人可溶性Endoglin(ENG/sCD105)ELISA试剂盒操作步骤

试验原理： ENG/sCD105试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知ENG/sCD105浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将ENG/sCD105和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中ENG/sCD105的活性浓度呈比例关系。 试剂盒内容及其配制 试剂盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置 配制 96/48份酶标板 1块板（96T） 半块板（48T） 即用型 塑料膜板盖 1块 半块 即用型 标准品：400ng/ml 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按说明书进行稀稀 空白对照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即用型 标准品稀释缓冲液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型 生物素标记的ENG/sCD105抗体 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用型 亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml） 即用型 洗涤缓冲液 1瓶（20ml） 1瓶（10ml） 按说明书进行稀释 底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型 底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型 终止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型 自备材料 1．蒸馏水。 2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。 3．振荡器及磁力搅拌器等。 安全性 1．避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。 2．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。 3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。 人可溶性Endoglin(ENG/sCD105)ELISA试剂盒操作注意事项 1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。 2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。 3．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。 5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。 6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。 7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。 8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。 9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。 人可溶性Endoglin(ENG/sCD105)ELISA试剂盒样品收集、处理及保存方法 1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2、血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。 3、细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4、保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。 试剂的准备 1．标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行： 400ng/ml （6号标准品） 原倍浓度不用稀释直接加入50ul。 200ng/ml （5号标准品） 100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液 100ng/ml （4号标准品） 100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液 50ng/ml （3号标准品） 100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液 25ng/ml （2号标准品） 100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液 12.5ng/ml （1号标准品） 100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液 0ng/ml （空白对照） 原始浓度不用稀释直接加入50ul。 2．洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。 人可溶性Endoglin(ENG/sCD105)ELISA试剂盒操作步骤 1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。 2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。 3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。 4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 5．每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。 6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。 8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。 9．在450nm波长处测定各孔的OD值。 性能 1.灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。 2.特异性：不与人其它细胞因子反应。 3.重复性：板内、板间变异系数均小于10%。 4.局限性：6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。 结果判断与分析 1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值 2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的ENG/sCD105标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的ENG/sCD105含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。 3、检测值范围：0-400ng/ml 4、敏感度：1.0ng/ml