免疫碱性磷酸酶组织化学技术

免疫碱性磷酸酶组织化学技术是以碱性磷酸酶（AKP或AP）取代HRP来显示结果的免疫酶组织化学技术。最早出现的是间接免疫碱性磷酸酶法（1AP），1983年Mason及Moir等建立了碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP）复合物法。随后，人们建立了更为敏感的生物素—亲和素—碱性磷酸酶复合物（ABC-AP）法、S-P碱性磷酸酶法、EnVision碱性磷酸酶法以及用于原位杂交检测的抗地高辛（Dig）、抗生物素（biotin）和抗荧光素（FITC）—AKP检测系统。因免疫碱性磷酸酶技术具有独特优点，如敏感的酶底物显色系统、染色背景低，故应用日益广泛，尤其在原位杂交、TUNEL等的检测。

一、间接免疫碱性磷酸酶法
此方法的基本原理与HRP-抗体间接法类似，体，将其制备成酶标记抗体。其染色步骤如下。
（1）切片脱蜡至水，PBS洗3min×3次。所不同的是用AKP代替HRP标记第
（2）蛋白酶消化或AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。
（3）滴加正常血清，阻断20min（减少非特异性背景染色），吸去多余血清。
（4）滴加适当稀释的特异性一抗，37℃孵育30～60min或4℃过夜，PBS洗3min×3次。
（5）适当稀释的AKP标记的二抗37℃孵育30～60min，PBS洗3min×3次。
（6）加入0．02mol／L（pH9．0）TBS（内含lmmol／L左旋咪唑，5mmol／L MgClz）阻
断内源性碱性磷酸酶。
（7）切片上滴加50—100~1底物溶液（BCIP／NBT），室温中湿盒内避光显色30min一48h，显色30min后镜下观察，待阳性充分显示后水洗终止反应。
（8）充分水洗后用核固红复染5min，冲洗后系列乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。
（9）结果观察，背景呈红色，阳性产物呈紫蓝色。
注：染色结果可根据不同的显色底物而显示不同颜色，如用坚固红（FR／AS-MX）产生的底物为玫瑰红色，用坚固蓝（FB／AS-MX）则产物为紫绿色，而BCIP／NBT为紫蓝色。特别要强调的是，FR／AS-MX和FB／AS-MX底物系统产生的颜色反应产物，能溶于有剂溶，如乙醇、二甲苯，所以不能用树胶封片。

二、APAAP法
APAAP法的原理与PAP法类似（见图4—12），都属于未标记抗体桥联法，所不同的是用AKP取代了HRP。该方法较IAP法敏感性高，特别是用于标记固定过的组织，其染色步骤如下。
（1）～（4）步同IAP法。
（5）适当稀释桥抗体（二抗），37~C温育30min或室温中孵育60min。
（6）PBS洗3minX 3次。
（7）适当稀释APAAP复合物（与特异性一抗同属），37℃温育30min或室温中孵育60min。
（8）PBS洗3minx 3次。
（9）底物显色及复染、封片同IAP法。
注：特异性一抗和APAAP复合物中IgG必须来源于同一种属动物，第一抗体的稀释度要较IAP法高（浓度低）。
APAAP法的主要优点是非特异性背景染色较浅，因为其不受内源性过氧化物酶的干扰，PAAP复合物所用的AKP是从小牛肠组织中提取，只存在于肠组织。同时，反应底物溶液的左旋咪唑具有抑制非肠源性碱性磷酸酶活性的作用，且不影响APAAP复合物中肠源性KP的活性。因此，在检测那些富含内源性过氧化物酶的组织、冰冻切片及造血组织标本时，PAAP法是一种很好的方法。