实验室酶联免疫技术的质量控制

　　实验室酶联免疫技术的质量控制：
　　1. 测定模式的影响
　　ELISA测定模式包括：双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM抗体捕捉法、竞争抑制法，其中竞争抑制法因受操作时差所引起的不公平竞争等因素的影响，结果重复性较差，质量较难控制。

　　2. ELISA试剂的准备
　　不同批次的试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，即使是通过批批检的项目其检测结果也存在差异，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件。
　　严格执行这一标准可以避免因试剂批号改变而重新建立质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性；对于效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，每次使用则取分装部分即可，避免反复冻融造成试剂的失效。
　　试剂使用前必须平衡至室温，否则会影响检测下限。未用完的室内质控品及本次不需使用的试剂应密封并及时放回冰箱保存。

　　3. 操作因素对ELISA结果的影响
　　目前各种形式的ELISA自动分析仪已经进入市场，如广泛应用于血站系统的微板式全自动酶免分析仪，其试剂为开放式的，而对于其它类型的仪器，则试剂和仪器往往是配套的。但当前大部分医学实验室均采用手工操作加仪器测定的方式。ELISA操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。
　　ELISA测定一般遵循以下步骤：固相包被→加样品→温育→洗涤→加酶结合物→温育→洗涤→加底物→温育→显色→终止显色→比色

　　4. 灰区的设置
　　通常情况下，ELISA定性实验以“阳性”和“阴性”来报告结果，两者间有一条分界线被称为“阳性判断值”(CO值)，这是定性免疫测定结果报告的依据。由于ELISA CO值的设置不能区分所有正常和异常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA检测具有以下几个特点：检测变异大(18%～65%)；不同试剂盒CO值存在差异；病毒感染存在窗口期；病毒变异后表达产物含量低以及个体差异等，因此在CO值附近存在一个临床意义可疑的的区域被称之为“灰区”，在国内的传染性病原体抗原和抗体检测的ELISA试剂盒中均未涉及“灰区”的设置，但仅仅依靠CO值来决定感染的有无，尤其是对献血员的筛查具有较大的风险。因此对于检测结果位于“灰区”的病人可采用确认实验或追踪检测的办法加以确诊。
　　目前“灰区”的设置有二种方式：一是CO×(1±CV)， CV为该试剂的批内CV (一般在15-20%)；二是CO±2s，s为实验室做室内质控ROC(常规条件下的变异)的标准差。

　　5. 标本复查
　　ELISA手工检测过程复杂，影响因素较多，即使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成结果的差异，因此加大复查力度是保证结果准确性的可靠方法。
　　复查方式主要有：
　　① 采用同一种试剂复查，理由是市售试剂均通过国家食品药品监督管理局（SFDA）认可，严格按照其说明书操作，检测结果具有法律效应，若使用不同的试剂（非确证试验）复查，当结果不相符合时，则zui终结果难以判断（免疫检测缺乏“金标准”）。
　　② 采用国外进口试剂进行复查，其理由是尽管进口试剂并不是“金标准”，但实验室已经对此高度重视，并且使用了质量较好，价格较贵的试剂，但该法对于小医院而言则很难实施。

　　6. 结果判断和报告
　　① 定性测定
　　阳性判定值法：一般为阴性对照的平均A值加一个常数，试剂制备、检测过程必须严格标准化，要先计算出阳性对照A值平均数和阴性对照A值平均数。
　　② 半定量测定：结果一般以滴度表示。将标本连续稀释后，进行ELISA检测，在阳性临界值以上的zui高稀释度即为该标本的“滴度”。
　　③ 定量测定：即用已知量的标准品作一系列稀释后进行ELISA测定，绘制标准曲线，结果以绝对量或单位表示。在ELISA定量检测中每一块反应板都必须绘制相应的标准曲线。
　　④ 结果报告：传统的ELISA结果只报告“阳性”或者“阴性”，但不能解决“灰区”的问题，因此引入“可疑”的报告方式是比较合理和科学的，同时对结果做必要的说明，如“结果已经复查，建议定期复查或定量检测”；对于HBeAb、HBcAb检测，由于各试剂盒CO值差异及变异系数大等因素，结果缺乏可比性，位于CO值附近的标本复查结果阴阳性只是概率事件，另外HBcAb存在原倍和1：30检测模式及定量检测模式，报告结果的不一致对于临床实验室来说是不可回避，也是目前医疗纠纷主要集中点和“结果互认”的zui大障碍，因此在减小室内变异的同时必须引入阳性和弱阳性的报告方式。

　　7. 原始记录
　　ELISA检测结果变异大，不同体系难以溯源，因结果不一致而引起的医疗纠纷逐日增多，因此ELISA检测的原始存根必须完整而全面地保存，包括布局，原始吸光度值，检测的阴阳结果，检测者，试剂厂家，批号，质控品来源及批号等。严禁人为修改检测结果。

　　8. 室内质量控制
　　① 室内质控品：稳定以及合适的浓度是运用一切质控规则的前提。可选择S/CO值减去精密度测定中得到的三倍批间CV%与该S/CO值的乘积仍大于1的质控血清作监测重复性的室内质控品用。 计算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD。同时选择S/CO处于1.5左右的质控血清以判断每次测定时试剂盒测定下限的有效性。
　　② “即刻性”质控：一些实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELSIA部分试剂盒效期短，用同一批号试剂盒连续常规测20次，难度较大。采用"即刻法"质控统计方法，只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。
　　A. 先将测定值从小到大排列，X1zui小，Xnzui大；
　　B. 计算X和s；
　　C. 计算SI上限值和下限值。SI上=（Xzui小-X）/S，SI下=（Xzui大-X）/S；
　　D. 对照SI表，检查是否出控。SI上、下限≤规定值，在控； SI上或下限>规定值，失控。
　　③ Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法 Levey-Jennings质控图以及Westgard多规则质控方法zui早应用于生化检测的质量控制，在ELISA检测中仍为探索阶段，一般认为：
　　A. 一 次超出3SD；
　　B. 连续二次超出2SD；
　　C. 3～5次连续处于一侧的2SD之内；
　　D. 5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。目前多采用一次超过2SD作为“告警”，一次超出3SD为“失控”。

　　9. 总结
　　酶联免疫试剂盒测定方法是以抗原抗体间的特异反应为基础的，其与生化的化学反应有着本质的区别，酶联免疫测定技术从低敏捷的免疫沉淀和免疫凝集反应进入到了高敏捷的放射免疫、酶免疫、荧光免疫和发光免疫测定时代，可见酶联免疫测定更多的是用于生物活性物质的微量测定。