悬浮细胞培养中的死细胞去除方法

　　悬浮细胞在炎症、免疫、凋亡、肿瘤研究等领域应用广泛，例如在血液粒细胞的研究中，THP-1细胞就是一个非常经典的细胞模型，在细胞免疫治疗方向，NK92细胞更是发挥了必不可少的作用，还有HL-60、K562、U937、U266等都是我们在实验室比较常见的悬浮细胞。
　　
　　悬浮细胞种死亡细胞形成原因：
　　
　　1. 在悬浮细胞的培养过程中，根据整体细胞生长分裂的状况可以将整个细胞培养周期分为四个时期：潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期。进入对数生长期的时候是细胞分裂最旺盛的时候，细胞活性也是最高，随着分裂次数的增加，细胞代谢产物增加，细胞密度增大，到了对数生长期后期有一小部分细胞会出现凋亡的迹象。
　　
　　2. 进入稳定期后细胞密度达到最大，如果这个时候不及时补充营养更换新鲜培养基的话凋亡的细胞就会越来越多，即死细胞越来越多。如果死细胞太多的话会影响降低整体细胞活性，同时也会抑制影响正常细胞的生长代谢。如果涉及药筛实验等，死细胞比例更会大幅增加。
　　
　　悬浮细胞去死细胞的方法：
　　
　　1.磁珠标记
　　
　　MACS(magnetic-activated cell sorting),原理就是用结合了磁珠的抗体去标记细胞，让目的细胞带上磁珠，也可以正向选择死细胞，通过磁场将结合了磁珠与没结合磁珠的细胞分离开来。MACS是细胞分选的重要手段，优点是细胞活性好，缺点就是能分选的细胞类型有限，且成本较高。
　　
　　2.流式分选
　　
　　FACS（fluorescence-activated cell sorting），也就是流式分选，与流式分析一致。利用荧光素标记不同的分子，通过调节合适的电压、补偿等，通过荧光将目的细胞与非目的细胞区分开来。
　　
　　3.活细胞短暂贴壁法
　　
　　可以用一种叫Con.A（刀豆球蛋白）来包被培养皿或培养瓶，悬浮细胞中的活细胞可短暂贴壁，此时弃去上清，一段时间后，细胞又可以重新悬浮。市面上有一些经过特殊处理的养贴壁细胞的培养瓶也可达到这种效果，但是建议使用之前根据所养的悬浮细胞生长状况测试一下分离效果。
　　
　　4.沉降法
　　
　　部分悬浮细胞如NK92成团生长，成团的细胞状态较好，单个细胞基本没有增殖能力，根据这一特性，便可以将细胞悬液收集在离心管中，注意动作要轻柔，不要将细胞团吹散，将离心管直立，观察离心管底出现“白雾”层时，可小心将上清去除，来收获状态良好的细胞团。
　　
　　5.低速离心法
　　
　　一般来说，悬浮细胞中的死细胞及细胞碎片的密度相对较低，此时，可以通过低速（500-800rpm）来去除一些上清中的死细胞，每次传代或换液进行此操作，使活细胞有生长优势，可以慢慢提高活细胞比例。