维生素测定原理及注意事项

维生素是维持机体不可缺少的一类营养，虽然需要量小，但十分重要，一旦缺乏，会引发相应的维生素缺乏疾病。婴幼儿食品和乳品中含有天然的维生素，有的也有人工添加。在食品外包装上，会要求印有该食品含有哪些营养素及其含量多少（1）。我国的国家食品安全标准中，对婴幼儿食品和乳品中的维生素含量也有规定，如每100千卡的食品中的叶酸含量至少为10.5μg，多不超过50.2μg（2）。之所以限定维生素的高量，是因为维生素摄入过多，也会引发一些问题。

那么，如何来测定这些维生素的含量呢？根据国家出台的标准，不少维生素含量是采用色谱的方法来测定。有五种维生素是采用微生物法。它们是叶酸、维生素b12、烟酸、泛酸和生物素。本文重点讲述前两种。以叶酸为例，微生物法的原理是，根据细菌对叶酸的营养需求，在一系列不含叶酸的培养基中从低到高添加已知含量的叶酸以及待测的食品样品，在37°C孵育18小时。因为有了叶酸，细菌能生长得很好，培养液发生浑浊。细菌越多，培养基就越浑浊，吸光度就越高。通过已知含量的叶酸样品的吸光度，以及待测样品的吸光度，就能确定待测样品中的叶酸含量。

测定所用的菌株均有规定。叶酸为鼠李糖乳杆菌，又称作干酪乳杆菌鼠李糖亚种（ATCC 7469）（3），维生素b12为莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC 7830）（4），均可从ATCC等菌种库购买。维生素测定所用的培养基可以自己配，也可以购买商品化的培养基，其来源得是经过国际认证的微生物培养基生产厂家，如HiMedia Laboratories公司，这样质量较为可靠，其培养基组成也符合食品中叶酸和维生素B12测定的食品安全国家标准。

在测定中有两个非常重要的注意事项：一是由于灭菌条件，孵育温度等因素会影响标准曲线读数，并且每次该不会完全一样，因此每次测定时都应同时制备标准曲线。二、应小心避免培养基和玻璃器具遭受污染。杂菌生长会导致实验失败。同时应使用洁净的无去污剂的玻璃器具。因为任何少量的外源物质都可能导致测定结果的偏离。

   测定前还需要进行菌株的培养和接种菌液的制备。接种菌液来自于储备菌种。但保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2-3代以保证细菌活力。所用培养基也都有商品化的可选。

   总之，微生物法测定微生物B12和叶酸等维生素灵敏度高，但也需要注意避免测定中可能产生的一些问题，这样才能把实验做好。

注释：

（1）GB 13432—2013 《食品安全国家标准 预包装特殊膳食用食品标签》

（2）GB10765—2010《食品安全国家标准 婴儿配方食品》

（3）GB 5009 211-2014《食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》

（4）GB 5413 14-2010《食品安全国家标准_婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》