血基因组DNA提取实验

血基因组DNA提取可用于：（1）从冻全血、血浆、血清、骨髓、其他体液、淋巴细胞、培养细胞、病毒和线粒体中提取DNA；（2）用于后续测序、遗传信息学等研究。

实验方式: 采用特殊的细胞裂解和蛋白去除液（包括蛋白酶K 裂解）从抗凝全血中得到基因组DNA。

实验材料: 抗凝全血

试剂试剂盒: 血基因组DNA 试剂盒

仪器耗材: 96孔深孔板   96圆孔板   96孔DNA制备板  96圆孔硅胶片 BF-400膜

实验步骤:     

一、试剂盒组成、贮存、稳定性

1.  说明书，耗材：96孔深孔板（1.6 ml），96圆孔板，96孔DNA制备板，96圆孔硅胶片，BF-400膜。

2.  Proteinase K：冻干的蛋白酶K 可室温贮存6 个月，长时间保存请置于4℃；溶解后，在2-8℃可贮存2 个月，长时间保存请勿置于室温中。

3.  Buffer PK ：蛋白酶K 溶解液，室温密闭贮存。

4.  Buffer BL ：细胞裂解液，室温密闭贮存。

5.  Buffer W1B concentrate ：洗涤液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用百分百乙醇或95%乙醇。

6.  Buffer W2 concentrate ：去盐液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用百分百乙醇或95%乙醇。

7.  10xBuffer W2（12x96 试剂盒）：用于配制Buffer W2 。

8.  Eluent B：7.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，0.3 mM EDTA ，室温密闭贮存。

二、实验准备

1.  第一次使用时，在Buffer W2 concentrate 和Buffer W1B concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。

2.  Buffer W2（12x96 试剂盒）配制：在提供的500 ml 空瓶中加入15 ml 10xBuffer W2，135 ml 去离子水和350 ml 乙醇，可用100%无水乙醇或95%乙醇。

3. 根据瓶上标签将蛋白酶K 溶解于Buffer PK 中，请勿旋涡振荡。

4. 准备70℃温浴。

5. 使用前检查Buffer BL 是否有沉淀析出，若出现沉淀，请于70℃温浴加热至沉淀完全溶解后再使用。

三、操作步骤

1.  向96 圆孔板的每孔中加入20 ul 蛋白酶K。

2.  加200 ul 抗凝全血到96 圆孔板中。

* 若全血样品体积少于200 ul，用PBS 补充到200 ul。

* 若样品为鸟类血，样品用量须低于10 ul。

* 若需得到RNA-free 的基因组DNA，在步骤3 加入Buffer BL 前加入DNase-free 的RNase A(20 mg/ ml) 。

3.  加200 ul Buffer BL ，注意不要打湿每孔的边缘，用96 圆孔硅胶片密封各孔。

4.  用力混合30 s。

5. 3000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机，当速度达到3000rpm后即停止。

6. 在培养箱或烘箱中70℃温浴至少10 min。

7.  3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机，当速度达到3 000rpm后即停止。

8. 取下96 圆孔硅胶片，每孔加入200 ul 乙醇（96-100%）。

9.  用96 圆孔硅胶片密封各孔，用力混匀混合15 s。3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到圆孔板内。启动离心机，当速度达到3 000 rpm 后即停止。

10.  将96 孔DNA 板放到一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板。取下圆孔板上的96 圆孔硅胶片，将每孔中的溶液转移至96 孔DNA 板 中，6 000 rpm 离心4 min。

11.  丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液，将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入500 ul Buffer W1B，用一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 离心4 min。

* 确认在Buffer W1B concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

12.  丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液，将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入850 ul Buffer W2，用另一新 的BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm 离心4 min。

* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

13.  弃滤液，将96孔DNA板放回到96孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入400 ul Buffer W2， 用另一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 离心4 min。

14.  将96孔DNA板放在一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上，用BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm离心15 min。

15.  将96孔DNA板放在另一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入100-200 ul Eluent B 或去离子水，室温静置2 min，用另一新的BF-400膜密封96 孔DNA板，6 000 rpm 离心4min洗脱得到DNA。