MDBK牛肾细胞

商品属性：

细胞详情：

MDBK牛肾细胞细胞别称：MDBK (NBL-1); NBL-1; Madin-Darby Bovine Kidney; Madin Darby Bovine Kidney

种属来源：牛

年龄性别：雄；成年

组织来源：肾；正常细胞

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

背景简介：MDBK(NBL-1)细胞是由S·H·Madin和N·B·Darby在1957年2月18日从一只表观正常的成年牛肾脏建立的。1973年，这株MDBK(NBL-1)细胞被牛病毒性痢疾病毒(BVDV)感染；1982年，发现了一株未被BVDV感染的MDBK(NBL-1)细胞株，此细胞最初来自ATCC1967年7月第96代的冻存管。MDBK(NBL-1)细胞的后代经NVSL检测，未发现被任何病毒污染的证据。1982年8月，R·A·Van Deusen将MDBK(NBL-1)提供给ATCC时，已传代至第110代；MDBK(NBL-1)细胞未被BVDV感染。

生物安全等级：2

细胞规格：1×106cells/T25培养瓶或者1mL冻存管包装

支原体检测：无

基因表达情况：keratin

保藏机构：ATCC; CCL-22 ATCC; CRL-6071DSMZ; ACC-174 ECACC; 90050801

培养基：RPMI-1640＋10% FBS＋1% P/S

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳；温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

细胞系操作步骤：

(1) 细胞系培养：取6cm细胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃ CO2培养密度至40%~60%，密度过大，转染后不利筛选细胞。

(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)

A液：用不含血清培养基稀释1ug 质粒DNA。

B液：用不含血清培养基稀释2ul脂质体。

分别将A液与B液轻弹混匀，静置5分钟。

(3) 吸取B液加入至A液中，轻弹混匀。室温中置10-15分钟。

(4) 转染准备：用1mL不含血清培养液漂洗两次，再加入4mL不含血清培养液。

(5) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

(6) 瞬时转染后，可在48h-72h细胞长满之后，提取细胞蛋白或者RNA，验证敲减/过表达效率。

细胞处理：

1） 冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。 

3. 轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

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