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质粒DNA的提取与纯化的实验原理以及操作步骤
一、实验目的与原理
质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
提取质粒的基本步骤分为三步：
①细菌的培养和质粒的扩增
②细菌菌体的裂解
③质粒DNA的纯化
本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。
二、材料与试剂
1、材料：大肠杆菌
2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪
3、试剂：
Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)
10 mM EDTA(pH8.0)
50 mM葡萄糖
高压灭菌，4℃保存
Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用
Solution III 5 N KAc pH4.8
高压灭菌，4℃保存
3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂
三、操作步骤
1、细菌繁殖
LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜
2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液
3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃
加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min
4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min
5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min
6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃
7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min
8、离心10 min，12000 rpm, 4℃
9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中
10、加入40 ul，3 M NaAc
11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀
12、离心10 min，12000 rpm, 4℃
13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
14、电泳检测提取DNA的质量
四、结果与分析
超螺旋结构DNA
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