓冲液中,摇动10分钟。使用新鲜的缓冲液重复一次。
3.继续进行封闭步骤,进行下一轮的免疫检测。
方案3:利用WESTERN BLOT STRIPPING BUFFER(蛋白质印迹剥离缓冲液)
抗体剥离液对硝酸纤维素和PVDF膜均具有良好的剥离效果。但在待剥离膜具有较高信号或抗体剥离液体处理不充分时效果更好。
所需设备和溶液
标准印迹或印迹条,在硝酸纤维素或PVDF膜上。
封闭液。
保鲜膜,用于保存不会立即再次检测的印迹。
Western Blot Stripping Buffer(蛋白质印迹剥离缓冲液)
蒸馏水,用于稀释试剂。
浅托盘,能容纳膜
阳性和阴性剥离对照。
操作流程
注意:若要重复使用印迹或单个印迹条,应在第一次使用后立即剥离。如果不能立即剥离,应将膜包在保鲜膜中并置于PBS中,保存在4°C。切勿将印迹干燥保存。
1.在塑料托盘中加入适量的1X Antibody Stripping Solution(缓冲液套餐中提供)
2.用镊子将印迹或印迹条浸入剥离液中。在室温下,轻轻混合孵育15分钟。在一个干净的塑料托盘中装入相同量的封闭液。
3.可使用传统的封闭液,如20 mM Tris HCL、pH 8.0,150 mM NaCl,0.1% 吐温20,5%奶粉,或者类似溶液。
4.使用封闭液清洗印迹2次,每次5分钟。
5.现在,可使用抗体再次检测印迹。
参考文献
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