逆转录是指以 RNA 为模板,合成与其互补的 cDNA 的过程。逆转录 PCR 是将 RNA 的逆转录(reverse transcription)和 cDNA 的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术,故逆转录称为 RT-PCR 或反转录 PCR。逆转录 PCR 实验原理为:提取组织或细胞中的总 RNA,以 RNA 为模板,首先在利用逆转录酶反转录成 cDNA,再以 cDNA 链为模板进行 PCR 扩增,从而获得大量拷贝。逆转录 PCR 的出现使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能。
一、模板:
逆转录 PCR 的模板是 RNA,可以是总 RNA、mRNA 或体外转录的 RNA 产物。无论使用何种 RNA,都需确保 RNA 中无 RNA 酶和基因组 DNA 的污染。
二、RNA 提取:
可以利用试剂盒从细胞(或组织)中提取得到 RNA。模板 RNA 的纯度和完整性对于扩增的结果有很大影响,从细胞中分离 RNA 应注意尽量减少 RNA 酶的污染(RNA 酶分布广泛,除细胞内源性 RNA 酶外环境中也存在大量 RNA 酶),在提取 RNA 时,应尽量创造一个无 RNA 酶的环境:避免 RNA 酶污染包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性,主要是采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性 RNA 酶,通过 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂抑制内源性 RNA 酶。
三、引物
用于反转录的引物有随机引物、通用引物(Oligo-dT)及基因特异性引物三种,下表为三种引物的介绍:
引物最好选择 Oligo-dT 或基因特异性引物,随机引物会从 RNA 的多个位点(包括核糖体 RNA)开始转录,特异性低。Oligo-dT 引物同大多数真核细胞 mRNA3'端的 poly(A)尾杂交,与使用随机引物相比特异性高。但是 Oligo-dT 引物对 RNA 样品的质量要求较高,对于从福尔马林固定的组织中提取的劣质 RNA 不适合用 Oligo-dT 引物。
四、逆转录酶
逆转录酶是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 实验中的逆转录酶需要具有以下三种活性
1. 依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性:以 RNA 为模板合成 cDNA 的第一条链;
2. Rnase 水解活性:水解 Rnase 杂合体中的 RNA;
3. 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性:以一条 DNA 链为模板合成互补的双链 DNA
在选择逆转录酶时,建议选择无 RNaseH①活性(RNaseH-)的逆转录酶。具有 RNaseH 活性的逆转录酶的 RNaseH 活性会与聚合酶活性竞争 RNA 模板与 DNA 引物(或 cDNA 延伸链)形成的杂合链,并降解杂合链中的 RNA 链。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作为合成 cDNA 的有效底物,降低了 cDNA 合成的产量与长度。
逆转录 PCR 应用:
逆转录 PCR 的用途广泛,可用于分析基因的转录产物、检测细胞中 RNA 病毒的含量、合成 cDNA 探针、直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。如在临床上 RT-PCR 可以用于遗传病诊断、癌症检测、检测病人标本中的 RNA 病毒,如 HAV、HCR、HIV 等。在植物方面 RT-PCR 常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响,以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。使用 RT-PCR 检测分析 RNA 转录产物具有以下突出的优点:
1、 理论上可以检测几乎任何基因的转录产物;
2、可以实现极为微量 RNA 样品(ng 级别)的检测;
3、样品耐受性好,未经纯化的粗制生物样品也可以用于检测;
实验流程:
从细胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆转录酶、引物、dNTPs 的反应体系中→退火,引物与 RNA 链配对→延伸,逆转录酶合成互补 cDNA 链变性→常规 PCR 反应流程(变性、退火、延伸,如此多次循环)。
RT-PCR“两步法"与“一步法":
RT-PCR 的实验操作分为“一步法"与“两步法"两种。一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需构建 cDNA 文库(即 cDNA 合成与 PCR 反应在同一 Buffer 及酶中进行,一步法完成),省略了 cDNA 与 PCR 之间的过程。两步法 RT-PCR 首先用反转录酶合成 cDNA,然后以 cDNA 为模板进行 PCR,即 RNA 反转录与 PCR 扩增分两步进行。一步法 RT-PCR 与两步法相比快速、简便、减少了污染机会、减少了 RNA 二级结构、减少了 PCR 反应的错配率。RT-PCR 两步法的优势在于存在中间产物 cDNA,便于保存;且第二步 PCR 只取逆转录反应产物的 1/10 进行反应,有利于 PCR 条件的调整,实验重现性强;两步法可以在第二步 PCR 反应体系中加入特异性引物,其灵敏度比一步法高;两步法的实验预算要低于一步法。但是由于两步法包括第一链 cDNA 合成和随后的 PCR 反应,容易产生污染问题。
实验操作注意事项:
1、RNA 提取一定要迅速,样本要新鲜,组织尽量在液氮中研磨;
2、 RNA 提取完马上进行逆转录不要拖延,新提的 RNA 很容易降解;
3、逆转录反应过程,需建立无 RNAase 环境,以避免模板 RNA 降解;
注:
RNase 是 RNA 水解酶的统称,包含 RNase A,RNase H 等,RNase A 可以水解单双链 RNA,RNase H 主要水解 RNA 与 DNA 杂交双链中的 RNA。
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