植物细胞组织培养外植体的灭菌

外植体灭菌是植物细胞组织培养重要的工作之一。接种用的材料表面，常常附有多种多样的微生物，这些微生物一旦带进培养基，就会迅速滋生，使实验前功尽弃。因此，材料在接种前必须进行灭菌。灭菌时，既要将材料上附着的微生物杀死，同时又不能伤及材料。因此，灭菌采用何种药剂，什么浓度，处理多长时间，均应根据材料对药剂的敏感情况来确定。

与灭菌相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫作无菌操作。一般来说，外植体接种的过程都是在无菌的环境里进行的，因此，外植体接种前都必须彻底灭菌。

用于植物外植体灭菌的灭菌剂有升gong、甲醛、过氧化氢、高锰-酸钾、来苏儿、漂bai粉、次氯-酸钠、抗生素、酒精等。使用这些灭菌剂，都能起到表面杀菌的作用。现将主要灭菌剂常用浓度和灭菌效果列出，其中70％～75％的酒精有较强的杀菌力、穿透力和湿润作用，可排出材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入，常与其他消毒剂配合使用。酒精穿透力强，易损伤材料，所以一般处理时间要短。

上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化gong可短期内贮用。次氯-酸钠和次氯-酸钙都是利用分解产生氯-气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升gong是用重金属汞离子来灭菌的；过氧化氢是分解释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水漂洗3～4次即可；由于用升gong液灭菌的材料，难以对升gong残毒有效去除，所以应当用无菌水漂洗8～10次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。

灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入灭菌溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在快到时间之前1～2min，开始把灭菌液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较灭菌效果，以便改正。灭菌液要充分浸没-材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。

在灭菌溶液中加吐温80效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭两的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的0．5％，即在100mL加入15滴。

最后一步是用无菌水漂洗，漂洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，漂洗3～l0次。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

外植体的灭菌工作应在接种室或接种箱内无菌的条件下进行，各种不同类型的材料灭菌方法如下，

(1)花药的灭菌用于组织培养的花药，按小孢子发育时期要求，实际上大多没有成熟，花药外而有萼片、花瓣或颖片、稃片保护着，通常处于无菌状态。所以一般只对整个花蕾或幼穗进行体表灭菌即可。如茄(solanumrnelongennaL)的花药，灭菌时先去掉花蕾的萼片，用70％酒精擦洗花瓣，然后将整个花蕾浸泡在饱和漂bai粉上清液中10min，再经无菌水清洗2～3次，即可接种。这一灭菌程序，也适用于其他植物花药的灭菌。

(2)果实和种子的灭菌根据果实和种子清洁程度，用自来水冲洗10～20min甚至更长时间，然后进行消毒。

荚果的灭菌；绿色荚果可以采用火焰杀菌法。将绿色荚果稍加洗涤，转入95％酒精中，然后取出荚果放入灭菌的培养皿中，点燃灼烧，并不断翻转荚果，待表面酒精燃尽，即可获得无菌荚果。再在无菌条件下取出幼胚或种子用于接种。火焰灭菌具有简便、快速、经济、彻底之优点。该程序也适用于块根类外植体的灭菌。

种子灭菌：通常首先用热水浸种，然后再用次氯-酸钠或氧化gong等杀菌剂灭菌。热水浸种除具有增加种皮透性、打破种子的休眠、促进种子萌发的作用外，高水温也有一定的杀菌作用。浸种的水温和时间与种子的大小、干燥程度以及种皮厚度有关。

具体步骤是用自来水冲洗10～20min，再用75％酒精消毒1～2min，再用2％次氯-酸钠溶液浸泡5min，后用无菌水冲洗3～5次，就可以去除种子的病菌，进行组织培养。

果内种子则先要用10％次氯-酸钙浸泡20～30min，甚至几小时，依种皮硬度而定。对难以消毒的还可以用0．1%升gong或1％～2%溴水消毒5min。对用胚或胚乳培养的种子，如种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4％～8％的次氯-酸钠溶液浸泡8～l0min，经过无菌水冲洗后。在无菌条件下取出外植体即可用于接种，这类外植体一般都不带污染微生物。

(3)茎尖、茎段及叶片的灭菌灭菌方法与花药的灭菌方法相同。对于茎叶，因为暴露在空中，且生有毛或刺等附属物，所以灭菌前应该用自来水冲洗干净，用吸水纸将水吸干，再用70％酒精漂洗一下。然后，根据材料的老、嫩和枝条的坚硬程度，用2％～10％次氯-酸钠溶液浸泡6～15min，用无菌水冲洗3次，用无菌纸吸干后进行接种。

(4)根和贮藏器官的灭菌这类材料大多埋于土中，材料上常有损伤及带有泥土。灭菌比较困难。灭菌前，要用自来水清洗，并用毛刷或毛笔轻轻刷洗掉污物，必要时用刀片切去损伤和污染严重部分，吸于多余水分后用70％酒精漂洗一下，再用0．1％～0．2％的氯化gong灭菌5～10min，或用6％～8％次氯-酸钠溶液浸5～15min，接着用无菌水清洗及用无菌纸吸干，然后进行接种。