上海远慕解析:蛋白质纯化胶体过滤法
上海远慕生物科技有限公司主要经营的产品有:elisa试剂盒,生物试剂,标准品,血清,抗体,培养基。细胞。欢迎各位前来咨询。
不同大小的蛋白质分子进入胶体过滤管柱,可依其分子量差异分离;是一种广泛应用的partition色析法(Pharmacia操作手册,GelFiltration)。
仪器设备:色析管柱(PharmaciaCcolumn,1.6×100cm)、铁架、铁夹及水平仪;部分收集器(fractioncollector,需准备干净试管约100支);浓缩用离心机(低速5,000rpm);浓缩用离心管Centriprep-30(Amicon4322)请注意其使用方法
药品试剂:胶体SephacrylS-300(Pharmacia):a.预先以缓冲液bufferA-150平衡好,并且使完全沈降后的胶体体积,占全部体积的七至八成;要先预估好胶体的使用量。b.胶体温度要与操作场所的温度一致,否则温度变化会产生气泡。c.Sephacryl系列胶体有相当大的吸附力,因此要在缓冲液加入0.15M以上的NaCl以除去非专一性吸附。BufferA-150:注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合(Bio-Rad151-1901):溶于1mL后每组取0.4mL.含有thyroglobulin(670kD),bovinegammaglobulin(158kD),chickenovalbumin(44kD),equinemyoglobin(17kD),vitaminB12(1,350)
方法步骤:
管柱装填:
1)以纯水冲洗玻璃管柱(以纯水上下冲洗即可,严禁使用试管刷);并请了解管柱的构造与拆装方法,垂直架好管柱,以软管连接部分收集器,并以bufferA-150试看管路是否通畅;可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管,则可控制溶离的进行。注意系统的摆设要适当,不要装置于交通要冲。
2)依预估量取出Sephacryl胶体,注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡;将瓶中的胶体上下震荡,使的完全悬浮,但勿产生太多气泡。
3)在管柱内加入约10cm高缓冲液,然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱,一直加到管柱顶端,开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时,可于顶端添加胶体,以达所要高度;胶体高度约90cm.
4)胶体完全沈降后,小心以bufferA-150加满管柱,关闭出口,装上顶端端盖并连通缓冲液瓶,打开出口以重力流洗。调整缓冲液瓶高度,使流速约每五~六秒一滴,并设定收集体积为2.5mL/tube.
5)胶柱流洗约100mL后,关闭出口,拆开顶端端盖,先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1cm高,注意勿破坏胶体表面平整;然后打开出口,使液面下降至胶体面,再关闭出口,准备注入样本。
样本色析进行:
6)以微量移液器或滴管吸取样本(样本体积不得超过胶体总体积的3%),沿着胶体上方管壁缓慢加入,注意切勿破坏胶体的平整表面!(样本确实体积_______mL)
7)打开出口,同时开启部分收集器;当样本完全没入胶体时,关闭出口,缓缓加入与样本相等体积的bufferA-150,打开出口待其慢慢进入胶体中,如此重复二次。不得扰动胶体表面,造成凹陷。
8)暂时关闭出口,将液面高度加满至管柱顶端,并把顶端端盖锁上;然后打开出口开始溶离,调整缓冲液瓶的高度,使流速为6s一滴。
9)要留心观察前面几个分划,确定整个系统运转无碍,小心部分收集器最容易出问题。管柱预计将流洗过夜,收集约80管。
10)收集试管,进行蛋白质定量分析以及GUS活性测定,并请作图。
11)收集GUS活性区,以Centriprep-30浓缩至10mL后,加bufferA-0稀释至20mL,再次浓缩至_______mL(GF),保留100μL.
12)管柱请再以bufferA-150流洗100mL后,小心放置一旁,准备以后进行分子量测定。
分子量测定:
13)进行分子量测定前一天,请先以bufferA-150流洗100mL,并检查胶柱内有无气泡产生,若有严重的气泡或干裂,必须重新装填管柱。
14)取标准分子量溶液0.4mL,加上纯质目标酶0.5mL(以亲和层析法所得的AF部份),如上法注入管柱中,立刻开始进行胶体过滤,并收集各分划。请依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。
15)收集所得,进行蛋白质定量分析,可定出数个蛋白质尖峰,以作为分子量依据;另以目测法,决定红色高峰的管数,则可定出vitaminB12的溶离管数。利用以上数据,可画出分子量与溶离管数间的直线关系,作为分子量判定的标准校正线。
16)同样的一批分划,请进行酶活性分析(GUS),则可定出酶的溶离体积,对照上述标准校正线,则可求出酶的分子量。
拆除管柱及保存胶体:
17)若管柱长期不用,应当自管柱中取出胶体,以缓冲液清洗后,置冷藏室中保存,但绝对不要放在冷冻箱中。胶体若装填太紧,有时可能不易取出,要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来。
18)胶体可以加0.01%NaN3防止霉菌生长,但使用前记得要洗去;再度使用时,请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒,若有结块而不易打散者,也不要使用。
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