斐林试剂和班氏试剂的使用方法及原理不尽相同。斐林试剂和班氏试剂都是检验还原性糖的试剂，二者的使用方法及原理、成分也有区别，下面就从这几种试剂的使用原理、成分及使用方法等方面做一简单总结。　　（1）班氏试剂常用于尿糖的鉴定，其配方与斐林试剂不一样，其配方为：　　①400mL水中加85g柠檬酸钠和50g无水碳酸钠；　　②50mL加热的水中加入8.5g无水硫酸铜。制成溶液；　　③把CuSO4溶液倒入柠檬酸钠溶液中，边加边搅，如产生沉淀可滤去。　　（2）其反应原理与斐林试剂略有差别。利用斐林试剂鉴定时，斐林试剂甲和斐林试剂乙直接反应生成酒石酸络铜离子。　　酒石酸络铜离子和可溶性还原糖在加热条件下反应产生砖红色沉淀。而班氏试剂中的产生却是这样的：柠檬酸钠作为络合剂，由碳酸钠提供碱性。CuSO4与柠檬酸钠溶液和Na2CO3溶液混合时生成柠檬酸络铜离子，柠檬酸络铜离子与葡萄糖中的醛基反应生成砖红色沉淀。　　（3）两种试剂的保存方式不同。斐林试剂甲和斐林试剂乙混合后会因酒石酸有一定的还原性而自发地缓慢产生氧化亚铜沉淀，因此斐林试剂一般为现用现配；而班氏试剂的配方中，柠檬酸钠比较稳定，实际碱性也不强，不易还原铜离子产生氧化亚铜沉淀，因此该试剂可长期保存。　　当然，无论用班氏试剂还是斐林试剂，归根结底都是二价铜与醛基在沸水浴加热条件下反应而生成砖红色的沉淀，两者反应现象一样，这就是二者的相同之处。

  对照品与标准品区分  对照品与标准品是2个不同的概念，中国药典凡例中已有明确的定义：  对照品系指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质，而标准品系指用于生物检定、抗生素或生物药品中含量或效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示。  文献中常将2种概念混淆，认为对照品就是标准品，是1种物质2种提法而已，造成错误的原因，可能是有的药品既有对照品，又有标准品。例如当用微生物法测定头孢克罗效价时，用头孢克罗标准品，用高效液相色谱仪HPLC或紫外分光光度计UV法测定时，则用对照品;非那西丁当用作熔点校准物质时，用熔点标准品，测定含量时用对照品。即使是同一种物质的标准品和对照品，它们的规格、标定方法以及用途都可能是不同的。  对照品或标准品混用，即将对照品或标准品用于不是其标定方法的含量测定，是药品检验中经常出现但未引起重视的一个问题。尽管同一批对照品不同标定方法的含量有很好的相关性，但并不完全相同，有时差别会很大。如英国Glaxo公司提供的头孢呋肟酯对照品，HPLC标定为96.9%，供含量测定用;UV为98.8%，供溶出度测定。虽然中国药典凡例明确规定卫生部所发对照品仅用于正文中所规定的分析方法。但由于：  (1)卫生部提供的对照品使用说明书不够详尽，大多无对照品质量要求及标定方法;  (2)对对照品或标准品的正确使用缺乏认识;  (3)日常科研中极难找到相应的对照品;  (4)中国药典正文中也常存在对照品混用的问题，如常将含量测定用的标准品或对照品用于溶出度检查，而含量测定方法与溶出度分析方法又不同，故极易引起混用。

  产品内容：  1. 结晶紫染色液(Crystal Violet Staining Solution)是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成深紫色的染色液。  2. 结晶紫是一种碱性染料，可以和细胞核中的DNA结合，从而产生细胞核染色。  3. 一个包装的本染色液至少可以染色200个样品。  4. 室温避光保存，一年有效。  使用说明：  1. 样品处理  a) 对于石蜡切片：二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟。蒸馏水2分钟。  b) 对于冰冻切片：蒸馏水2分钟。  c) 对于培养细胞：用4%多聚甲醛固定10分钟以上。蒸馏水洗涤2分钟。换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2分钟。  2. 结晶紫染色  对于上述处理好的样品：结晶紫染色液染色10分钟(可以根据染色结果和要求调整时间)。  用蒸馏水或自来水充分洗涤后即可进行观察和拍照。  注意事项：  1. 需自备4%多聚甲醛。如果需要脱水、透明和封片处理，还需自备二甲苯，中性树胶或其它封片剂。如果样品是石蜡切片，需自备70%和90%乙醇，无水乙醇以及二甲苯。  2. 样品数量较多时，可以使用染色架和染色缸，便于操作。  3. 第一次使用本试剂盒时建议先取1-2个样品做预实验。  4. 结晶紫对人体有害，请注意适当防护。  5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。  有效期：12个月有效。

质粒提取主要有碱裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。1、碱裂解法原理：根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。在强碱环境下，细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。2、煮沸法裂解：将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。3、小量一步提取法：由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力消失后复性。但质粒DNA的复性快，仍溶于溶液而细菌染色体DNA复性较慢，会形成不溶的网状结构，通过高速离心可以分离得到质粒DNA 。

标准溶液的取得有两种方法，一种是用基准物质直接配制，一种是用基准物质或已知准确浓度的标准溶液进行标定来取得。用于配制或标定标准溶液浓度的最高纯度化学试剂称为基准试剂或基准物质，用基准试剂或基准物质配制成已知准确浓度的溶液称为标准溶液。标准溶液的浓度准确与否直接关系检测结果的精密度、准确度。因此配制和标定中你必须知道这些事：1、用于配制或标定的标准溶液浓度的基准物质必须符合以下条件：（1）纯度高、杂质含量一般不得超过0.001%，达到优级纯。（2）化学性质稳定，不易吸湿，不被空气氧化，干燥时不分解。（3）分子量大，使用时易溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂，能精确称量。（4）使用中符合化学反应的要求，组成恒定，标定时能按化学反应式定量完成，没有副反应或逆反应，便于计算。2、基准试剂必须经充分干燥后称取，当zhi定使用含有结晶水的试剂时，只能将其放在适宜的干燥器内进行干燥而不得加热。3、分析实验所用的溶液应用纯水配制，容器应用纯水洗三次以上。特殊要求的溶液应事先作纯水的空白值检验。(应符合GB-6682《实验室用水规格》中三级水的规定。4、所用试剂的纯度应为分析纯或分析纯以上，根据不同的工作要求合理选用相应级别的试剂。5、为保证试剂不受污染，应用清洁的牛角勺从试剂瓶中取出，绝不可用手抓取。6、试剂结块可用洁净的粗玻璃棒或瓷药铲将其捣碎后取出。7、打开易挥发的试剂瓶塞时不可把瓶口对准脸部。夏季由于室温高，试剂瓶中很易冲出气液，最好把瓶子在冷水中浸一段时间再打开瓶塞。放出有毒，有味气体的瓶子应该密封。8、若嗅试剂气味，可将瓶口远离鼻子，用手在试剂瓶上方扇动，绝不可用舌头品尝试剂。9、所用天平的砝码，滴定管，容量瓶及移液管均需定期校正。10、配制硫酸，磷酸，盐酸等溶液时，都应把酸倒入水中。对于溶解时放热较多的试剂，不可在试剂瓶中配制，以免炸裂。11、配制硫酸溶液时，应将浓硫酸分为小份慢慢倒入水中，边加边搅拌，必要时以冷水冷却烧杯外壁。溶解氢氧化钠，氢氧化钾等时，大量放热，也必须在耐热容器中进行。12、用有机溶剂配制溶液时，有时有机物溶解较慢，应不时搅拌，可以在热水浴中温热溶液，不可直接加热。易燃溶剂使用时要远离明火。几乎所有的有机溶剂都有毒，应在通风柜内操作，为避免有机溶剂不必要的蒸发，烧杯应加盖。13、不能用手接触腐蚀性及有ju毒的溶液，剧毒废液应作解毒处理，不可直接倒入下水道。14、溶液要用带塞的试剂瓶盛装，见光易分解的溶液要装于棕色瓶中，挥发性试剂例如用有机溶剂配制的溶液，瓶塞要严密，见空气易变质及放出腐蚀性气体的溶液也要盖紧，长期存放时要密封。浓碱液应用塑料瓶装，如装在玻璃瓶中，要用橡皮塞塞紧，不能用玻璃磨口塞。15、配制或标定标准溶液所用试剂必须是基准试剂或优级纯试剂。16、用直接法配制标准溶液时，准确称取一定量的基准试剂溶解后移入容量瓶中，用溶剂稀释到标线。根据所取的基准试剂的量和容量瓶的容量直接计算溶液的准确浓度。17、用间接法配制标准溶液时，先配成稍高于所需浓度的溶液，用基准试剂或已知浓度的标准溶液准确标定其浓度。必要时用稀释法调整其浓度至所需值。18、配制好的标准溶液应注明名称、浓度、配制日期、有效期、配制人，其浓度：用 mol/L、mg/L、ng/L表示。19、每份基准试剂的用量不应过小，使用25ml滳定管时，以能消耗20ml滴定液为宜；实用50ml滴定管时，以能消耗45ml滳定液为宜。20、对浓度不稳定的标准溶液，应酌情定期重新标定。最好在每次使用前进行标定。21、除高氯酸外，均指20℃时的浓度。在标准滴定溶液标定，直接制备和使用时若温度有差异，应要求补正。22、GB601-2002规定标定标准滴定溶液的浓度时，须两人进行实验，分别各做四平行，每人四平行测定结果极差的相对值不得大于重复性临界极差[CrR95(4)]的相对值0.15%,两人共八平行测定结果极差的相对值不得大于重复性临界极差[CrR95(8)]的相对值0.18%。23、标准滴定溶液浓度平均值的扩展不确定度一般不应大于0.2%。24、滴定分析用标液在常温(15-25C)下,保存时间一般不超过2个月.当溶液出现浑浊、沉淀、颜色变化等现象时，应重新配制。25、制备的标准溶液浓度与规定浓度相对误差不大于5%。浓度值取四位有效数字。26、配制浓度等于或低于0.02mol/L标准溶液时，应于临用前将浓度高的标准溶液用煮沸并冷却的水稀释，必要时应重新标定。27、碘量法反应时，溶液的温度不能过高，一般在15～20℃之间进行滴定。28、在标定和使用标准滴定溶液时，滴定速度一般应保持在6mL/min－8mL/min。29、称量工作基准试剂的质量的数值小于等于0.5ｇ时，按精确至0.00001ｇ称量；数值大于0.5ｇ时按精确至0.0001ｇ称量。30、标准滴定溶液的浓度小于或等于0.02moL/L时，应于临用前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并冷却的水稀释，必要时重新标定。31、储存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起理化作用。壁厚最薄出不小于0.5mm。32、所有的溶液以（%）表示的均为质量分数，只有乙醇（95%）中的（%）为体积分数。33、各种标准溶液必须按其化学性质进行配制和储存，对于在稀溶液中不稳定的物质，应先配制浓度较高的储备液，使用前 按分析方法的要求配制成稀释液。34、高浓度剧毒或有毒物质的储备液应按有毒试剂的使用和管理办法执行，妥善保管，不得随意放臵。

免疫学检测即根据抗原、抗体反应的原理,利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答,在生物体内产生特异性和非特异性T细胞的克隆扩增,并分泌特异性的免疫球蛋白(抗体)。由于抗体-抗原的结合具有特异性和专一性的特点,这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白(抗原或抗体)。免疫学检测技术的用途非常广泛,它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散,通过观察抗原-抗体相遇时产生的沉淀反应,检测抗原或抗体,最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散,例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验。(1)单向免疫扩散试验(single immunodiffusion test):就是在凝胶中混入抗体,制成含有抗体的凝胶板,将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内,让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散,当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物,出现以小孔为中心的圆形沉淀圈,沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。(2)双向免疫扩散试验(double immunodiffusion test):一种分析鉴定抗原、抗体纯度和抗原特异性的试验。即抗原和抗体分子在凝胶板上扩散,二者相遇并达到最适比例时形成沉淀线。利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性,可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散。例如:免疫电泳试验和双向凝胶电泳。

　　支原体早发现于1898年，1956年Robinson等*从细胞培养物中分离出支原体，之后国内外关于支原体污染细胞的报道屡见不鲜。它广泛存在于自然界中，有80余种，污染细胞常见的支原体包括发酵支原体（ M.fementans）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）、口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginina）、梨支原体（M.pirum）、唾液支原体（M.salivarium）和人型支原体（M.hominis）。　　　　支原体通常附着在细胞的表面，并影响其宿主细胞的生理、遗传等多方面的正常功能，用这些污染后貌似正常的细胞做试验或生产，将会严重影响结果。　　　　1、对细胞生长繁殖和形态的影响　　　　细胞培养物被支原体污染后生长减慢，且产生细胞病变（cytopathic effect, CPE），表现为细胞体积增大，碎片增多，在细胞质中产生一些颗粒；细胞内病毒繁殖受阻，使细胞形成空斑。光镜下形成不正常密度生长的单层，贴壁细胞形成“流沙样”脱落、裂解。某些支原体可在侵入细胞８ｈ使线粒体膨胀，继而被破坏，细胞核萎缩呈空泡化，细胞微管解聚，培养瓶中细胞与细胞间隙出现膜状沉积，细胞无法传代，甚至整个细胞群体溶解。　　　　2、对细胞代谢和功能的影响　　　　有些被污染后的细胞，虽形态上变化不明显，但培养液pH变化较大，更换培养液后几小时就变酸，培养基中的必需氨基酸被消耗掉，如谷氨酸或核苷前体，改变细胞代谢。　　　　支原体吸附在细胞表面，破坏细胞膜的完整性，影响细胞信号传递；消耗细胞的核苷库，引起细胞染色体异常；发酵型支原体能迅速降解简单糖类，代谢产生的酸能改变细胞的功能；利用精氨酸的支原体则发生精氨酸效应，从而影响蛋白质和核酸的合成、导致细胞的分裂和生长受阻；引起细胞酶谱改变；由于支原体对细胞膜的吸附，干扰膜受体的功能，改变信号传递，破坏膜的完整性。在单克隆抗体制备中，骨髓瘤或杂交瘤细胞因支原体的污染而导致融合失败或抗体分泌能力下降以至丧失。　　　　3、引起染色体异常　　　　改变染色体组型，通常可导致细胞染色体断裂、数目减少，出现双着丝点染色体、环状染色体等。　　　　4、对免疫细胞产量的影响　　　　支原体能影响巨噬细胞的活性，抑制干扰素的合成和降低其活性，加大了继发感染其他细菌和病毒的几率，同时，通过植物血凝素干扰淋巴细胞的刺激、分化。

原理由于 浓盐酸容易挥发，不能用它们来直接配制具有准确浓度的 标准溶液，因此，配制HCl标准溶液时，只能先配制成近似浓度的溶液，然后用基准物质标定它们的准确浓度，或者用另一已知准确浓度的标准溶液滴定该溶液，再根据它们的体积比计算该溶液的准确浓度。标定HCl溶液的基准物质常用的是无水Na CO ，其反应式如下：Na CO +2HCl→2NaCl+CO +H O滴定至反应完全时，溶液pH为3.89，通常选用 溴甲酚绿—甲基红混合液作 指示剂。试剂1.浓盐酸（密度1.19）2.溴甲酚绿-甲基红混合液指示剂：量取30mL溴甲酚绿乙醇溶液（2g/L），加入20mL甲基红乙醇溶液（1g/L），混匀。步骤1．0.1mol·L 1HCl溶液的配制用量筒量取浓盐酸9mL，倒入预先盛有适量水的试剂瓶中，加水稀释至1000mL，摇匀，贴上标签。2．盐酸溶液浓度的标定用减量法准确称取约0.15g在270~300℃干燥至恒量的基准 无水碳酸钠，置于250mL锥形瓶，加50mL水使之溶解，再加10滴溴甲酚绿-甲基红混合液指示剂，用配制好的HCl溶液滴定至溶液由绿色转变为紫红色，煮沸2min，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。由Na2CO3的重量及实际消耗的HCl溶液的体积，计算HCl溶液的准确浓度。

核蛋白的简介核蛋白(nucleoprotein)因其最初发现于细胞核中，故称为核蛋白，它是细胞中的一种结合蛋白质。在细胞核及细胞质中都含有核蛋白。此外，在病毒、染色体和核蛋白体中也含有核蛋白。核蛋自在生物的生长和繁殖过程中有着独特的功能和作用。核蛋白是由带阳离子性质的碱性蛋白质(如组蛋白和鱼精蛋白)和蛋白质辅基(核酸)所构成。组蛋白含有碱性氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)，所以具有碱性。其相对分子质量为11 000～21 000。鱼精蛋白存在于某些鱼精核蛋白中，由于富含精氨酸，因此也具有碱性。核蛋白的提取方法柱式法 Minute TM 胞质胞核分离试剂盒操作方法：A． 悬浮细胞样品（包括植物，细菌，酵母和真菌制备的原生质体）1.500Xg，3 分钟低速离心收集细胞，用预冷的 PBS 清洗一次2. 将细胞转移到 1.5 ml 离心管中，3000 rpm 离心 1-5 分钟，弃去上清。3. 加入适量的胞浆提取缓冲液（请注意样品及裂解液的比例，以达到最佳效果）, 涡旋大力震荡 15 秒, 冰上孵育 5 分钟, 混匀. 接转胞质胞核分离步骤。B. 贴壁细胞1. 贴壁细胞生长至融合度 90-100%，将预冷的 PBS 直接加入细胞培养板，培养皿或培养瓶中清洗细胞两次，吸去上清。2. 将适量的胞浆提取缓冲液均匀的加入整个器皿表面，冰上静置 5 分钟。用吸头吹打几次后转移到预冷的 1.5 ml 离心管中。涡旋大力震荡 15 秒。接转胞质胞核分离步骤。（请注意样品及裂解液的比例，如浓度较低请减少裂解液使用量）C．组织样品1. 称重适量组织样品，放入预冷的 1.5 ml 离心管中。2. 用预冷的 PBS 清洗组织样品一次。3000rpm 离心 1 分钟，弃去上清，尽可能的使沉淀干燥。3. 加入适量胞浆提取缓冲液，用微型管杵或微粉碎机匀浆，去除没有完全匀浆的组织碎片。接转胞质胞核分离步骤。胞质胞核分离步骤1. 4oC，最高速 (14000-16000 rpm) 离心 5 分钟2. 将上清液（上清为胞浆组份）转移到一个新的预冷的 1.5 ml 离心管中。将沉淀（可选优化：用 0.5 ml 预冷 PBS 重悬，10000 rpm，离心 3-5 分钟清洗沉淀可以减少胞浆蛋白污染）中加入适量的胞核提取缓冲液，涡旋大力震荡 15 秒，冰上孵育 1 分钟。然后重复震荡 15 秒，冰上孵育 1 分钟四次。（如核蛋白提取浓度低，可适当延长每次孵育及震荡时间）3. 迅速将核提取物转入到预冷的离心管套管中，14000-16000 rpm，离心 30 秒。弃掉离心管柱。将核蛋白储存于-80℃。一般产量 1.5-2.5 mg/ml。

　　顾名思义，无血清培养基（serum-free medium, SFM）系指不含任何血清成分的合成培养基。近年来，因为细胞治疗（cell therapy）的快速发展与生物工业上的制备抗体、病毒抗原或是重组蛋白表达时，细胞培养基中的血清成分复杂，可能会影响制程或是增加不稳定的因素，因此，无血清培养基成为其目标，现今已有许多成熟的产品可供应研究人员做选择。　　　　血清培养基的缺点　　　　血清是一种成分极为复杂的混合物，为细胞培养增添了许多不可控制的变因。含有血清的培养基缺点如下：　　　　(1) 价格昂贵，血清的费用约占细胞培养费用的50-60%。　　　　(2) 血清可能会带有污染源，FBS最常见的即为支原体或黑胶虫污染。　　　　(3) 血清中复杂的成分会使疫苗、细胞因子、单克隆抗体等的分离或纯化带来很大的困扰。　　　　无血清培养基的优点　　　　避免血清批次间的差异，提高细胞培养的可重复性。　　　　避免血清自身的污染源污染。　　　　避免血清成分影响研究结果或是产品制程。　　　　提高产品表达水平并易于纯化。　　　　无血清培养基的基本配方　　　　基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。 用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。　　　　添加组分　　　　1. 促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。　　　　2. 促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。　　　　3. 酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。　　　　4. 结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。　　　　5. 微量元素：硒是最常见的。

近日，全国多地医院出现较多肺炎支原体感染患者，支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型，它既不同于，也不同于病毒，是介于细菌和病毒之间，能在无活细胞的人工培养基上生长繁殖的最小微生物。它广泛分布于自然界，与人类、 动植物的疾病有密切的关系。支原体的种类繁多，造成的危害非常广泛。目前证明对人体有致病作用的支原体有肺炎支原体、 解脲支原体、 人型支原体、 生殖支原体等几种，但临床以肺炎支原体最为常见。肺炎支原体主要以飞沫传播，引起儿童、 青少年呼吸道感染、 咽炎、 气管炎、 肺炎等。支原体检测方法：1、支原体的分离培养它是支原体污染鉴定的金标准，准确，价格便宜。但支原体在分离培养的过程中，要长出明显克隆至少需要4周时间，所需时间较长。2、ELISA方法检测步骤复杂，出现误差的几率较高，对实验者操作技巧有要求。同时试剂盒成本较高，普遍不被选用。3、DNA荧光染色法它采用荧光染色剂Hoechst 33258和支原体DNA富含A-T的区域结合。价格适中。由于DNA检测需要将可疑样品与指示细胞共同培养，因此一般需要几天后才出结果。有假阳性和假阴性，需要与其他方法结合使用。4、PCR技术它根据支原体核糖体16s-23s rRNA的特异保守序列设计引物，对待检样本DNA进行扩增，通过对扩增产物的大小分析作出诊断。操作简单、速度快，只需2-3小时即可出结果，通量高，价格适中。但是，不同厂家生产的PCR检测试剂盒由于引物及内在设计的不同，其准确度和敏感度有天壤之别。用PCR方法检测支原体，其准确性与选择的试剂盒的质量有直接相关性。

　　细胞因子（CK）是由活化免疫细胞和非免疫细胞（如某些基质细胞）合成分泌的能调节细胞生理功能、参与免疫应答和介导炎症反应等多种生物学效应的小分子多肽或糖蛋白，是不同于免疫球蛋白和补体的又一类免疫分子。　　　　根据来源初将活化淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子（LK），将单核-吞噬细胞产生的细胞因子称为单核因子（MK）。目前根据功能，可将细胞因子粗略分为以下6类：　　　　1.白细胞介素　　　　白细胞介素（IL）简称白介素，初被定义为由白细胞产生，在白细胞间发挥作用的细胞因子。虽然后来发现它们的产生细胞和作用细胞并非局限于白细胞，但这一名称仍被沿用。目前已报道的白细胞介素有18种，摘要列表如下：　　　　2.干扰素（IFN）　　　　干扰素是-先发现的细胞因子，因其具有干扰病毒感染和复制的能力故称为干扰素。根据来源和理化性质，可将干扰素分为α、β和γ三种类型。IFN-α/β主要由白细胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生，称为Ⅰ型干扰素。IFN-γ主要由活化T细胞和NK细胞产生，称为Ⅱ型干扰素。　　　　丙型干扰素生物学性能比较详见下表：　　　　3.肿瘤坏死因子（TNF）　　　　肿瘤坏死因子是一类能引起肿瘤组织出血坏死的细胞因子。1975年Garwell等将卡介苗注射给荷瘤小鼠，两周后再注射脂多糖，结果在小鼠血清中发现一种能使肿瘤发生出血坏死的物质，称为肿瘤坏死因子。肿瘤坏死因子分为TNF-αTNF-β两种，前者主要由脂多糖/卡介苗活化的单核巨噬细胞产生，亦称恶病质素；后者主要由抗原/有丝分裂原激活的T细胞产生，又称淋巴毒素。TNF-α/β为同源三聚体分子，主要生物学作用如下：　　　　（1）对肿瘤细胞和病毒感染细胞有生长抑制和细胞毒作用；　　　　（2）激活巨噬细胞、NK细胞，增强吞噬杀伤功能，间接发挥抗感染、抗肿瘤作用；　　　　（3）增强T、B细胞对抗原和有丝分裂原的增生反应，促进MHC-Ⅰ类分子表达，增强Tc细胞杀伤活性；　　　　（4）诱导血管内皮细胞表达粘附分子和分泌IL-1、IL-6、IL-8、CSF等细胞因子促进炎症反应发生；　　　　（5）直接作用或刺激巨噬细胞释放IL-1间接作用下丘脑体温调节中枢引起发热；　　　　（6）引起代谢紊乱，重者出现恶病质。　　　　4.集落刺激因子（CSF）　　　　集落刺激因子是指能够刺激多能造血干细胞和不同发育分化，阶段造血干细胞增殖分化在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。主要包括：干细胞生成因子（SCF）多能集落刺激因子（IL-3）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和促红细胞生成素（EPO）。上述集落刺激因子除具有刺激不同发育分化阶段造血干细胞增生分化的功能外，其中有些还能促进或增强巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬杀伤功能。　　　　5.生长因子　　　　生长因子是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。有些生长因子被直接命中为生长因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、表皮生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍生的生长因子和细胞生长因子等。多种细胞因子都具有刺激细胞生长的作用，从这个意义上讲，它们也是生长因子，如IL-2是T细胞的生长因子，TNF是成纤维细胞的生长因子。有些生长因子在一定条件下也可表现抑制活性。生长因子在免疫应答、肿瘤发生、损伤修复等方面有重要作用。　　　　6.趋化因子　　　　趋化因子是一组由70～90个氨基酸组成的小分子量的蛋白质（8～10kD）。几乎所有趋化因子分子的多肽链中都有4个保守的丝氨酸残基，并对白细胞具有正向的趋化和激活作用。根据其氨基酸序列中丝氨酸的数量和位置关系，将其分为4大类或4个亚家族。　　　　（1）α趋化因子，其近氨基端的两个丝氨酸残基之间被一个任意的氨基酸残基分隔，故称CXC趋化因子；　　　　（2）β趋化因子，其近氨基端的两个丝氨酸残基是相邻排列的，即CC趋化因子；　　　　（3）γ趋化因子，只有两个丝氨酸残基，其中一个位于多肽链的氨基端，又被称为C趋化因子；　　　　（4）δ趋化因子，其氨基端的两个丝氨酸之间被其他三个氨基酸残基分隔，即CX3C趋化因子。　　

1、1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：1 M Tris-HCl配制量：1 L配制方法：1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。PH值     浓HCl7.4     约70ml7.6     约60ml8.0     约42ml4. 将溶液定容至1 L。5. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2、10×TE Buffer (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA配制量：1 L配制方法：1. 量取下列溶液，置于1 L烧杯中。1M Tris－HCl Buffer（PH7.4，7.6，8.0）     100ml500mM EDTA(PH8.0)     20ml2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，均匀混合。3. 将溶液定容至1 L后，高温高压灭菌。4. 室温保存。3、1.5 M Tris-HCl (pH8.8)组份浓度：1.5 M Tris-HCl配制量：1 L配制方法：1. 称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中。2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3. 用浓盐酸调节pH值至8.8。4. 将溶液定容至1 L。5. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。4、3 M 醋酸钠(pH5.2)组份浓度：3M 醋酸钠配制量：100ml配制方法：1.称量40.8g NaAc·3H2O置于100-200ml烧杯中，加入月40ml的去离子水搅拌溶解2.加入冰醋酸调节pH值至5.23.加去离子水将溶液定容至100ml4高温高压灭菌后，室温保存。5、PBS Buffer组份浓度：137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4配制量：1 L配制方法：1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。NaCl     8gKCl     0.2gNa2HPO4     1.42gKH2PO4     0.27g2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3. 滴加浓盐酸将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1 L。4. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。6、10 M 醋酸铵组份浓度：10 M 醋酸铵配制量：100 ml配制方法：1. 称量77.1 g醋酸铵置于100～200 ml烧杯中，加入约30 ml的去离子水搅拌溶解。2. 加去离子水将溶液定容至100 ml。3. 使用0.22 mm滤膜过滤除菌。4. 密封瓶口于室温保存。注意：醋酸铵受热易分解，所以不能高温高压灭菌。7、苯ben酚/lv仿/yi戊醇 (25 : 24 : 1)配制方法：1. 说明：从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯ben酚/lv仿/yi戊醇（25 : 24 : 1)。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离，而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。2. 配制方法：将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的lv仿/yi戊醇（24 : 1）混合均匀后，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。8、10％ (W/V) SDS组份浓度：10％ (W/V)SDS配制量：100ml配制方法：1.称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中，加入约80ml的去离子水，68℃加入溶解2.滴加浓盐酸调节pH值至7.23.将溶液定容至100ml后，室温保存。9、2 N NaOH组份浓度：2 N NaOH配制量：100 ml配制方法：1. 量取80 ml去离子水置于100～200 ml塑料烧杯中（NaOH溶解过程中大量放热，有可能使玻璃烧杯炸裂)。2. 称取8 g NaOH小心地逐渐加入到烧杯中，边加边搅拌。3. 待NaOH完全溶解后，用去离子水将溶液体积定容至100 ml。4. 将溶液转移至塑料容器中后，室温保存。10、2.5 N HCl组份浓度：2.5 N HCl配制量：100 ml配制方法：1. 在78.4 ml的去离子水中加入21.6 ml的浓盐酸（11.6 N)，均匀混合。2. 室温保存。11、5 M NaCl组份浓度：5 M NaCl配制量：1 L配制方法：1. 称取292.2 g NaCl置于1 L烧杯中，加入约800 ml的去离子水后搅拌溶解。2. 加去离子水将溶液定容至1 L后，适量分成小份。3. 高温高压灭菌后，4℃保存。12、20％ (W/V) Glucose组份浓度：20％ (W/V) Glucose配制量：100 ml配制方法：1. 称取20 g Glucose置于100～200 ml烧杯中，加入约80 ml的去离子水后，搅拌溶解。2. 加去离子水将溶液定容至100 ml。3. 高温高压灭菌后，4℃保存。13、Solution I(质粒提取用)组份浓度：25 mM Tris-HCl（pH8.0), 10 mM EDTA, 50 mM Glucose配制量：1 L配制方法：1. 量取下列溶液，置于1 L烧杯中。1M Tris-HCl（PH8.0）     25ml0.5M EDTA（PH8.0）     20ml20％Glucose（1.11M）     45mldH2O     910ml2. 高温高压灭菌后，4℃保存。3. 使用前每50 ml的Solution I中加入2 ml的RNase A（20 mg/ml)。14、Solution II(质粒提取用)组份浓度：200mM NaOH，1％(W/V)SDS配制量：500ml配制方法：1.量取下列溶液，置于500ml烧杯中10％ SDS 50ml2N NaOH 50ml2.加灭菌水定容至500ml，充分混匀3.室温保存，此溶液保存时间最好不要超过一个月注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌15、Solution III(质粒提取用)组份浓度：3 M KOAc, 5 M CH3COOH配制量：500 ml配制方法：1. 称量下列试剂，置于500 ml烧杯中。KOAc                      147gCH3COOH     57.5ml2. 加入300 ml去离子水后搅拌溶解。3. 加去离子水将溶液定容至500 ml。4. 高温高压灭菌后，4℃保存。16、0.5 M EDTA(pH8.0)组份浓度：0.5 M EDTA配制量：1 L配制方法：称取186.1 g Na2EDTA·2H2O，置于1 L烧杯中。2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌。3. 用NaOH调节pH值至8.0（约20 g NaOH)。注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。4. 加去离子水将溶液定容至1 L。5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。6. 室温保存。17、1 M DTT组份浓度：1 M DTT配制量：20 ml配制方法：1. 称取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料离心管内。2. 加20 ml的0.01 M NaOAc（pH5.2)，溶解后使用0.22 mm滤器过滤除菌。3. 适量分成小份后，-20℃保存。18、10 mM ATP组份浓度：10 mM ATP配制量：20 ml配制方法：1. 称取121 mg Na2ATP·3H2O，加入到50 ml塑料离心管内。2. 加20 ml的25 mM Tris-HCl（pH8.0)，搅拌溶解。3. 适量分成小份后，-20℃保存。

  培养基变浑浊的原因可能有如下几点：    1、细胞存在污染，污染早期可以见到细胞生长；    2、不排除传代时细胞密度过大，或者操作不当导致多数细胞不贴壁，大量细胞漂浮。    3、细胞破碎。    细胞培养中常见的生物污染类型有7种,分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染.他们在细胞培养中污染的特点如下：    1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显.    2、支原体：黑色的,好象多为多形,培养液一般培养液一般会浑浊,原体感染,国内血清很多都没有做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中最常见的微生物之一.而且它不能用过滤的办法除去.支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去.    3、黑胶虫：可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液也是不浑的,一般不会太影响,细胞还是可以用的.常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象.对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理.    4、真菌：一般培养液清亮,不变色,镜下有丝状物,有些真菌开始很像死细胞碎片,只是它很多很多的小块很清楚,象珊瑚状,不象细胞碎片分不清,慢慢的会长出很细的黑色丝状物.真菌生长的比较慢,不象细菌那么容易被发现,但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了,也很难救活了.    5、原虫：培养液可轻微浑浊,显微镜下那些细小的点状物数量非常多,轻微活动,细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢,而且细胞状态不好,边缘不清楚,细胞不透亮.他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养.这种共生是非常普遍的,但他们的数量小,细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长,只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长,最终形成恶性循环.    6.病毒：组织细胞培养过程中,如果没有除去潜在的病毒,就会产生病毒污染.目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒.尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的.因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题 。    7、非同种细胞污染 ：即是细胞交叉污染,由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,往往会使一种细胞被另一种细胞污染.目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效.非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致.

产品描述：适合于稀释所有免疫抗体测定（Immunofluorescence, IHC, ELISA, WB）实验中的抗体。该试剂可用于一抗或二抗的稀释和配制，在4℃保存和使用不少于六个月；稀释液中加入了多种抗体结合反应增强剂及稳定剂，增强免疫反应，减少非特异性结合，获得更佳的效果，可反复使用，节约宝贵的抗体。试剂中不含有动物源的蛋白、磷酸盐、叠氮钠或硫柳汞类防腐剂，适合于所有类型抗体稀释，包括HRP，AP标记的抗体。产品优势：没有叠氮钠等剧毒防腐剂，使用医疗级别防腐剂；含免疫增强剂和稳定剂，背景更加干净；保存时间更长，使用后工作液能保存4-6个月（正常一抗稀释液只能一个月），节省一抗用量。一抗专用稀释液+二抗专用稀释液+ELISA专用抗体稀释液+免疫荧光抗体专用稀释液+免疫组化抗体稀释液+HRP标记抗体稀释液+AP标记抗体稀释液+免疫信号增强剂+非叠氮钠无毒防腐剂。操作步骤：根据抗体使用说明书，直接用本品对一抗或二抗进行适当倍数的稀释。保存在NCM Universal Antibody Diluent 稀释液中的抗体可回收于4℃保存，至少可反复多次使用长达6个月以上，直至不能达到理想结果后丢弃。注意事项：1. 孵育抗体时尽量在4C进行，可延长稀释后抗体的使用寿命。2. 本品不含叠氮钠或硫柳汞类防腐剂，但含安全性更高的防腐剂，还需小心操作避免皮肤直接接触。产品规格：100ml/500ml保质期：24个月本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

　　稀释倍数=原液浓度/（原液浓度×移取体积/定容体积）。如1mol/L稀释一倍就是0.5mol/L，10%稀释一倍就是5%　　稀释是指对现有溶液加入更多溶剂而使其浓度减小的过程。在稀释后溶液的浓度减小，但溶质的总量不变。　　稀释前溶液浓度除以稀释后的溶液浓度所得的商。　　溶液是由一种或几种物质分散到另一种物质里，组成的均一、稳定的混合物，被分散的物质(溶质)以分子或更小的质点分散于另一物质(溶剂)中。物质在常温时有固体、液体和气体三种状态。因此溶液也有三种状态，大气本身就是一种气体溶液，固体溶液混合物常称固溶体，如合金。　　一般溶液只是专指液体溶液。液体溶液包括两种，即能够导电的电解质溶液和不能导电的非电解质溶液。所谓胶体溶液，更确切的说应称为溶胶。其中，溶质相当于分散质，溶剂相当于分散剂。在生活中常见的溶液有蔗糖溶液、碘酒、澄清石灰水、稀盐酸、盐水、空气等。　　1、严格意义上，每次检测样品都要带标准品，拟合标准曲线。原因是每次检测都要受不同条件的影响，比如人为操作，环境的变化等。　　2、尽量把样本同时检测这样就可以就可以节约了。　　3、一般来说，ELISA是不需要稀释的，除非测定值超过标准品的上限，这样推算出来的结果可能误差较大，然后可以根据推算出来的结果，把它稀释到标准品的范围就可以了！　　4、可以使用稀释标准品的稀释液！

　　1、铁架台：用于固定和支持各种仪器，一般常用于过滤、加热等实验操作　　2、烧杯：①溶解固体物质、配制溶液，以及溶液的稀释、浓缩②也可用做较大量的物质间的反应　　3、量筒：量度液体体积　　4、集气瓶：用于收集或贮存少量气体，也可用作部分反应的反应容器　　5、试管：①少量试剂的反应容器②也可用做收集少量气体的容器③或用于装置成小型气体的发生器　　6、试管夹：用于夹持试管　　7、玻璃棒：用于搅拌、过滤或转移液体　　8、酒精灯：用于加热　　9、胶头滴管：胶头滴管用于吸取和滴加少量液体　　10、滴瓶：滴瓶用于盛放液体药品　　11、广口瓶：（内壁是磨毛的）常用于盛放固体试剂，也可用做集气瓶　　12、细口瓶：用于存放液体试剂的玻璃器皿　　13、烧瓶：有圆底烧瓶，平底烧瓶①常用做较大量的液体间的反应②也可用做装置气体发生器　　14、锥形瓶：①加热液体，②也可用于装置气体发生器和洗瓶器③也可用于滴定中的受滴容器。　　15、蒸发皿：通常用于溶液的浓缩或蒸干。　　16、漏斗：用于向试管、酒精灯等添加液体。有普通漏斗、分液漏斗（可以控制流速）和长颈漏斗

　　对检测样品的接收、流转、贮存、处置以及检测样品的识别等各个环节实施有效的质量控制至关重要。管理检测样品可以确保检测样品的代表性、有效性和完整性，从而保证检测结果的准确度。　　一.管理检测样品需做到这8个方面　　1. 样品的采集：　　样品应具有代表性。以样品的结果说明总体的情况，对总体作出结论。采样遵循如下原则：　　1.1 代表性：　　采样时应特别注意克服和消除各种因素的影响，使样品最大限度地接近总体情况，保证样品对总体有充分的代表性 。　　1.2 可获性：　　某些情况下，样品可能不具备代表性，而是由其可获性所决定。　　1.3 公证性：　　采样必须保证公正，由具有资格的人员（接受过采样培训且考核合格的人员）进行。必要时在现场与受检单位陪同人员一起签封，并做好现场采样记录。填写样品采集记录表，双方签字确认。　　2.样品的接收　　2.1 填写委托书　　无论抽检还是送检样品首先应由委托方填写“样品检验委托书，一般委托书一式二份，一份留检验机构存档，一份交委托方作为领取报告凭证”。　　2.2 审核委托书　　接收人员应审核样品检验委托书填写是否规范，是否有空项，手续是否齐备，资料是否完整，标准引用是否正确、适宜。　　2.3 核查样品　　样品应与“样品检验委托书”填写内容一致。样品包装应完好，如不完好应有文字记录。送检样品数量应符合检验、复验、仲裁的要求，如送检样品仅为检验样品应有文字说明。　　2.4 正式受理　　样品接收人员在“样品检验委托书”上签字并承诺出具报告日期。　　3.样品的编号　　为保证检验样品溯源 ，原则上一份样品给予一个唯1性编号（CNAS的要求是避免混淆，并不是要唯1性编号，当然唯1性编号肯定也满足要求）。　　对于同一事件的若干样品可视为一份样品给予一个编号。样品编号可由年份、样品类别代码和样品序号组成（或者其他的适合实验室的编号）。为保证样品编号的唯1性，一般由样品接收部门负责统一编制，或者有LIMS的实验室可以由系统生成。　　4.样品的识别　　样品的识别包括唯1性编号(样品受理编号)和样品不同试验状态(未检、在检 、检毕 、留样)标识 。对检毕样品应有“检毕”、“合格”、“不合格”标识。对于多个包装的同一样品应在样品受理编号后面加横杠和数字加以细分识别，以确保每个包装的唯1性。样品管理员负责将样品的识别标签逐一贴在样品上。　　5.样品的流转　　样品受理后，由承办人根据客户“样品检验委托书中的要求，向检测部门（人员）下达“样品检验交接单”，并通知检测室样品管理员取待检样品。检测室样品管理员在交接时应核查样品状况并在“样品检验交接单”上签收认可。样品传递到检测室后由检测室样品管理员统一登记。未检、在检、检毕样品应分别存放。检测员领取样品作试验时，样品识别号不得改变。样品在流转和检测过程中应加以防护，避免受到非检测性损坏或丢失。　　6.分包样品的管理　　对外提供给分包实验室的样品，在交付前应检查样品完好性，交付分包实验室的样品应有对方接收凭证。分包管理部门应做好分包样品的登记工作。分包方应有保护样品完整性的措施，做好样品的标记和保管。　　7.样品的贮存、保管　　样品贮存、保管应设有专门的样品窒并配备合适的设施；　　样品室由样品管理员专人负责，限制出入；　　样品贮存环境应安全，无腐蚀，清洁干燥且通风良好，有温湿度监控；　　对要求在特殊环境条件下贮存的样品，应严格控制环境条件，环境条件应定期加以记录；　　留样应按照规定数量、品种执行，以备复检、仲裁用；　　腐蚀性、易燃、易爆和有毒的危险样品应隔离存放，做出明显标记；　　样品管理员要对留样样品认真进行验收登记，不同性质的样品分类保存。　　8.样品的处理　　报告发出后留样样品留样期不得少于报告投诉反馈时间，对超标样品和特殊样品如有必要可重点延长留样期，检毕样品处理分以下几种处理方式：　　8.1 客户要求领回的样品，在留样期满后，客户可领回。客户领回样品时，领样员需凭“样品检验委托书”到样品室，由样品管理员办理退样手续。　　8.2 客户需提前(留样期内)领回样品时，应在样品检验委托书上签注“对本检测报告无异议”之后，方可由样品管理员办理退样手续；　　8.3 对留样期已过的客户委托处理样品，应按客户填写的要求处理；　　8.4 必须监护处理的样品，样品管理员必须按规定办法监护处理，防止污染环境及造成危害，监护处理应有记录。　　二.样品管理过程中不可忽视的几个小细节　　1.检测样品流转：　　1.1 样品管理员对接收的所有委托送检样品应做好记录，按照检测要求将送检样品交给相关检测室，办理好交接手续；　　1.2 检测人员对送检样品进行核对交接，按照要求进行制样；　　1.3 检测人员在检测样品试毕后，应将试毕检测样品放在试样已检区；　　2.检测样品的贮存：“试毕”试样及客户有特殊要求的剩余送检检测样品最后交样品管理员“留存”保管。　　3.检测样品的处置：　　3.1 试毕检测样品的试样，留样期不少于国家有关法律、法规所规定的期限。　　3.2 对无特殊要求的剩余送检样品留样期不超过报告申诉期。　　3.3 公司内部常规例行委托检测的检测样品无特殊要求时留样期为1星期。　　4.检测样品的保密与安全：　　4.1 严格按照与客户签订协议或有关规定进行检测样品的检测、储存与处置 ，严格执行保密管理规定，对客户的检测样品、技术资料及有关信息负有保密责任。　　4.2 对有特殊要求的检测样品，应做出相应安排，包括检测样品接收、流转、贮存、处置及技术资料的管理，采取安全防护措施，保证检测样品的完好及机密性。　　三.检验机构样品室要怎样管理才规范　　1.样品管理员的职责：　　1.1 样品管理员必须保证样品室的清洁、整齐、美观，确保在最you有效的时间内查找所需样品。　　1.2 未经允许，无关人员不得随意进出样品室，样品管理员有权拒绝wu无关人员进出样品室。　　1.3 样品管理员有权监督进出样品室人员的活动。　　1.4 未经样品管理员的同意，其他人不得将样品带入或带出样品室。　　1.5 样品管理员必须对样品室发生的一切异常状况负责，发现异常必须及时向领导汇报。　　2.一般规定：　　2.1 每天清理样品室，保证样品室的清洁、整齐、有序。　　2.2 新到样品时，必须检验样品的完好性，及时入库并贴标、拍照、排放（或收藏）、入帐。　　2.3 保证每款样品标签完整，标明货号及颜色（标签贴于鞋底）。将样品用数码像机拍照，存入电脑（图片以样品的货号命名），以厂家、日期为分类标准。　　2.4 出、入库一定要有单据，双方签字后样品方可出、入库，样品去向要落实到人。　　3.出库管理：　　3.1 样品装箱出库前，样品管理员应确保样品的完好性，决不能有不良样品流出至客户手中。杜绝样品上带有原厂家商标、电话、地址、金额等资料，否则视情节轻重扣发岗位津贴。　　3.2 样品管理员接到样品出库通知时，填写出库单，领样人、样品管理员签字后方可出库。　　3.3 任何样品出库或外借，不得损坏，如有毁损，样品管理员有权申请要求赔偿。　　4.入库管理：　　4.1 新到样品时，按到货单认真验货，必须检验样品的完好性。及时入库并贴标、拍照、入帐、排放或收藏。　　4.2 入箱存放的样品，要做好保护，填纸、装袋后装箱，箱上标明数量，品名及厂家后有序排放入库（以厂家名为装箱标准）。　　4.3 定期整理样品室，挑出长期不用、已破损或一款相同数只的样品报批作废。　　4.4 可配成对的鞋子单独装箱，跨年度的成对鞋报批处理。　　4.5 样品架上的样品要按厂家、类型、材质的顺序摆放，用吊牌标清，定期整理样品架，长期不用、重复的样品装箱备查。　　4.6 定期盘点（每月27日），盈亏要究责（按财务实际核算金额按比例赔付）。　　5.罚责：　　5.1 样品室的门、灯、空调等未关，发现一次扣罚责任人5元。　　5.2 未经允许，样品管理员私自外借样品或样品资料，一经发现将视情节严重扣罚当月岗位津贴。　　5.3 因样品管理员工作失误，导致不良样品流入客户手中，全数扣除当月岗位津贴。　　5.4 厂家、工厂的货号、价格、电话hao号码、商标或标签等信息出现在样品上，致使客人获得以上资料，将视为样品管理员的工作失职，相应扣罚当月岗位津贴。　　5.5 样品丢失或样品管理员不明样品的去向，样品管理员需原价赔偿。　　四.小结　　样品管理是实验室管理过程中的重要内容，是保证检测数据真实可靠和溯源的重要依据，需要严格管理。样品管理工作琐碎，注重细节，需要耐心对待，在长期工作中不断总结经验，才能更有效的提高样品管理的效率和水平呦。

限制性核酸内切酶（以下简称限制酶）：限制酶主要存在于微生物（细菌、霉菌等）中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。在基因工程中起作用。DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。基因工程中，大肠杆菌连接酶只连接黏性末端，而T4连接酶既可连接黏性末端，又可连接平末端。DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起作用。DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。DNA连接DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。RNA聚合酶（又称RNA复制酶、RNA合成酶）的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。真核生物RNA聚合酶：真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA聚合酶：RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。在RNA复制和转录中起作用。反转录酶：RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。在基因工程中起作用。解旋酶：是一类解开氢键的酶，由水解ATP来供给能量它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制叉的单链结构。在细菌中类似的解旋酶很多，都具有ATP酶的活性。大部分的移动方向是5'→3'，但也有3'→5'移到的情况，如n'蛋白在φχ174以正链为模板合成复制形的过程中，就是按3'→5'移动。在DNA复制中起做用。DNA限制酶作用于磷酸二酯键DNA连接酶作用于磷酸二酯键DNA聚合酶作用于磷酸二酯键DNA解旋酶作用于氢键

现在行业中所应用的定量菌株种类是非常多的，并且不同种类的菌株所呈现的状态都是不一样的，那么主要有哪些形态呢？分别是典型类、大肠菌样型、粗糙型、黏液型、以及侏儒型等等这几种形态。我们在使用它的时候，还要注意使用的步骤，以及使用时的注意事项，下文中远慕就为大家详细介绍了这三个关于定量菌株的知识点，感兴趣的朋友们一起来看看吧！定量菌株的主要形态：1、典型类此类定量菌株的菌落不规则，菌落的边缘像伞状一样伸展。2、大肠菌样型此类定量菌株的菌落圆形凸起，无色透明，似大肠埃希菌菌落。3、粗糙型此类定量菌株的菌落呈纽扣状，表面粗糙，菌落中间是隆起的，但是边缘扁平。4、黏液型此类定量菌株的菌落光滑，隆起，呈黏液状，嵌入培养基之后不易挑起，非常像肺炎克雷伯菌菌落，但是这种菌株是无色的。5、侏儒型此类定量菌株生长缓慢，培养18h尚不见菌落，24 h后才有细小菌落。定量菌株使用时的步骤：1、取出所需数量及品种的定量菌株，复温定量菌株至室温，等待使用。2、无菌环境下，旋开复溶液的瓶盖，用移液枪等准确吸取1mI定量菌株的复溶液，转移到冷冻管中。3、轻轻振荡盛有定量菌株复溶液的冷冻管，使内部的冻干粉全部溶解，溶解之后呈悬浮状。4、用移液枪准确吸取0.1ml定量菌株的菌恳液，接种到待检的培养基上，按照适宜的温度、时间培养后取出，观察结果。定量菌株使用时的注意事项：1、定量菌种活化前，将盛有它复溶液的冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，如果长时间在室温下放置，会导致定量菌种的衰退。2、将盛有复溶液的冷冻管开封、冻干粉复溶等操作应在无菌条件下进行。3、每次只进行一种定量菌株的操作，如要操作多种菌株，需严格消毒所用的设备、仪器等，防止菌种间的交叉污染。4、如发现盛装定量菌株的冷冻管盖松动、复溶液浑浊等情况的话，应该停止使用。

　　Tris-HCL：缓冲体系。提供稳定pH;　　NaCl：可以降低DNA在水中的溶解度，并且不破坏DNA的结构;　　EDTA: Ca2+ Mg2+ 的螯合剂，抑制DNase活性;　　SDS：使蛋白变性，促进蛋白质和DNA的分离;　　巯基乙醇：抗氧化剂，防止酚氧化成醌，保护DNA;也有人说可以用来消泡;　　醋酸钾：钾离子置换SDS的钠离子，形成不溶于水的PDS,将大量蛋白同步沉淀下来。　　氯仿：异戊醇：使蛋白变性。氯仿的作用是变性剂、抽提脂溶性物质;　　异戊醇作用是A.降低表面张力、阻止气泡的产生;B.有助于分相(使离心后水相、有机相稳定)　　(剧烈震荡时容易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用);　　异丙醇：沉淀DNA;　　70%乙醇：洗涤DNA;(盐、蛋白等溶于70%乙醇，而DNA不溶)　　100%乙醇：可以用于沉淀DNA，也可以用于使DNA快速干燥

　　实验方法原理　　转化活性是检测质粒生物活性的重要指标，在基因克隆技术中，转化（transformation）是特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组质粒 DNA（包括人工染色体）导入细胞的过程， 是一种常用的基本实验技术。 该过程的关键是受体细胞的遗传学特性及其所处的生理状态，用于转化的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，以防止对导入的外源的切割，用 R- M- 符号表示。 此外，为了便于检测，受体菌一般应具有可选择的标记（例如抗生素敏感性、颜色变化等）。 但质粒 DNA 能否进入受体细胞则取决于该细胞是否处于感受态（competence）。所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源 DNA 的一种生理状态，可通过物理化学的方法诱导形成，也可自然形成（自然感受态）。 在基因工程技术中，通常是采用诱导的方法。 大肠杆菌是常用的受体菌，其感受态一般是通过用 CaCl2 在 0℃ 条件下处理细胞而形成，基本原理是： 细菌处于 0℃ 的 CaCl2 低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒 DNA 形成抗 DNase 的羟基一钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 短时间热激处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上便可获得所需的转化子。　　实验材料 大肠杆菌PUC18 质粒　　试剂、试剂盒 LB 液体培养基含（和不含）氨苄靑霉素的 LB 平板LB 培养基CaCl2　　仪器、耗材 塑料离心管微量进样器玻璃涂棒恒温水浴锅（37℃42℃）分光光度计台式高速离心机　　实验步骤　　1. 制备感受态细胞　　1.1 将大肠杆菌 HB101 在 LB 琼脂平板上划线，37℃ 培养 16～20 h。　　1.2 在划线平板上挑一个单菌落于盛有 20 ml LB 培养基的 250 ml 三角瓶中，37℃ 振荡培养到细胞的 OD600 值为 0.3～0.5 之间，使细胞处于对数生长期或对数生长前期。　　1.3 将培养物于冰溶中放置 10 min，然后转移到 2 个 10 ml 预冷的无菌离心管中，4000 r/min，0℃～4℃ 亡离心 10 min。　　1.4 弃上清，倒置离心管 1 min， 流尽剩余液体后，置冰溶 10 min。　　1.5 分别向二管加入 5 ml 用冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液悬浮细胞， 置冰浴中 20 min。 CaCl2 的纯度至关重要，不同厂家，甚至同一厂家不同批号的产品，均影响感受态的形成。　　1.6 4000 r/min，0℃～4℃ 离心 10 min 回收菌体， 弃上清。分别向二管各加入 1 ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液，重新悬浮细胞，　　1.7 按每份 200 ul 分装细胞于无菌小塑料离心管中，如果不马上用可加入终浓度为 10％ 的无菌甘油，置 -20℃ 或 -70℃ 存备用。　　制得的感受态细胞，如果在 4 ℃ 放置 12～24 h， 其转化率可增高 4～6 倍，但 24 h 后，转化率将下降。　　以上均严格无菌操作。　　2. 转化　　2.1 加 10 ul 含约 0.5 ug 自制的 pUC18 质粒 DNA 到上述制备的 200 ul 感受态细胞中。 同时设三组对照：不加质粒；不加受体；加已知具有转化活性的质粒 DNA。具体操作参照下表进行。　　2.2 将每组样品轻轻混匀后，冰浴 30～40 min， 然后置 42℃ 水浴热激 3 min， 迅速放回冰浴 1～2 min。　　2.3 向每组样品中加入等体积的 2×LB 培养基，置 37℃ 保温 1～1.5 h， 让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。　　2.4 每组各取 100 ul 混合物涂布于含氨苄青霉素（50 ug/ml）的选择平板上，室温下放置 20～30 min。　　2.5 待菌液被琼脂吸收后，倒置平板于 37℃ 培养 12～16 h，观察结果。

实验室化学试剂的种类繁多，化学药品大多具有一定的毒性和危险性，对其加强管理无疑是实验室管理人员的首要工作。接下来远慕生物与大家一起了解化学试剂管理注意事项，希望大家可以做个参考。1、易燃易爆化学试剂一般将闪点在25℃以下化学试剂列入易燃化学试剂，它们多是极易挥发的液体，遇明火即可燃烧。闪点越低，越易燃烧。使用易燃化学试剂时绝不能使用明火，加热也不能直接用加热器，一般不用水浴加热。在使用易燃化学试剂的实验人员，要穿好必要的防护用具，最好戴上防护眼镜。2、有毒化学试剂一般化学试剂对人体都有毒害，在使用是一定要避免大量吸入;在使用完公演试剂后，要及时洗手，洗脸洗澡，更换工作服，对于一些吸入或食入少量即能中毒致死的化学试剂，如:氰化钾、氰化钠及其氰化物;三氧化二砷及某些砷化物、二氯化汞及某些汞盐、硫酸、二甲酯等等。在使用时一定要了解这些试剂中毒时的急救处理方法，剧毒试剂一定要有专人保管，严格控制使用量。3、腐蚀性化学试剂任何化学试剂碰到皮肤、粘膜、眼、呼吸器官是都要及时清理，特别是对皮肤、粘膜、眼睛、呼吸器官有极强腐蚀性的化学试剂，如:各种酸和碱、三氯化磷、溴、苯酚、天水肼等，在使用前一定要了解接触到这些腐蚀性化学试剂的急救处理方法。如:酸溅到皮肤上要用碱液清洗等等。4、强氧化性化学试剂强氧化性化学试剂都是过氧化后是含有强氧化能力的含氧酸及其盐。如:过氧化氢、硝酸钾、高氯酸及其盐、高锰酸钾及其盐过氧化苯甲酸、五氧化二磷等等。再适当的条件下可放出氧发生爆炸，并且与有机物、铝、锌粉硫等易燃物形成爆炸性混合物，在使用时环境温度不高于30℃，通风要良好，并不要与有机物或还原性物质共同使用(加热)。5、遇水易燃试剂这类化学试剂有钾、钠、锂、钙、电石等等，遇水即可发生激烈反应，并放出大量热，也可燃烧，在使用时要避免与水直接接触，也不要与人体接触，以免灼伤皮肤。6、放射性化学试剂使用这类化学试剂时，一定要按放射性物质使用方法，采取保护措施。其它类的危险化学试剂，无论常用不常用，在使用前一定要了解它的安全使用注意事项，方可使用。

IgM和IgG的区别是：作用不同、功能不同以及生理变化不同。一、作用不同1、IgM是免疫球蛋白M，根据结构的不同将免疫球蛋白分为五种，IgM是人的免疫球蛋白之一。2、IgG是免疫球蛋白G是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%。其中40～50%分布于血清中，其余分布在组织中。二、功能不同1、IgG的功能作用主要在机体免疫中起保护作用，大多数抗菌、抗病毒；应对麻疹、甲型肝炎等，能有效地预防相应的感染性疾病。2、IgM以膜结合型（mIgM)表达于细胞表面，构成B细胞抗原受体（BCR)。分泌型IgM为五聚体，是分子量最大的Ig，沉降系数为19S，称为巨球蛋白，一般不能通过血管壁，主要存在于血液中。三、生理变化不同1、胎儿出生前可从母体获得IgG，在孕前期22~28周间，胎儿血IgG浓度与母体血IgG浓度相等，出生后母体IgG逐渐减少，到第3、4月胎儿血IgG降至最低，随后胎儿逐渐开始合成IgG，血清IgG逐渐增加，到16岁前达到成人水平。2、IgM也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，是机体抗感染的“先头部队”；血清中检出IgM提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。膜表面IgM是B细胞抗原受体的主要成分。只表达mIgM是未成熟B细胞的标志。

　　一、制片和染色的基本程序　　微生物的染色方法很多，各种方法应用的染料也不尽相同，但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。　　1、制片　　在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可。　　2、自然干燥　　涂片在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。　　3、固定　　标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：　　１）杀死微生物，固定细胞结构。　　２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。　　３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。　　固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。　　以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍，但是应当指出，在研究微生物细胞结构时不适用，应采用化学固定法。化学固定法zui常用的固定剂有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的饿酸等。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常用。应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的1—2%饿酸溶液，同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片，然后把培养皿盖上，经过1—2分钟后把标本从培养皿中取出，并使之干燥。　　4、染色　　标本固定后，滴加染色液。染色的时间各不相同，视标本与染料的性质而定，有时染色时还要加热。染料作用标本的时间平均约1—3分钟，而所有的染色时间内，整个涂片（或有标本的部分）应该浸在染料之中。　　若作复合染色，在媒染处理时，媒染剂与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力。一般固定后媒染，但也可以结合固定或染色同时进行。　　５、脱色　　用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌。常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液。　　６、复染　　脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被脱色部位形成鲜明的对照，便于观察。革氏染色在酒精脱色后用番红，石碳酸复红zui后进行染色，就是复染。　　７、水洗　　染色到一定的时候，用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。　　８、干燥　　着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉。　　９、镜检　　干燥后的标本可用显微镜观察。　　综上所述，染色的基本程序如下：　　制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检。　　二、染色方法　　微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用。故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。食品微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法。　　１、单染色法　　用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。在一般情况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。使用酸性染料时，必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料染色。　　单染色一般要经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤。　　染色结果依染料不同而不同：　　石碳酸复红染色液：着色快，时间短，菌体呈红色。　　　　美兰染色液：着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈兰色。　　草酸铵结晶染色液：染色迅速，着色深，菌体呈紫色。　　２、革兰氏染色法　　革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。　　细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。　　革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。　　另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。　　革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：　　１）涂片固定。　　２）草酸铵结晶紫染1分钟。　　３）自来水冲洗。　　４）加碘液覆盖涂面染1分钟。　　５）水洗，用吸水纸吸去水分。　　６）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。　　７）蕃红梁色液（稀）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。　　染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。

一、碱基类似物有些人工合成的碱基类似物能干扰和抑制核酸的合成。作用方式有以下两类：（一）作为代谢拮抗物，直接抑制核苷酸生物合成有关酶类。如6-巯基嘌呤进入体内后可转变为巯基嘌呤核苷酸，抑制嘌呤核苷酸的合成。可作为抗癌药物，治疗急性白血病等。此类物质一般需转变为相应的核苷酸才能表现出抑制作用。（二）进入核酸分子，形成异常RNA或DNA，影响核酸的功能并导致突变。5-氟尿嘧啶类似尿嘧啶，可进入RNA，与腺嘌呤配对或异构成烯醇式与鸟嘌呤配对，使A-T对转变为G-C对。因为正常细胞可将其分解，而癌细胞不能，所以可选择性抑制癌细胞生长。二、DNA模板功能抑制物（一）烷化剂：带有活性烷基，能使DNA烷基化。鸟嘌呤烷化后易脱落，双功能烷化剂可造成双链交联，磷酸基烷化可导致DNA链断裂。通常有较大毒性，引起突变或致癌。（二）放线菌素类：可与DNA形成非共价复合物，抑制其模板功能。包括一些抗癌抗生素。（三）嵌入染料：含有扁平芳香族发色团，可插入双链DNA相邻碱基对之间。常含丫啶或菲啶环，与碱基大小类似，可在复制时增加一个核苷酸，导致移码突变。如溴乙啶。三、RNA聚合酶抑制剂（一）利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。（二）利链菌素：与细菌RNA聚合酶b亚基结合，抑制RNA链的延长。

1.从当地的化学试剂店购买二级pH标准物质，几角钱一包，通常买三种：磷酸二氢钾（6.86pH）、磷苯二甲酸氢钾(4.00pH)、硼砂(9.18pH)，每包配有温度-pH表；2.使用新鲜无污染的蒸馏水；3.使用检定合格A级或B级250ml容量瓶，将少量蒸馏冲入标准物质袋子，溶解后倒入容量瓶；4.用少量蒸馏水反复洗几次标准物质袋子，残液倒入容量瓶；5.容量瓶加蒸馏水至250毫升处，反复摇晃几下后放几个小时后就可用了。PH值名词解释：pH值，亦称氢离子浓度指数、酸碱值，是溶液中氢离子活度的一种标度，也就是通常意义上溶液酸碱程度的衡量标准。这个概念是1909年由丹麦生物化学家Søren Peter Lauritz Sørensen提出。p代表德语Potenz，意思是力量或浓度，H代表氢离子（H）。有时候pH也被写为拉丁文形式的pondus hydrogenii。通常情况下（25℃、298K左右），当pH7的时候，溶液呈碱性，当pH=7的时候，溶液为中性。注意：pH值允许小于0，如 盐酸（10 mol/L）的pH为-1.pH值的计算公式如下：其中[H]指的是溶液中氢离子的活度（有时也被写为[H3O]，水合氢离子活度），单位为摩尔/升，在稀溶液中，氢离子活度约等于氢离子的浓度，可以用氢离子浓度来进行近似计算。在标准温度和压力下，pH=7的水溶液（如：纯水）为中性，这是因为水在标准温度和压力下自然电离出的氢离子和氢氧根离子浓度的乘积（水的离子积常数）始终是1×10^-14，且两种离子的浓度都是1×10^-7mol/L。pH值小于7说明H的浓度大于OH的浓度，故溶液酸性强，而pH值大于7则说明H的浓度小于OH的浓度，故溶液碱性强。所以pH值愈小，溶液的酸性愈强；pH愈大，溶液的碱性也就愈强。在非水溶液或非标准温度和压力的条件下，pH=7可能并不代表溶液呈中性，这需要通过计算该溶剂在这种条件下的电离常数来决定pH为中性的值。如373K（100℃）的温度下，pH=6为中性溶液。

　　磁珠提核酸　　磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤、磁珠法纯化DNA原理。　　核酸分离与纯化的原则　　核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。　　在分离核酸时应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。　　核酸分离与纯化的步骤　　大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。　　1. 细胞裂解：核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。　　(1)机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。　　(2)化学作用：在一定pH环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。而pH环境则由加入的强碱（NaOH）或缓冲液 (TE、STE等) 提供。在一定的pH环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂（EDTA等）可螯合维持核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。　　(3)酶作用：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶）以使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65℃及有EDTA、尿素(1～4mol/L) 和去污剂(0.5%SDS或 1%Triton X-100)存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。　　2.酶处理：在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解，以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶（DNase和RNase），DNase和RNase也用于去除不需要的核酸。　　3.核酸的分离与纯化：核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性,根据它们理化性质的差异,用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。　　(1)酚提取/沉淀法：核酸分离的一个经典方法是酚∶氯仿抽提法。细胞裂解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1体积) 混合液。依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀（适用于分离小分子量核酸）或简单颠倒混匀（适用于分离高分子量核酸）后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂，预先要用STE缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入pH5.0～5.5，终浓度为0.3M的NaOAc或KOAc后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～2.5倍体积的乙醇，经一定时间的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂（异丙醇、聚乙二醇(等）和盐类（10.0mol/L醋酸铵、8.0mol/L的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等）。不同的离子对一些酶有抑制作用或可影响核酸的沉淀和溶解，在实际使用时应予以选择。经离心收集，核酸沉淀用70%的乙醇漂洗以除去多余的盐分，即可获得纯化的核酸。　　(2)层析法：层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法在内的层析法。因分离和纯化同步进行,并且有商品试剂盒供应，而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下,核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。另外一些选择性吸附方法以经修饰或包被的磁珠作为固相载体,磁珠可通过磁场分离而无需离心,结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。该法分离纯化核酸,具有质量好、产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化等优点。　　(3)吸附法：玻璃粉或玻璃珠被证实为一种有效的核酸吸附剂。在高盐溶液中,核酸可被吸附至玻璃基质上,离液盐碘化钠或高氯酸钠可促进DNA与玻璃基质的结合。在该方法中,细胞在碱性环境下裂解,裂解液用醋酸钾缓冲液中和后,直接加至含异丙醇的玻璃珠滤板,被异丙醇沉淀的质粒DNA结合至玻璃珠,用80%乙醇真空抽洗除去细胞残片和蛋白质沉淀。最后用含RNase的TE缓冲液洗脱与玻璃珠结合的DNA，获得的DNA可直接用于测序。　　磁珠法纯化DNA原理　　磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。　　硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。　　离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。　　使用羧化磁珠同样可以分离纯化质粒DNA。该法在细胞裂解后，离心分离含质粒的水相，再加入羧化的磁粒，然后用PEG/NaCl沉淀，使目的DNA吸附至磁珠,最后磁场分离被吸附的DNA，经乙醇洗涤，用TE洗脱，可获得高产量的适用于毛细管测序的模板DNA。　　

　　单克隆抗体制备的原理：　　B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力、B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的、将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体.这种技术即称为单克隆抗体技术。　　单克隆抗体制备的过程：　　免疫动物　　免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。　　细胞融合　　采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。　　选择性培养　　选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。　　杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化　　在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。　　单克隆抗体的大量制备　　单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。　　(1)体内诱生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。　　(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。　　单克隆抗体制备的意义：　　用于以下各种生命科学实验并具有医用价值　　（1）沉淀反应：Precipitation reaction　　（2）凝集实验：haemaglutination　　（3）放射免疫学方法检测免疫复合物　　（4） 流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离.　　（5）ELISA 等免疫学检测　　（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的亲和力 .　　（7）免疫印记（western blotting)　　（8） 免疫沉淀：　　（9） 亲和层析：分离蛋白质　　（10） 磁珠分离细胞　　（11）临床疾病的诊断和治疗

1.专属性微生物定性检验的专属性是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。当替代方法以微生物生长作为判断微生物是否存在时，其专属性验证时应确认所用培养基的促生长试验，还应考虑样品的存在对检验结果的影响。当替代方法不是以微生物生长作为判断指标时，其专属性验证应确认检测系统中的外来成分不得干扰试验而影响结果，如确认样品的存在不会对检验结果造成影响。采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对象。2.检测限微生物定性检验的检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量。由于微生物所具有的特殊性质，检测限是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。例如控制菌检查中规定不得检出沙门菌，对检测限而言，是指每10g样品中能被检出的沙门菌的最低数量。检测限确定的方法是在样品中接种较低浓度的试验菌（每单位不超过5cfu），然后分别釆用药典方法和替代方法对该试验菌进行检验，以检出与否来比较两种方法的差异。试验菌的接种量须根据试验而定，以接种后采用药典方法50%的样品可检出该试验菌为宜。检测限验证至少应重复进行5次。对于同一种试验菌可采用卡方检验（χ2）来评价两种方法的检测限是否存在差异。3.重现性微生物定性检验的重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验地点、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。方法使用者应优先测定该验证参数。在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在检测限以上），采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或仪器）进行检验，釆用卡方检验（χ2）来评价两种方法的重现性是否存在差异。验证过程中，应关注样品的一致性。4.耐用性微生物定性检验的耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。方法使用者应优先测定该验证参数。与药典方法比较，若替代方法检验条件较为苛刻，则应在方法中加以说明。替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便使用者了解方法的关键操作点。