2023/03/29 10:28
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产品配置单:
牛血清白蛋白(全组分)
型号: 20mg
产地:
品牌: 远慕
¥1
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抗A抗B血型定型试剂(单克隆抗体)/抗A抗B 血清
型号: 电询
产地:
品牌: 远慕
¥298
参考报价
HighFive昆虫细胞(保成活)
型号: 1支
产地:
品牌: 远慕
¥3300
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方案详情:
细胞周期分析是分子生物学常用的实验方法,尤其在抗肿瘤药物研究上使用普遍。但细节若是处理不好,做得再多也做不出正确的、好看的分布图。今天远慕生物来测下如何准确制备细胞周期测试的样品,科研实验的小伙伴们一起来了解下!
先简单介绍下实验原理
碘化丙啶(PI)是一种核酸染料,可以与 DNA 和 RNA 结合,但其不能透过正常的细胞膜,所以对活细胞无染色作用。可通过冷乙醇或其他破膜剂的作用,使细胞膜通透性增加。PI 进入细胞内后,选择性地与核酸结合,RNase 裂解 RNA 后,细胞内染料的荧光量与细胞核内的 DNA 含量成正比。通过流式细胞仪检测单个细胞荧光强度得到相对 DNA 含量,根据各个时相 DNA 含量不同,将细胞分为不同的周期。
具体操作流程及注意事项
1、将对数期的细胞接种于 6 孔板中(2×105 个 / 孔,根据细胞大小、增值速度适当调整),每孔加 2 ml 培养基培养。
2、细胞贴壁后(根据细胞具体情况),去除培养基,分别加入培养基配置的不同浓度药物 1 ml 孵育(不使用造成细胞大量死亡的药物浓度和孵育时间)。
3、药物作用结束后,收集培养液,1500 rpm,离心 4 min。一定要一并收集漂浮的死细胞,不然会严重影响结果。
4、消化收取贴壁细胞,吹打过程一应要轻柔充分,避免细胞受损、细胞黏连;离心转速为 2000 rpm,离心 4 min(离心转速不要超过 2000 rpm,也可以采用 1000 rpm,离心 5 min),PBS 洗 3 遍,以去除培养基、药物残留及细胞碎片。合并培养液和贴壁细胞。
5、细胞沉淀中加入少量 PBS,轻柔充分重悬细胞。然后将重悬的细胞加入到 4℃预冷的 70%冰乙醇中固定,轻轻吹打均匀(切记!!!不要将冰乙醇加入到细胞中,这样会造成细胞黏连,严重影响结果),封口膜封口,4℃过夜。
6、2000 rpm 离心 4 min,吸去固定液,PBS 洗两次,以去除固定液。
7、细胞中加入含 PI(50 μg/ml)、RNaseA(50 μg/ml,去除 RNA)和曲拉通(1%,通透细胞膜)的工作液 200 μl(曲拉通粘性大,配置时一定要涡旋,保证混合均匀),室温避光孵育 30 min。按照步骤 1 中的铺板细胞数,这个体积的工作液可以保证测试时的细胞浓度正合适。
8、流式细胞仪检测细胞周期。染色后,可以使用 PBS 去除染液,也可选择不处理,亲测没有影响。
9、FlowJo 软件分析细胞周期时相分布。
实验人注意!注意!!注意!!!
整个过程一定要尽量降低操作对细胞的损伤,要吹打轻柔,减少离心次数,转速不要超过 2000 rpm。
消化细胞时要保证细胞吹散,不要有细胞黏连,一旦这一步骤没有消化充分,后面很难再将细胞吹散,后果严重。
测试时细胞浓度一定要根据流式细胞仪的检测范围,不然可能会影响准确度。
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