免疫碱性磷酸酶组织化学技术是以碱性磷酸酶(AKP或AP)取代HRP来显示结果的免疫酶组织化学技术。最早出现的是间接免疫碱性磷酸酶法(1AP),1983年Mason及Moir等建立了碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)复合物法。随后,人们建立了更为敏感的生物素—亲和素—碱性磷酸酶复合物(ABC-AP)法、S-P碱性磷酸酶法、EnVision碱性磷酸酶法以及用于原位杂交检测的抗地高辛(Dig)、抗生物素(biotin)和抗荧光素(FITC)—AKP检测系统。因免疫碱性磷酸酶技术具有独特优点,如敏感的酶底物显色系统、染色背景低,故应用日益广泛,尤其在原位杂交、TUNEL等的检测。
一、间接免疫碱性磷酸酶法
此方法的基本原理与HRP-抗体间接法类似,体,将其制备成酶标记抗体。其染色步骤如下。
(1)切片脱蜡至水,PBS洗3min×3次。所不同的是用AKP代替HRP标记第
(2)蛋白酶消化或AR(组织抗原的暴露或抗原的修复,此步视情况而定)。
(3)滴加正常血清,阻断20min(减少非特异性背景染色),吸去多余血清。
(4)滴加适当稀释的特异性一抗,37℃孵育30~60min或4℃过夜,PBS洗3min×3次。
(5)适当稀释的AKP标记的二抗37℃孵育30~60min,PBS洗3min×3次。
(6)加入0.02mol/L(pH9.0)TBS(内含lmmol/L左旋咪唑,5mmol/L MgClz)阻
断内源性碱性磷酸酶。
(7)切片上滴加50—100~1底物溶液(BCIP/NBT),室温中湿盒内避光显色30min一48h,显色30min后镜下观察,待阳性充分显示后水洗终止反应。
(8)充分水洗后用核固红复染5min,冲洗后系列乙醇脱水,二甲苯透明,树胶封片。
(9)结果观察,背景呈红色,阳性产物呈紫蓝色。
注:染色结果可根据不同的显色底物而显示不同颜色,如用坚固红(FR/AS-MX)产生的底物为玫瑰红色,用坚固蓝(FB/AS-MX)则产物为紫绿色,而BCIP/NBT为紫蓝色。特别要强调的是,FR/AS-MX和FB/AS-MX底物系统产生的颜色反应产物,能溶于有剂溶,如乙醇、二甲苯,所以不能用树胶封片。
二、APAAP法
APAAP法的原理与PAP法类似(见图4—12),都属于未标记抗体桥联法,所不同的是用AKP取代了HRP。该方法较IAP法敏感性高,特别是用于标记固定过的组织,其染色步骤如下。
(1)~(4)步同IAP法。
(5)适当稀释桥抗体(二抗),37~C温育30min或室温中孵育60min。
(6)PBS洗3minX 3次。
(7)适当稀释APAAP复合物(与特异性一抗同属),37℃温育30min或室温中孵育60min。
(8)PBS洗3minx 3次。
(9)底物显色及复染、封片同IAP法。
注:特异性一抗和APAAP复合物中IgG必须来源于同一种属动物,第一抗体的稀释度要较IAP法高(浓度低)。
APAAP法的主要优点是非特异性背景染色较浅,因为其不受内源性过氧化物酶的干扰,PAAP复合物所用的AKP是从小牛肠组织中提取,只存在于肠组织。同时,反应底物溶液的左旋咪唑具有抑制非肠源性碱性磷酸酶活性的作用,且不影响APAAP复合物中肠源性KP的活性。因此,在检测那些富含内源性过氧化物酶的组织、冰冻切片及造血组织标本时,PAAP法是一种很好的方法。
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