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亚硫酸氢盐修饰后测序法检测甲基化
2019/10/18 16:20
阅读：189
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方案摘要：
产品配置单：
亚硫酸氢钠7631-90-5
型号： 克
产地：
品牌： 远慕
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乙二醛亚硫酸氢钠化合物外水合物332360-05-1报价
型号： 50g
产地：
品牌： 远慕
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亚硫酸氢钠溶液(10%)
型号： 500ml
产地：
品牌： 远慕
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亚硫酸氢钠溶液(0.5%)
型号： 100ml
产地：
品牌： 远慕
¥1
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方案详情：
实验目的: 亚硫酸氢盐修饰后测序法主要可用来检测甲基化。
实验原理: 重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，用PCR扩增（引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响）所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最hou对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点的甲基化状态。
实验材料 :DNA
试剂、试剂盒
NaOH
苯二酚（氢醌）
亚硫酸氢钠
石蜡油
仪器、耗材
离心管
恒温水浴锅
铝箔纸
实验步骤
1.将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2.加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3. 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4.10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5. 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
6.EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7.加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8.50℃避光水浴16h。
注意事项
避免化学品或外源DNA的污染。
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