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植物体内游离脯氨酸含量的测定
2020/01/14 17:09
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方案摘要：
产品配置单：
人羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)ELISA试剂盒
型号： 96T/48T
产地：
品牌： 远慕
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人羟脯氨酸(Hyp)ELISA试剂盒
型号： 96T/48T
产地：
品牌： 远慕
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人N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)ELISA试剂盒
型号： 96T/48T
产地：
品牌： 远慕
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大鼠羟脯氨酸(Hyp)ELISA试剂盒
型号： 96T/48T
产地：
品牌： 远慕
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大鼠N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)ELISA试剂盒
型号： 96T/48T
产地：
品牌： 远慕
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方案详情：
实验原理:
植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。
脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的 疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止 渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。 因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用， 而且即使在含 水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下， 植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定 程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。
实验试剂:
3%磺基水杨酸水溶液
甲苯
2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3日有效
脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液
实验设备
分光光度计
水浴锅
漏斗
20ml大试管数支
20ml具塞刻度试管9支
5～10ml注射器或滴管
实验材料:小麦叶片
实验步骤:
1．标准曲线制作
表1 各试管中试剂加入量
管 号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
标准脯氨酸量(ml) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.2 | 1.6 | 2 |
H2O(ml) | 2 | 1.8 | 1.6 | 1.2 | 0.8 | 0.4 | 0 |
冰乙酸(ml) | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
显色液(ml) | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
脯氨酸含量(μg) | 0 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
（1）取7支具塞刻度试管按表38-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。
（2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。
（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。
2．样品测定
（1）脯氨酸提取 取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。
（2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min，下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。
（3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。
脯氨酸（μg/g FW或DW）= (C*(V/a)) / W式中 C—提取液中脯氨酸浓度（μg），由标准曲线求得； V—提取液总体积（ml）； a—测定时所吸取的体积（ml）； W—样品重（g）。
注意事项
质膜相对透性的测定虽简单，但干扰因素多，测定时应注意以下问题：
1. 取材的一致性，代表性；
2. 器皿和用具要清洁；
3. 测试条件要一致，如测试温度等要一致；
4. 注意不同材料其适宜的浸泡时间均不相同。
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