凝胶迁移实验（EMSA）

实验材料: DNA样品

试剂\试剂盒:

[γ-32P]ATP

T4多聚核苷酸激酶

Nuclease-Free Water

T4多聚核苷酸激酶缓冲液

醋酸铵

TE

无水乙醇

TBE buffer

重蒸水

甲叉双丙烯酰胺

丙烯酰胺

甘油

过硫酸铵

TEMED（四甲基乙二胺）

EMSA Gel-Shift结合缓冲液

溴酚蓝

仪器耗材:

水浴锅

PCR仪

离心机

电泳仪

电泳槽

实验步骤:

一、探针的标记

1.   如下设置探针标记的反应体系：

（1）待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。

（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升

（3）Nuclease-Free Water ：5微升。

（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。

（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。

（6）总体积 10微升

（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。

2.   使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。

3.   加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。

4.   再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

5.  标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。

二、 探针的纯化

通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：

1.  对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。

2.   在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。

3.  在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。

4.   在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

5.   加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。

三、EMSA 胶的配制

1.   准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最hao选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。

2.   按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。

（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。重蒸水 16.2毫升。

（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。

（3）80% 甘油： 625微升。

（4）10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150微升。

（5）TEMED ：10微升

3.  按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

四、EMSA结合反应

1.   如下设置EMSA结合反应

阴性对照反应：

(1）Nuclease-Free Water ：7微升。

（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。

（4）标记好的探针 ：1微升。

（5）总体积 ：10微升。

样品反应：

（1）Nuclease-Free Water ：5微升。

（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。

（4）标记好的探针： 1微升。

（5）总体积： 10微升。

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