【细胞培养】细胞爬片制备方法

细胞爬片是一种将细胞培养在玻璃或塑料表面上，使其附着并扩展的技术。这种技术可以用于观察细胞形态、细胞运动、细胞-细胞相互作用等。我们在做免疫荧光（IF），激光共聚焦(Confocal)，凋亡检测（TUNEL）时，免不了要制备细胞爬片，爬片质量完全决定了最后拍照的质量以及实验数据的精准性。今天，远慕生物就教大家如何制备好的细胞爬片。

爬片的准备

1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用细胞爬片（价格比较昂贵）但是细胞贴壁牢固，拍出照片效果好；

2.可根据自己的需要，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色剪裁成合适大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；

细胞爬片（以常用24孔板为例）

1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作，玻片是无菌处理的，可以酒精灯外火焰附近做。

3.根据自己的需要，选择合适的细胞密度（细胞太密影响拍照效果），将计数分好的细胞混匀后铺到孔中，种入24孔板一个孔内即可。

4.待细胞贴壁后，可去上清加处理组培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，小编会将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等不同时间点实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

爬片细胞的固定处理，以下为常用的固定液：

1.冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。

将纯丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10min。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。

2.多聚甲醛(常用4%)：避光保存，可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 室温固定15-30min后，将表面液体吹干， -20℃保存

3.95％乙醇，可用于免疫组化。

优点：穿透性强、抗原性保存较好。

缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，孵育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。室温固定15min后，将表面液体吹干，入-20℃保存

4.甲醛

优点：形态结构保存好，且穿透性强，

缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

我们将以多聚甲醛为例，讲讲24孔板内，细胞爬片固定步骤：

1.准备多聚甲醛（PFA）： 4℃冰箱保存。

2.将细胞从37℃培养箱取出，用预温的PBS洗3遍，每次加入1ml PBS，轻轻晃动，避免将细胞冲掉。

3.注意爬片的细胞面向上，每孔用4℃的多聚甲醛500ul即可，室温固定30-40min，避光。

4.固定后，用PBS洗三次。

5.0.2-0.5%Triton X-100透化10-20min，覆盖细胞即可。

6.PBS洗三次。

7.如果是做免疫荧光后续用3%的BSA，用PBS配置，封闭1h。

8.封闭后，用PBS洗三遍，按比例加入一抗，4℃过夜，若转入荧光标签的质粒，要避光。

9.过夜后，用预温的PBS洗细胞，动作轻缓，可多洗一会儿，可以用慢摇床摇。

10.加入用3%BSA稀释的二抗，室温孵育1h，避光。

11.孵育结束后，避光用PBS洗3次，动作轻缓，可以多洗一会儿。

12.1ug/mL DAPI ，室温避光，染细胞核DNA 20min。

13.PBS洗三次。

细胞爬片封片

1.将载玻片洗好在干净无尘纸上晾干 。

2.将PBS中的细胞取出，注意细胞面朝下，载玻片上滴入亮甲油，或者防防猝灭封片剂，盖在载玻片上（市面上可以买到封片防猝灭剂）。细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后做固定。根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡TUNEL染色时就避免洗，凋亡细胞在洗的过程中可能会脱落。

3.保存细胞爬片时，一般用培养皿或避光湿盒，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆。一般-20℃保存2-3月的片子去拍照没有问题的。