水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验

目的

学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。

原理

水平式琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测，其分辨效果比分光光度计法与溴化乙啶-标准浓度DNA比较法更高，更直接，检测DNA范围更广，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DAN发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，则可精确地测得样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA ，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。

在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。在抽提质粒的过程中，由于各种因素的影响，使得超螺旋共价闭环结构的DNA（SC）的一条链断裂，变成开环（OS）分子，如果两条链发生断裂，就变成线形分子（L）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋迁移速度最快，其次为线形分子，最慢的为开环分子。

当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA，在琼脂糖电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可以分析样品的纯度。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。

试剂与器材

一、试剂

1、 DNA样品

2、 TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍

3、 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油

4、 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。

5、 琼脂糖

二、器材

1、 电泳仪系统

2、 紫外灯

3、 恒温水浴箱

操作步骤

1． 选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。

2． 选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为0.5~1.0mm。

3． 制备琼脂糖凝胶：按照被分离的DAN分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下可参考下表：

称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约40ml 凝胶液，置微波炉中或水浴加

热，至琼脂糖融化均匀。

4． 将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，在一端插好梳子。待凝胶溶液冷却至60℃

左右时，在凝胶溶液中加EB（EB最终浓度为0.5 μg/ml），摇匀，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TBE缓冲液），然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。

注意：电极缓冲液要高出凝胶面2-5㎜。

5． 待测的DNA样品中，加入1/5体积的点样缓冲液，混匀后小心的进行点样，记录样

品点样顺序和点样量。

6． 开启电源开关，最gao电压不超过5V/cm。

7． 电泳时间看实验的具体要求而异，在电泳中途可用紫外灯直接观察，DNA各条区带

分开后电泳结束。一般20min—3 h，取电泳凝胶块直接拍照。