在过去十年中，核酸测序和质谱技术的进步使得能够geng快速，geng有信息地进行宏基因组，转录组，蛋白质组学和代谢组学的分析。在这里，我们回顾了多环境和人类微生物多组学分析的关键，讨论了为了解决当前缺陷未来的一些潜在的发展方向。微生物在大约35亿年前在地球上开始出现，zui终占领了地球生物圈的每个位置。虽然已知微生物负责对地球上的很多关键功能，例如碳和营养循环，以及决定地球植物和动物的健康和疾病，但目前认为存在的万亿微生物中有99％还没有被发现。此外，由于复杂的微生物群体多样性导致研究微生物群体中特定的功能变得非常复杂，微生物群体（定义为特定环境中存在的微生物及其集体遗传物质的总体，例如居住在土壤或人类肠道中的所有微生物）。幸运的是，过去几十年的技术进步大大促进了复杂微生物及其功能的研究。这里我们将讨论与核酸测序和质谱（MS）分析相关的进展，这些分析是的我们能够分析环境和体内的微生物群体。核酸测序核酸测序技术的速度和通量的惊人增长促进了微生物研究进展。特别是下一代（NextGen）测序有了ge命性的发展，它们已经超过了近三十年（1977年至2005年）占主导地位的传统Sanger测序方法。使用基于Sanger双脱氧核苷酸的连锁终止方法对单个细菌基因组进行测序以前是一项需要多年才能完成的重大努力。使用Sanger方法完全测序的第1个细菌基因组是1995年的嗜血杆菌流感（1997年完成了大肠杆菌）。目前，由于可用快速和便宜的NextGen测序平台，现在可以在几个小时内完成细菌基因组测序。单分子测序技术新兴测序技术包括基于单分子的DNA测序仪可以geng快的进行微生物基因组的研究。一个例子是来自PacBio的单分子实时（SMRT）技术，其依赖于拴住的DNA聚合酶和零模式波导，以通过少量液体引导光能。 PacBio目前提供长度为10-25 kbp的DNA序列读数和每个SMRT小室?300 Mbp。由于使用束缚聚合酶，PacBio平台可以检测异常由于聚合酶的摆动，可以直接读取DNADNA修饰情况。牛津Nanopore测序平台是另一个新兴和有希望的单分子测序仪。与目前的平台不同，牛津平台不依赖于合成测序，而是通过穿过Nanopore直接对核酸分子进行排序。 Oxford Nanopore可以检测到像PacBio platorm的DNA修饰，平均读取长度为?1-2 kbp，以及任何测序仪（> 90 kbp）提供的zui长读取长度。牛津Nanopore测序器的主要优点是其拇指大小，可以在个人实验室电脑上用实时使用无线技术进行分析。测序复杂微生物群落DNA测序技术的改进使许多发现世界各地和我们自己身体中的微生物成分和潜在功能。大部分关于微生物的信息都来自NextGen测序的16S rRNA基因作为细菌和古细菌的系统进化标记。另外，总DNA（即基因组学）的NextGen测序已经可以确定在不同环境中与特定微生物群体相关的功能基因。 例如，一些研究已经定义了在深水地平线溢油在墨西哥湾和解冻yong久冻土之后的水和沉积物样品中的功能基因组成。 然而，绝大多数这些基因没有已知功能，反映了尚待发现的环境微生物的巨大多样性和生化潜力。宏转录组学Metatranomics测序总mRNA（即，metatranomics）揭示哪些基因被表达通过空间和时间尺度的特定生物体。 Metatranomics提供了微生物基因在各种生态系统中的表达知识，包括酸矿排水、肠、海洋和土壤。例如，吉尔伯特等人使用宏转录组来确定英吉利海峡海洋微生物群的季节性表达模式。zui近，我们使用Metatranomics来推断土壤基因组中哪一个识别的生物体在土壤中有活性。虽然Verrucomicrobia在被调查的土壤中非常丰富，但很少的mRNA转录本映射到其基因组，这表明它们实际上是转录静止的。相比之下，Firmicutes基因组被发现是转录活跃的。这揭示了Metatranomics在验证宏基因组学和了解微生物群落不同成员的相对活动方面的效用。基于质谱法的蛋白组学和代谢组学测量虽然DNA测序的进展使得能够geng好地了解微生物中的微生物系统发育和功能基因组成，但也希望了解在特定条件下产生哪些蛋白质（即宏蛋白质组学）和代谢物质（即代谢组学），以及扰动如何影响微生物功能。微生物在不同样品中产生的蛋白质和代谢产物的测量主要通过MS实现。在微生物样品的MS分析中，感兴趣的生物分子在源中离子化，根据其在质量分析仪中的质荷比进行分离，zui后检测，提供具有高灵敏度，分辨率和产量的宏蛋白质组学或代谢组学测量。1984年电喷雾电离（ESI）的引入大大增加了MS测量用于评估的效用。 ESI的一个挑战是执行它在大气压力（760乇）下，质量分析仪通常在10-6和10-11乇之间的压力状态下工作。这种压力差异超过九个数量级，如果源和质量分析仪区域耦合不好，则会发生巨大的离子损失。因此，在过去二十年中，已经优化了使用离子漏斗和透射四极区域的界面设计，以重新聚焦离子，同时不断降低压力。这些领域的改进导致离子损失减少和灵敏度geng高。然而，分析复合微生物中的生物分子由于高动态范围和给定样品中存在数千个组分，MS仍然非常困难。这些挑战需要在分辨率，精度和MS / MS速度方面改进质量分析仪。四极杆，离子阱，飞行时间和离子回旋共振（ICR）质谱分析仪构成了2005年引入轨道曝光仪之前使用的大多数质量分析仪。orbitrap技术为实验室提供了geng高的分辨能力，geng为经济实惠。orbitrap技术在过去十年的进步包括geng高分辨率的测量和geng快的MS / MS，这里包括linear ion trap （低分辨率）和orbitrap（高分辨率）的扫描速率。zui大分辨率和MS扫描速度过去15年显示，这两个特征都已被优化，以便在每个测量中获得zui佳的生物分子覆盖和准确性。然而，由于微生物组织样品的复杂性，还采用了一维和二维液相色谱分离和气相离子迁移光谱等附加技术来增加鉴定的蛋白质和代谢物的数量。这些分离技术在检测前降低了样品的复杂性，由于每个微生物组分样品中存在许多分子，因此离子阱和检测器的抑制较少，并且可以使给定样品中的蛋白质和代谢物geng高的覆盖范围。

    1.3.2 染样品法 同时制备四块不加染料的1％琼脂糖凝胶。待凝胶冷却凝固后，放入同一电泳槽中。将分别将0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000＋2 000与4种染料混合，避光10 min.然后于不同泳道中加入。使用5V/cm的电压进行电泳，最后用凝胶成像系统观察拍照。    1.3.3 后染法 同时制备四块不加染料的1％琼脂糖凝胶。待凝胶冷却凝固后，放入同一电泳槽中。于不同泳道中分别加入0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000＋2 000.使用5V/cm的电压进行电泳。电泳后将凝胶分别浸入用1×TAE稀释的4种不同染液中。按照说明书要求，GoldViewna II、GoldView、DNA Green及EB避光染色的时间分别为60 min、30 min、30 min、30 min.DNA Green染色完毕后还需用1×TAE脱色30 min.最后用凝胶成像系统观察拍照。    2 结果与分析    2.1 染胶法    染胶法的结果表明四种染料使用该法的灵敏度均最高，其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为0.5 ng；EB能检测到的DNA含量约为1 ng；GoldView与DNA Green能检测到的DNA含量约为2 ng.    2.2 后染法    后染法的结果表明四种染料使用该法的灵敏度低于染胶法。其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为1ng；EB能检测到的DNA含量约为2 ng；DNA Green与GoldView能检测到的DNA含量约为5 ng.图2 使用后染法比较4种核酸染料染色DNA的灵敏度    2.3 染样品法    染样品法的结果表明四种染料使用该法的灵敏度最低。其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为2 ng；EB与DNA Green能检测到的DNA含量约为5 ng、GoldView能检测到的DNA含量约为10 ng.    3 讨论    GoldViewna II是国内近年来推出的新型核酸染料，与SYBR Green I同属花青类染料。SYBR Green I是几年前推出的一种高灵敏度［3］且不具有强致突变性［4］的核酸染料，但由于其高昂的价格限制了它的广泛使用。上述实验表明GoldViewna II的灵敏度高，同时具有花青类染料不具强致突变性的优点，价格也比SYBR Green I便宜数倍。虽然其稳定性不如EB［3］且反复冻融效果变差，但只需要-20℃避光保存和分装使用即可。    DNA Green是国内最近才推出的新型核酸染料。它的灵敏度与EB相当但背景略高于EB，但该染料的价格比GoldViewna II还便宜且稳定性比较好，4℃避光保存即可。    GoldView是国内较早使用的新型核酸染料，它的灵敏度比EB略低且背景太高。不适合做微量的DNA检测。但该染料稳定性也比较好，4℃避光保存即可，价格是这三种染料中最便宜的。    这些新型核酸染料均可替代EB广泛使用，从而减少大量使用EB对人体的危害和对环境的污染。使用者可以根据自己的需要选择合适的染料。    染色方法比较可以看出：染胶法的检测灵敏度最高；后染法的检测灵敏次之；染样品法的检测灵敏度最低，不适合做微量DNA检测。此外，后染法用于新型核酸染料很不合适。花青类染料用于后染法需要将染料用1×的电泳缓冲液稀释到聚丙烯容器中，在避光条件下该溶液最多可以在24小时内被使用且染2～3块凝胶后其灵敏度会降低，结果略。这样的结果导致染料的巨大消耗，成本太高。DNA Green用于后染的工作浓度为10×，也就是染料用量提高10倍即成本增加10倍，而且在染色半小时后，由于其高背景还需要脱色半小时，延长了实验时间。既往有研究推荐使用后染法的原因是染色的DNA带型平直不扭曲［2］。我们的实践经验得出，电泳时控制合适的电压和上样量，新型核酸染料使用染胶法也能达到同样效果。故使用新型核酸染料染色DNA时推荐采用染胶法。

    定量pcr较半定量准确，可实时定量。理论上有1个copy的差别就能区分开。如果你只想看看大致趋势，半定量不失为一种快速的方法。现在一些高级别的刊物上还有半定量的结果，如plant cell, plant physiology, genome biology等。    半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitatie reerse transcription and polymerase chain reaction ,sqrt-pcr）是近年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方法，通过mrna反转录成cdna，再进行pcr扩增，并测定pcr产物的数量，可以推测样品中特异mrna的相对数量。以半定量rt-pcr为基础建立起来的mrna含量测定技术，较含内标化的rt-pcr定量测定的mrna的方法更为简便可行。这种方法不另设‘内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。    步骤，1。抽提rna，2。反转录获得cdna，3。以cdna为模板做pcr!    注意：步骤1，rna抽提质量一定要好，注意污染。内参的选择，常用的有βactin和gapdh俩中。步骤3，半定量rt-pcr应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！    定量ｒｔ－ｐｃｒ（quantitatie reerse transcription and polymerase chain reaction ,qrt-pcr）是在用一步法或两步法，在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。有相对定量和绝对定量两种分析方法，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。另外，与传统的pcr技术相比，real-time q-pcr的不足之处是：（1）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；（2）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了real-time q-pcr的复合式（multiplex）检测的应用能力；（3）目前real-time q-pcr实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。

    RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。    RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。    实验步骤：    Trizol法RNA提取步骤    1、提取总RNA    2、逆转录反应    3、PCR反应    以下实验步骤仅供参考：    1 样品RNA的抽提    ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。    ②两相分离    每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。    ③RNA沉淀    将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm    离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。    ④RNA清洗    移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。    ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。    ⑥溶解RNA沉淀    溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。    2 RNA质量检测    1）紫外吸收法测定    先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液    浓度和纯度。    ① 浓度测定    A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40    μg/ml。具体计算如下：    RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260=0.21    RNA 浓度=0.21 ×100 ×40 μg/ml=840 μg/ml 或 0.84 μg/μl    取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：    35 μl × 0.84 μg/μl=29.4 μg    ②纯度检测    RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。    2）变性琼脂糖凝胶电泳测定    ①制胶    1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3    M)。    10×MOPS电泳缓冲液    浓度    成分    0.4M    MOPS，pH 7.0    0.1M    乙酸钠    0.01M    EDTA    灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25    μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。    ②准备RNA样品    取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。    ③电泳    上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。    ④紫外透射光下观察并拍照    28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。    3样品cDNA合成    ①反应体系    序号    反应物    剂量    1    逆转录buffer    2μl    2    上游引物    0.2μl    3    下游引物    0.2μl    4    dNTP    0.1μl    5    逆转录酶MMLV    0.5μl    6    DEPC水    5μl    7    RNA模版    2μl    8    总体积    10μl    轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。    ②混合液在加入逆转录酶MMLV    之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。    ③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。    4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR    ①β-actin阳性模板的标准梯度制备    阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。    ②反应体系如下：    标准品反应体系    序号    反应物    剂量    1     SYBR Green 1 染料    10μl    2    阳性模板上游引物F    0.5μl    3    阳性模板下游引物R    0.5μl    4    dNTP    0.5μl    5    Taq酶    1μl    6    阳性模板DNA    5μl    7    ddH2O    32.5μl    8    总体积    50μl    轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。    管家基因反应体系：    序号    反应物    剂量  1    SYBR Green 1 染料    10μl    2    内参照上游引物F    0.5μl    3    内参照下游引物R    0.5μl    4    dNTP    0.5μl    5    Taq酶    1μl    6    待测样品cDNA    5μl    7    ddH2O    32.5μl    8    总体积    50μl    轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。    ③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。    5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板    ①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。    反应体系：    序号    反应物    剂量    1    10×PCR缓冲液    2.5 ul    2    MgCl2溶液    1.5 ul    3    上游引物F    0.5ul    4    下游引物R    0.5ul    5    dNTP混合液    3ul    6    Taq聚合酶    1ul    7    cDNA    1ul    8    加水至总体积为    25ul    轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。    35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72oC延伸5分钟。    ②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。    ③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释:    设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。    6 待测样品的待测基因实时定量PCR    ①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。    体系配置如下：序号    反应物    剂量    1    SYBR Green 1 染料  10 ul    2    上游引物    1ul    3    下游引物    1ul    4    dNTP   1ul    5    Taq聚合酶    2ul    6    待测样品cDNA    5ul    7    ddH2O   30ul    8    总体积    50ul    轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。    ②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃    1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表    引物设计软件：Primer Premier    5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

经常有用户反映“细胞冻存与复苏遇到了问题”，“如何握住原力，让你的细胞乖乖沉睡又满血复活？”远慕生物为此做了以下总结：选 好 细 胞 冻 存 液 是 基 础使用动物血清常常会遇到很多问题，例如：病毒感染、其他动物源的污染。使用无血清制品培养与冻存细胞，可以消除这方面的隐患。此外，无血清冻存液可以确保细胞在化学成分固定的条件下生长，更进一步确保细胞冻存时的条件稳定。 慢 慢 做 冷 冻若您养的是贴壁细胞，请先将细胞消化下来；若是悬浮细胞，请直接按以下步骤进行：1. 以200-300g离心3分钟，弃去上清，收集细胞。2. 用bi无血清冻存液将细胞重悬（不需回温），将细胞密度调整为3~5x106 cells/ml，添加到冻存管中（一般每管1ml）。3. 建议将含有细胞悬液的冻存管放进渐进降温盒或是保温杯中，置于-80°c冰箱6小时以上或是过夜（或不需要程序降温)。4. 将冻存管迅速移到液态氮中保存。5. 冻存24小时后，建议检测细胞存活率。细 胞 复 苏 要 迅 速1. 将细胞冻存管由液态氮中取出，置于室温回温，不用水浴溶解。此时可准备新鲜培养 基、无菌15ml离心管、培养瓶。2. 在生物安全柜内，直接以少量培养基反复冲融，使细胞团块化冻。3. 先在无菌15ml离心管中加入5ml培养基，再将化冻的细胞悬液加入离心管中。以200~300g，3分钟离心收集细胞。4. 倒去上清液，重悬细胞，移到培养瓶中培养。bi无血清细胞冻存液不含动物成份细胞冻存与复苏后，平均活细胞回收比例超过90%serum-free cell freezing medium无血清细胞冻存液，无血清培养的细胞应该使用无血清的冻存液保存，以保持无血清培养体系的完整。本冻存液不含蛋白及动物组分，主要成分为dmso和甲基纤维素。cryostem acf freezing media无血清干细胞冻存液（optimized for stem cell），cryostem对所有种类的细胞都有非常好的冻存效果，该产品经过验证，特别适用于人胚胎干细胞和人原代细胞的冻存。用cryostem冻存融解后，细胞表现出极佳的复苏率、生长活性、贴壁性和传代能力。msc freezing medium无血清间充质干细胞冻存液，即用型溶液，特别适用于人类间充质干细胞冻存，用msc冻存液冻存融解后，细胞表现出极佳的复苏率、生长活性。

ihc 实验从操作上来讲并不算难，但是由于操作步骤较多，因此造成实验结果不理想的因素较多，曾有人总结出「九九八十一难」，现在我们就 ihc 操作常遇到的一些问题及其解决方法进行汇总，希望能解决你的 ihc 问题。1. 抗体浓度过高一抗浓度过高是造成切片染色深常见的原因之一。解决办法是在每次使用新抗体前对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，包括即用型的抗体也同样需要进行测试，不能只简单的按照说明书进行染色。2. 抗体孵育时间过长或温度较高为了避免这种情况出现，相关人员应当严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时，而是 30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。3. dab 变质和显色时间太长dab 最好现用现配，如有沉渣，应进行过滤后再使用。配制好的 dab 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与 dab 产生反应，从而降低 dab 的效力；像未用完的 dab 存放在冰箱里，需要的时候再取用的这种行为也是不可取的。dab 的显色最好在显微镜下监控，待达到理想的染色程度时，应立即终止反应。当由于染色片太多或使用染色机，导致无法及时进行终止操作时，也应该尽量对新的，或使用频率不高的抗体，进行显色时的监控，避免显色时间过长。4. 组织变干修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。这就要求相关人员在操作过程中要做到仔细认真，并采用 dako 笔或 pap pen 在组织周围画圈，达到有效的避免液体流失，提高操作速度的效果。5. 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间大于 24 小时具体原理不清楚，但现象确实存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在 4oc 冰箱过夜，对结果无明显影响；如果放在室温，特别是炎热的夏天，则会出现背景着色。因此，不可存放时间太长。6. 一抗变质、质量差的多克隆抗体由于过期的抗体会导致切片不显色或者背景着色，所以应当注意一抗的有效期。用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。7. 忘记血清封闭在免疫组化中使用封闭血清，可以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。封闭血清一般选择和二抗来源相同的，因此常用山羊血清。有时也会使用小牛血清、bsa、羊血清等，但不可与一抗来源相同。8. 操作过程中脱片（1）可能是黏附载玻片质量的问题，建议尝试更换载玻片。（2）组织切的不好，可能是切片机刀片较钝造成切片切的厚、不均匀，或者是切片机操作者手法不熟练等。（3）可能是组织的问题，比如癌症组织有坏死情况时，也容易造成脱片。（4）烘烤结果不理想，可能是烘烤时间较短或温度不够等。（5）操作时甩动幅度过猛，有脱片嫌疑的切片最好不甩或轻轻甩，可用卫生纸从边缘上慢慢吸水。（6）修复过程出现问题，比如在抗原修复时，高压时间过长，或者放进 100 度修复液时不够平稳，也容易出现脱片的情况。此外，用 edta 修复比柠檬酸更容易脱片。（7）一旦见到有组织漂起来，在操作时就要更加谨慎，使用 pbs 的时候尽量泡，不要冲。

实验介绍(a) MTTMTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料。活细胞在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下四唑环开裂，生成蓝色的甲月替结晶并沉积在细胞中，甲月替结晶的生成量仅仅与活细胞数目成正比（死细胞中的琥珀酸脱氢酶消失，不能还原MTT）。还原生成的甲月替结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺、20%的十二甲基磺酸钠（PH 4.7）或10%酸化十二甲基磺酸钠（PH 4.7）的溶液中溶解。利用酶标仪测定490nm波长处的光密度测出OD值，即反映活细胞数目。也可利用DMSO（二甲基亚砜）来溶解。用DMSO之前要尽量去掉培养液，一遍DMSO溶解甲月替颗粒，进行比色测定。1．取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10％小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）2．用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。3．吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。4．每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。5．每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10％ SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。(b) CCK-8检测细胞增殖（活力）：CCK-8（cell-counting kit-8）检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原，WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazangeng易溶解。且WST-8相较XTT和MTS化学性状geng稳定， 因此实验结果相对geng加稳定。此外，WST-8相较MTT、XTT，线性范围相对宽，灵敏度geng高。 当细胞增殖得越多越快，则formazan产生量越多，颜色越深；反之，当内外因造成的细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖（活性）相关数据。(c) XTT：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臢产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲臢产物的吸光度与活细胞的数量成正比。用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在OD450处有吸收峰。优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。应用范围：生物活性因子的活性检测；大规模的抗肿瘤药物筛选；细胞增殖实验；药物或基因导致的细胞毒性试验；药敏试验等。服务周期：3周。

由于制备单克隆抗体的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有：1、污染包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是单克隆抗体制备工作中zui辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。2、融合后杂交瘤不生长在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素：(1)牛血清的质量太差，用前没有进行严格筛选；(2)HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足；(3)骨髓瘤细胞污染了支原体；(4)EG有毒性或作用时间过长。3、杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。之前提出的“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要：要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。三不要：不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。4、杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

抗体制备是免疫学研究的基础。制备一个合适的抗体将会决定着免疫实验的成败。抗体制备过程涉及到很多个方面，比如免疫原如何设计、免疫过程的优化、目的抗体筛选、抗体纯化、应用鉴定等。接下来我们将会对一些关键的技术难点进行解答。1. 免疫原是如何设计的？有什么原则？解答：免疫原可以是天然蛋白也可以是重组蛋白，甚至是多肽、DNA，所以免疫原的设计主要从两个方面考虑：免疫原分子的特点抗体应用。结合免疫原分子的特点，抗体的应用可以提供预计识别的表位类型，确定使用哪种类型的免疫原和免疫原的序列。2. DNA免疫的原理和方法是什么？解答：将含有编码某种抗原基因序列的质粒载体作为免疫原，直接导入动物细胞内进行表达，诱导宿主细胞对该抗原蛋白产生免疫应答，产生针对目的蛋白的抗体，再通过杂交瘤融合或基因文库筛选获得单克隆抗体，或通过血清纯化获得多克隆抗体。DNA免疫方法，目前主要有3种：肌肉注射加电转、静脉高压注射法和基因枪肌肉注射。3. 对于同一种抗原，人源的噬菌体库筛出的抗体和人体分离的抗体有什么区别？解答：应该说各有优势。人源的噬菌体库筛选出的抗体，在一些情况下，可能会产生一些非天然存在的抗体，重链和轻链的配比不一定是天然的。从人体B细胞获得的抗体，是直接分离和测序筛选的，抗体的重轻链处于天然状态。当然，我们也不能说噬菌题库筛选的抗体就不好，因为一般更多的是评价它的亲和力和免疫应用，以及后续的生产表达及结构等，需要综合评价。4. 噬菌体展示淘洗固相筛选和液相筛选效果有差异吗？解答：结合远慕生物多年的抗体筛选经验，一般会首选固相淘选，因为这种方法比较简单，不需要使用生物素标记。如果这种筛选方法没有筛选到我们感兴趣的抗体的话，我们也会过渡到液相筛选的方法。5. 噬菌体淘洗怎么保证库的多样性？筛选上有什么注意的原则？解答：淘洗过程中很多因素都会影响多样性的结果，比如方法的选择、固相、液相等。其次pH值是淘洗中一个重要参数。还有就是淘洗的力度和洗脱的时间也对多样性结果有很重要的影响。需要多个方面进行试验条件的优化。6. 应用于IHC的单抗开发，在抗原设计上，有什么侧重点？解答：因为IHC的实验过程涉及到了对它本身抗原的一个变性的过程，或者说是天然细胞里面靶点的变性过程。所以在设计的时候，我们会倾向于设计成一个线性的表位，所以一般来说我们倾向于使用多肽这种免疫原的方式，来进行免疫组化抗体的开发。7. 噬菌体展示与杂交瘤制备抗体比较，哪种更好？解答：这个可能更多是考虑噬菌体展示和杂交瘤的优缺点。首先从周期上来说的话，相对来说，噬菌体的方式时间更短一些，另外从筛选上来说的话，噬菌体展示的方法比较稳定，而且比较简单一些，操作上具有优势。但是杂交瘤的方法，毕竟是从一种类似于细胞内部产生抗体的方式，所以在某些方面的话，它产生的抗体更多的是天然的重链与轻链的配比，这一点，在噬菌体上不能做到百分之百。8. 人源化抗体的制备噬菌体展示和转基因小鼠平台的优势比较？解答：噬菌体展示技术具有周期短、准确、不受氨基酸位点限制等特点，能够通过多种淘洗和检测方式对不同表位进行筛选，生产成本相对低廉。不足之处在于受到库容、表达偏好性和展示效率的影响，抗体多样性会存在一定程度的限制，同时通过表面重塑等方法对提高人源化抗体亲和力的成功率并不稳定。转基因小鼠制备的全人源抗体，不仅大大减少了潜在的免疫原性，而且由于抗体是在体内产生，经历了正常的装配和成熟过程，从而保证抗体具有较高的靶亲和力。大部分转基因小鼠获得的单克隆抗体亲合力在0.1-10nM之间，也有些转基因小鼠单抗能达到皮摩尔级或者次皮摩尔级。但其不足之处在于前期研发投入的周期长，成本高。而且也由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单抗具有鼠糖基化模式，使得这些单抗最终不是全人源化模式。9. 抗体如何进行长期保存，并保持效价的稳定？解答：一般情况下，抗体属于比较稳定的蛋白。所以多数情况下，厂家会推荐-20℃~-80℃长期保存即可，为了避免反复冻融尽量分装后保存。此外，也可以通过加甘油避免反复冻融。当抗体浓度低时加BSA减少抗体吸附起稳定剂的作用。对于一些少数抗体，需要通过优化筛选缓冲液已达到保持抗体稳定的效果，优化包括盐浓度、pH、缓冲体系等。

血清、血浆、尿液、唾液和细胞的收集和处理方法：1.血清：用无菌管收集，室温血液天然凝聚10-20分钟，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如出现堆积，应再次离心。2.血浆：应根据标本的要求挑选EDTA、肝素钠或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有堆积构成，应该再次离心。3.尿液：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有堆积构成，应再次离心。4.唾液：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有堆积构成，应再次离心。1.培育的细胞A、动物细胞：用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度到达100万/ml左右。经过重复冻融（假如重复冻融，破碎效果欠好，就选用超声波破碎），以使细胞损坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有堆积构成，应再次离心。B、植物细胞：用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度到达100万/ml左右，置于冰盒上，用超声破碎仪，设置破碎2s，冷却30s的方法，充分破碎细胞，以使细胞损坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有堆积构成，应再次离心。2.组织的细胞切割标本后，称取1g组织，参加9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手艺或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗刷堆积的细胞三遍。再用上述的细胞破碎方法破碎细胞。远慕生物是一家研究经销生化试剂的金牌代理商，我司拥有一支雄厚的技术团队，为客户提供完善的售前售后服务，及真实的实验技术zhi持。您有任何问题均可电询订购我司试剂盒,生物试剂等产品。

“母亲节”即将到来之际，公司为感恩母亲节现大部分elisa试剂盒6折起订购！！！更多试剂优惠可以致电客服姐姐！活动规则:1、本次活动不限用户种类，所有人都可参与参与；2、数量有限，先到先得。3、 所赠产品与购买产品享受相同的技术支持服务.4、活动zui终解释权归我司所有。活动时间：2020年5月8日——2020年5月16日

无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。(1)恒定的细胞生长温度：37℃.(维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。)(2)ph ：7.0-7.4 .(过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。)(3)渗透压 ：细胞内外可溶于水的物质比例和种类决定细胞的膨胀与收缩程度，因为细胞膜是半透膜，只允许对自己有利的物质通过。同一物质在细胞内外的分布的数量不同，当某一种极溶于水的物质在细胞外浓度过大时，有可能导致细胞干瘪死亡，这些物质在细胞内过多时导致细胞过量吸水膨胀。细胞膜调节渗透压的能力是有限的。(4)营养物 ：营养物和水一起，又叫细胞培养液，培养液中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。营养物包括：n 源、c源，这些物质与提供能量有关；无机盐、维生素、激素，这些物质与代谢调节控制有关。细胞培养液的设计一直是细胞离体培养技术的关键。理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的ph、渗透压、营养物、调节物质的全部需要。(5)水 ：需要经过灭菌锅灭菌才能放入培养箱水槽(6)无菌条件 ：与实验室的硬件设备和个人操作有很大关系。(7)合适的气体环境：气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。动物细胞需要不断供给氧气和排除二氧化碳，植物细胞与此相反。

放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。放线菌的菌落特征是：A. 纺锤形 B. 不规则 C. 波状 D. 辐射状霉菌，是丝状真菌的俗称，意即"发霉的真菌"，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌；曲霉菌检测广泛使用Bio-Rad曲霉菌抗原检测试剂盒(PlateliaTM Aspergillus Ag)。区别放线菌和霉菌的方法：霉菌属于真菌,放线菌属于细菌。 放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，放线菌菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。

1、玻璃器皿的消毒和清洁⑴新购玻璃器皿的处理新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%～2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。⑵污染玻璃器皿的处理①一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%shi炭酸浸泡，再煮沸30分钟，亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗至无肥皂为止。zui后用少量蒸馏水冲洗。②细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌15～30分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。③吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二jia苯祛污。⑤染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。2、无菌器材和液体的准备将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120℃的干燥箱中干燥灭菌2小时，取出备用。对于手术器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压蒸气灭菌法，即在15磅的条件下，加热20分钟。而对于MEM培养液、小牛血清和消化液等需用G5或G6滤器负压抽滤后使用。3、在无菌操作过程中，zui重要的是要保持工作区的无菌、清洁。因此，在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的止血钳、镊子等。培养瓶应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后1/3处，戴上胶皮乳头，并用酒精灯烧烤之后再吸液体。4、常用清洁液的配制法⑴重铬suan钾清洁液：可根据不同需要，选用下列的任何一种浓度。先将重铬suan钾溶于水中，再慢慢加入浓硫酸。注意，此时可产生高热，应防止容器破裂。重铬suan钾清洁液除污力强，腐蚀性大，应避免接触皮肤和衣服。为防止吸收空气的水分而变质，此液应贮存于带盖的容器中。如清洁效力较差，可再加入少量重铬suan钾及浓硫酸，还可继续使用。直到液体变蓝绿色，即不能再用。配制重铬suan钾清洁液时，宜用耐高温的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿时，应特别注意防止产生高热而破裂，切忌用量筒来配制。⑵磷酸三钠将其配成5%～10%水溶液，可用于洗涤玻璃器皿上的油污，但经常使用腐蚀玻璃，使器皿表面模糊、毛糙。

对于研究细胞的科学人士来说，血清都不会陌生，其中胎牛血清是实验操作的常客。一般而言，胎牛血清是指怀孕5-8个月的母牛被屠宰后，发育未完全的胎牛心脏穿刺采血后，通过一系列工艺处理最终获得。此时胎牛血中含有特殊的生长发育因子，一旦胚胎发育完全这些因子自动消失。胎牛血清具有极为重要的作用，其包括：1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。2.提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。5.起酸碱度缓冲液作用。6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。胎牛血清是品质的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。选择国际一流的优质胎牛血清WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家，并应具备适当的监测系统。2.有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。3. 证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。4. 血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。5. 无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。6. 对细胞有良好的支持繁殖作用。《中国生物制品主要原辅料质控标准》2000年版我国对牛血清的质量中提出比较严格的标准要求：包括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。一款来自澳洲的Ausbian胎牛血清在市场上颇受欢迎。它具有精选内毒素极低、产量大于1600瓶（500毫升）的血清批次，满足干细胞、基因敲除、原代培养、细胞典藏、长期传代等各类细胞的培养要求；完整的检测报告及灭病毒服务，为各类临床相关项目的申报提供完整支持等特点。

2020五一放假安排五一放假通知来啦！在这春暖花开草长莺飞的日子里我们迎来了五一小长假，今年五一连休5天，放假时间从5月1日至5日。4月26日(星期日)、5月9日(星期六)上班。五一假期即将到来，这个五一你准备怎么过？2020年五一高速免费时间5月5日24时结束    目前国内疫情并未完全结束，国际疫情形势较为严峻，小编提醒准备五一出行的朋友还是要小心谨慎，出去玩的时候切勿放飞自我，记得戴口罩做好个人防护，牢记莫扎堆、莫聚集，保护好自己和家人，才能享受美好的五一假期！

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是鉴定样本中单个细胞转录组的主流方法。为了确保人们在实验过程中使用最佳方法，由西班牙国家基因组分析中心（CNAG-CRG）领导的国际研究团队对13种单细胞RNA测序方法开展了性能评估。单细胞转录组学开启了一个新时代，让人们能够无偏倚地记录细胞表型。单细胞RNA测序实验在不断扩展，如今每次实验可以分析数千个细胞，从而全面地了解细胞组成。最近，研究人员正尝试利用单细胞RNA测序来绘制整个细胞谱系、器官甚至生物体的细胞图谱，其中最引人关注的是人类细胞图谱（HCA）计划。然而，人们在开展细胞图谱分析之前也存在一定的担忧。过去，基因组分析缺乏基准测试，这导致实验后期出现了一些问题：不同的研究小组使用了不同的方法，并得出了不同的结果。考虑到这一点，许多致力于单细胞RNA分析的小组决定联合起来评估不同的方法，以确保结果有着良好的重现性。研究团队采用13种方法来分析一组精选的细胞。这组细胞一共大约有3,000个，满足四个条件：它包含多种细胞类型；某些细胞非常相似，基因表达只有细微的差异；细胞具有可追踪的标志物；并且包含不同物种的细胞。这组细胞主要是人外周血细胞（60%）和小鼠结肠细胞（30%），但也包含少量HEK293T、NIH3T3和MDCK细胞。他们评估的单细胞RNA测序方法包括：CEL-Seq2、MARS-Seq、Quartz-Seq2、gmcSCRB-Seq、Smart-Seq2、ddSEQ、ICELL8、C1HT-Small、C1HT-Medium、Chromium、Chromium(sn)、Drop-seq以及inDrop。这些都是耳熟能详的单细胞RNA测序方法。研究人员根据检测细胞图谱和标志物表达的精确度来评估这些方法。他们使用了六个关键指标：基因检测、转录特征表达的总体水平、细胞簇的准确性、分类概率、数据整合后的细胞簇准确性以及可混合性。通过这些研究，他们发现日本理化学研究所（RIKEN）开发的Quartz-Seq2方法很准确，在基准测试中得分最高，紧随其后的是CEL-Seq2和Chromium。开发Quartz-seq2的负责人Itoshi Nikaido称：“我们很高兴我们的方法被评为整体最佳。我们计划进一步改进它，以便人们能够在人类细胞图谱等项目中取得最佳结果。”领导这项研究的西班牙科学家Holger Heyn博士表示：“这些方案表现出明显的性能差异，我们希望这项工作有助于制定标准和指南，从而有助于人类细胞图谱及单细胞研究界生成高质量的数据集。”

免疫传感器tlr8在防止病原体入侵人体细胞方面发挥了重要作用。rnaset2和rnase2将细菌的rna切割成小片段，相当于指纹特征。通过这种方式，tlr8能够识别出危险的病原体并采取措施。这项成果于本周发表在《immunity》杂志上。对于人类细胞而言，引起疾病的细菌或病原体当然是不受欢迎的。当它们入侵细胞时，这些细胞通过释放活性氧来驱赶它们。随后细胞宣布进入紧急状态，将自己隔离，并产生炎症信使，吸引并激活其他免疫细胞。这些免疫细胞可以杀死被感染的细胞，或形成抗体准备打持久战。那么，问题来了。人体细胞是如何识别这些不速之客的呢？它们的雷达系统被称为toll样受体8（tlr8），专门监控死细胞回收或病原体摄入过程中是否出现了警报rna。在回收过程中，不再需要的细胞和细胞组分被吸收并分解，并重新组装成新的细胞结构。如果细菌或其他病原体悄悄隐藏在这些组分中，那么他们与众不同的rna将出现在tlr8的雷达屏幕上。文章通讯作者、波恩大学医院的eva bartok博士表示：“免疫传感器tlr8长期以来一直被忽视。原因在于它在小鼠中不活跃，而许多免疫学研究都是在这些模式生物上进行的。”然而，对于人类而言，它起着至关重要的作用。crispr-cas9基因编辑技术的出现，让人们突然意识到tlr8在人类细胞中的重要性。bartok博士领导的研究小组首先利用crispr-cas9基因编辑技术删除了tlr8基因。结果，人类细胞不再能够识别细菌中的rna。“这突出了tlr8的重要性，”作者表示。之后通过关闭其他基因，研究人员又发现了免疫系统的两个重要工具：rnaset2和rnase2。两种酶都确保免疫传感器tlr8能够第一时间检测到病原体的rna片段。另一名作者thomas zillinger解释说：“也许您可以将长的rna想象成毛线球，看不到线头在哪里。”如果rna以这种毛线球的形式存在，那么将无法确定其序列。此时，rnaset2和rnase2就发挥作用，将这种毛线球rna分解成可读取的片段。这样tlr8才能判断rna是来源于宿主还是入侵者。在研究过程中，他们首先使用了肿瘤细胞培养物。为了验证以上结果，他们又使用了罕见病患者的血细胞，该患者因遗传缺陷而无法产生rnaset2，因此患有严重的精神和身体残疾。研究人员发现，这些患者的原代免疫细胞能够很好地验证他们的结果。bartok博士表示：“rnaset2和rnase2与免疫传感器tlr8的相互作用是形成病原体免疫反应的关键要素。”他认为，这项成果有望指导人们开发出新型疫苗或癌症免疫疗法。通过量身定制的rna分子来激活tlr8，可以增强免疫系统的效力。不过，这还需要进一步的转化研究。

构建稳定细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选，zui常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。1. 2 稳定转染细胞株的构建原理：稳定转染，就是转染的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代，从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。应用：    观察目的基因及其表达蛋白在某种细胞中的功能（稳定，可长期进行研究）一般流程：1）   筛选浓度测定：以10~14天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度2）   细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖3）   细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6）4）   利用质粒上含有的抗性选择进行筛选5）   鉴定筛选结果前期需要准备：         构建好的外源基因载体         待转染的细胞系（1×106个细胞，可传代，倍增时间小于48小时）以及细胞培养条件的说明         若需要检测靶基因的表达变化，请提供相应抗体

非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。目前认为仅有肿瘤干细胞具有形成集落的能力，集落抑制率常用于抗癌药物敏感试验、肿瘤放射生物学试验。集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100-%（一）原理细胞集落形成率 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。（二）实验用品1.材料：Hela细胞。2.器材：（直径 60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。（三）方法1.平板克隆形成试验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。(4)培养皿置 37℃ 、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。2.软琼脂集落形成试验本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将肿瘤细胞混入琼脂液中，琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置，琼脂中肿瘤细胞可能向周围作quan方位的移动，因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。造血系统软琼脂集落形成试验方法相同，主要用于有关细胞分化的研究，但使用培养基不同。（1）同上（1）~（3）步骤。（2）调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。（3）制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和 37℃ 左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在 40℃ 均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含0.5%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。（4）制备上层琼脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中，加入 40℃ 、5%琼脂等体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。 37℃ 、5%CO2静置培养2-3周。（四）实验结果1.定期观察细胞培养过程中集落的形成。2.显微镜下计数大于50个细胞克隆数，然后按下式计算集落形成率：集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）×100（五）注意事项1.琼脂对热和酸不稳定，如果反复加热，容易降解，产生毒性，同时琼脂硬度下降。故琼脂高压灭菌( 10磅 15分钟)后按一次用量进行分装。2.细胞悬液中，细胞分散度>95%。3.软琼脂培养时，注意琼脂与细胞混合时温度不要超过 40℃ ，以免烫伤细胞。4.接种细胞密度不宜过高。5.细胞在低密度条件下培养，生存率明显下降，无限细胞系和肿瘤细胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培养细胞和有限细胞系仅为0.5~5%,甚至为零。为提高集落形成率，必要时在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促细胞克隆形成物质。（六）复习思考题比较平板克隆形成试验和软琼脂集落形成试验的异同。

据《自然》报道，一项开创性的机器学习方法从 1 亿多个分子中发现了强大的新型抗生素。这项研究由美国麻省理工学院合成生物学家 Jim Collins 领衔，相关成果日前发表在《细胞》上。研究人员表示，这种被称为 halicin 的抗生素是人工智能（AI）首次发现的。在之前的抗生素研发中，AI 只协助其中的某些部分，但这一次是 AI 首次从零开始识别出全新种类的抗生素，且没有使用任何人类先前的假设。“研究小组不仅确定了候选分子，还在动物实验中验证了有希望的分子。” 匹兹堡大学计算生物学家 Jacob Durrant 说，“更重要的是，这种深度学习方法也可以用于其他类型药物的研发，如治疗癌症或神经退行性疾病的药物。”Collins 及其团队开发了一种神经网络—— 一种受大脑结构启发的人工智能算法，可以逐个学习分子的特性。研究人员利用抗菌活性已知的 2335 个抗菌分子，训练该神经网络识别抑制大肠杆菌生长的分子。模型被训练后，研究人员用它对一个名为药物再利用中心的数据库进行筛选。这个数据库包含了大约 6000 个正在被研究的人类疾病分子。他们要求模型预测哪一种分子对付大肠杆菌有效，并且只展示看起来与传统抗生素不同的分子。研究人员从筛选结果中选择了大约 100 个候选分子进行实验。其中一种被用作糖尿病治疗的分子被证明是一种有效的抗生素，研究人员将其命名为 halicin。在小鼠实验中，halicin 对多种病原体均有抗菌活性。halicin 的作用机制很特别，它破坏质子在细胞膜上的流动。“在实验中，对其他抗生素化合物的耐药性通常在一两天内出现。”Collins 说，“但即使经过 30 天的检测，我们也没有发现细菌对 halicin 有任何耐药性。”之后，研究团队又在一个名为 ZINC15 的数据库中筛选了超过 1.07 亿个分子结构，并在 23 个候选分子中确认了 8 个具有抗菌活性。其中有两种对多种病原体都有很强的活性，甚至可以战胜对抗生素有耐药性的大肠杆菌菌株。

一个国际科研团队 23 日在《细胞》杂志刊文指出，他们在人体肺部、鼻腔和肠道中，发现了最有可能被新冠病毒攻击的三种细胞类型，还发现冠状病毒可能利用宿主细胞的天然防御能力，劫持一些蛋白供自己使用。他们表示，尽快共享这些数据和发现，将有助于集中力量阐明新冠病毒如何攻击人体，更好地测试现有抗病毒疗法，并帮助科学家研制出应对新冠肺炎的新疗法。研究人员称，新冠病毒入侵细胞需要两大关键 “帮手”：血管紧张素转换酶 2（ACE2）和 TMPRSS2 蛋白酶。ACE2 是病毒进入宿主细胞的受体，新冠病毒的刺突蛋白通过劫持 ACE2 入侵人体；TMPRSS2 会激活刺突蛋白帮助病毒入侵人体。但哪些细胞会表达这两类蛋白一直是未解之谜。来自麻省理工学院、哈佛大学的科学家与来自世界各地的同仁一起，利用现有的在不同类型细胞中发现的 RNA 相关数据，搜索出了表达这两种特定蛋白的细胞，结果发现，鼻腔里分泌鼻涕的杯状分泌细胞、肺泡内负责维持肺泡功能的 Ⅱ 型肺泡细胞、肠道内负责营养物质吸收的吸收性肠上皮细胞比其他细胞更能表达这两种蛋白质的 RNA。此外， 研究人员还发现了一个令人惊讶的现象：ACE2 基因的表达似乎与已知被干扰素打开的基因的激活相关。干扰素是机体受病毒感染产生的一种蛋白质，通过干扰病毒复制并激活免疫细胞来抵抗感染，这是科学家首次发现 ACE2 与干扰素反应相关，表明冠状病毒可能利用宿主细胞的天然防御能力，劫持一些蛋白供自己使用。这也表明，干扰素在对抗新冠肺炎中的作用可能很复杂：一方面，它可以刺激基因抵抗感染或帮助细胞抵抗损伤；但另一方面，它可以提供额外的靶标，帮助病毒感染更多细胞。

 一项新研究表明，多种免疫疗法药物组合能够刺激某些免疫细胞吞噬癌细胞，并提醒其他免疫细胞攻击肿瘤，从而使患有致命性脑胶质母细胞瘤的小鼠得到长期缓解。这一发现公布在Nature Medicine杂志上，有助于研发显著延长人类胶质母细胞瘤患者生存期的新疗法，因为采用目前即使zui先进的疗法，诊断后平均只能维持15个月。免疫系统有两种：先天免疫，这是一个进化上较老的系统，可以连续扫描身体，经常通过吞噬过程“吃掉”细菌或病毒来清除外来入侵者，例如细菌或病毒。还有一个是适应性免疫，基于先前接触病原体获得的记忆，可以提供更具针对性和更强的反应。其实两者有些重叠，例如，先天性免疫系统利用它遇到的潜在病原体训练适应性免疫系统，使其进行工作。近年来，研究人员在利用免疫系统对抗某些癌症方面取得了相当大的成功，开发了多种可延长生存期的药物。然而，来自德州大学西南医学中心放射肿瘤学的蒋文（Wen Jiang，音译）教授认为这些努力主要集中在适应性免疫上。一些正在开发的药物旨在通过阻断CD47来增强先天免疫系统对癌症的作用，CD47是许多癌细胞表面的一种蛋白质，其功能是告诉其它细胞“不要吃我”。胶质母细胞瘤（GBM）——成人中zui常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，是蒋教授经常在临床上治疗的癌症类型。这种癌症的肿瘤细胞表面CD47含量通常显著升高，更高的含量通常表明患者的预后较差。但是目前的药物在临床试验中的结果参差不齐。为了提高GBM患者的生存率，研究人员发现了刺激先天免疫细胞吞噬GBM细胞的方法，这种方法不仅可以直接破坏这些细胞，还可以帮助训练适应性免疫系统继续作用。研究人员首先分析了CD47单克隆抗体在培养基中如何发挥作用，研究人员指出，虽然这种药物确实增加了吞噬细胞消除癌细胞的作用，但是“活性并不大”，“这没什么可夸的。”接下来，蒋教授和他的同事加入了一种名为替莫唑胺（TMZ）的药物来测试增加癌细胞“吞噬我”的信号，该药物已有十年历史。该药物激活癌细胞中的应激反应，使免疫系统更有可能消除它们。尽管这种药物也增加了癌细胞吞噬细胞的可能性，但是结果也并不乐观。由此他们认为，由于这两种药物的运作机理完全不同，组合起来可能会得到更多的反应。果然，当他们同时使用两种药物时，两种药物似乎可以协同工作，促使吞噬细胞吃掉的GBM细胞比单独使用任何一种药物都要多。 进一步的实验表明，一旦吞噬细胞吞噬了癌细胞，它们就会利用这些肿瘤细胞中的成分来引发免疫系统的T细胞（抵抗癌症的主要适应性免疫细胞），杀死更多的GBM细胞。研究人员在GBM小鼠模型中也测试这种联合疗法，结果显示成功缩小肿瘤并延长寿命。然而，随着时间的流逝，肿瘤细胞通过增加其称为PD-L1的蛋白质的产生，开发出另一种逃避免疫系统的方式，从而阻止了T细胞的侵袭。为了阻止这一情况的发生，研究人员添加了一种针对这种蛋白质的抗体，抗PD-1抗体。总之，此三部分组合药物：抗CD47抗体，TMZ和抗PD-1抗体大大延长了生存期。蒋教授说，这些动物中约有55％在研究过程中没有死亡，这种情况类似于患者的长期缓解。接下来研究人员希望在临床试验中尽快在人体中测试这种方法。“如果一种新疗法将生存期延长一到两个月，那它就被认为是一种重磅zha弹yao物。” “在这里，我们探讨的是可以治愈的患者中的很大一部分，结合先天性和适应性免疫系统可能被证明是GBM的一大进步。”

肌动蛋白是细胞中zui丰富，zui重要的蛋白质之一的微小化学修饰，长期以来一直有些神秘，其功能尚不完全清楚，但宾夕法尼亚大学佩雷??尔曼医学院的科学家现在朝着迈出了一大步消除神秘感。科学家们在《科学进展》中报道了肌动蛋白翻译后修饰的发现，他们相信他们的发现为生命的构建提供了启示-类似于了解恒星是如何诞生或形成黑洞的。这些基本信息可以潜在地指导对各种疾病的研究，包括肌动蛋白缺陷或衰竭引起的肌肉无力和免疫缺陷综合症。这项研究表明肌动蛋白是如何被修饰的，并且应该加速对肌动蛋白如何在细胞中起作用和被调节的进一步研究。研究人员使用X射线晶体学和其他先进技术揭示了肌动蛋白的原子级结构，因为肌动蛋白的链开始时被称为乙酰基的原子簇附着期间被伴侣酶修饰。形成蛋白质的氨基酸。这种修饰称为N末端乙酰化，可以在绝大多数人类蛋白质上发生，并被认为具有重要的生物学功能。但是，就肌动蛋白而言，这些功能尚不完全清楚。该发现还阐明了N末端乙酰化的一般生物学。实际上，这是首次确定以这种方式修饰的任何蛋白质的原子级结构。这项研究的高级作者，宾夕法尼亚大学威廉·毛尔·梅塞(William Maul Measey)生理学总统教授罗伯托·多明格斯(Roberto Dominguez)博士说：“这些基本发现扩展了我们对肌动蛋白如何起作用以及N末端乙酰化如何起作用的理解。”肌动蛋白的重要性在于以下事实：在哺乳动物细胞中，肌动蛋白是细胞质中zui丰富的蛋白质，即细胞核外的空间。zui著名的是形成称为细丝的电缆状结构，它构成了细胞的大部分支持“骨架”，并且在细胞分裂和细胞在组织中移动的能力中也起着关键作用。N末端乙酰化作用可能发生在肌动蛋白上，就像80%以上的人类蛋白质一样，似乎可以帮助调节肌动蛋白形成细丝的能力。但是，这种修饰的确切功能从未明确，科学家-由多明格斯(Dominguez)领导的团队和由挪威托马斯·阿内森(Thomas Arnesen)博士领导的挪威卑尔根大学(University of Bergen)的合作者团队-发现了催化肌动蛋白N-的酶。仅在2018年发生末端乙酰化。该酶NAA80是对人蛋白质进行N末端乙酰化的7种酶之一，但它很特殊，因为它仅对肌动蛋白起作用。在这项新研究中，Dominguez和Arnesen及其同事通过探索NAA80如何选择性地作用于细胞中数千种其他蛋白质中的肌动蛋白来跟踪他们对NAA80的发现。他们的主要发现之一是，当蛋白质组装成细丝时，NAA80不能识别肌动蛋白并使之乙酰化。当它以一个称为单体的独立分子存在时，它会乙酰化肌动蛋白。然而，当肌动蛋白与另一种称为肌动蛋白的蛋白结合时，zui有效的N端乙酰化作用发生了变化。肌动蛋白是肌动蛋白的已知伴侣，与肌动蛋白丝的形成密切相关，并且像肌动蛋白一样，在细胞中也非常丰富。多明格斯说：“令我们惊讶的是，发现这种蛋白质，NAA80，似乎已经进化为识别的不是肌动蛋白，而是识别肌动蛋白-肌动蛋白复合物。”“它表明，profilin具有“伴侣”的作用，可以使肌动蛋白在长丝形成之前被N末端乙酰化。该团队使用X射线晶体学来构建这种三向肌动蛋白-profilin-NAA80复合物的原子级图像。这是科学家第一次能够通过将乙酰基添加到另一种蛋白质中来解决N-乙酰基转移酶的原子结构。这项成就揭示了NAA80的特殊结构如何使其能够特异性识别并乙酰化人细胞中肌动蛋白的所有六个变体或“同工型”-即使这些肌动蛋白变体在蛋白质上的不同位点也是NAA80的位点乙酰化物。多明格斯说：“我们在这项研究中发现的结构和功能特征也解释了NAA80如何仅对肌动蛋白而不对其他蛋白质进行N末端乙酰化。”这项研究代表了细胞生物学的一项基本进展，但总的来说，随着科学家对细胞中肌动蛋白功能和动力学的更详尽了解，他们将更好地了解许多破坏这些功能和动力学的疾病。这些包括转移过程中的肌肉和心脏功能，组织发育以及众多病原体和癌细胞的运动。

生长因子又被称之为生长肽，因为它是一种具有多种生物学功能的多肽类物质，生长因子不但可以特异性的与细胞膜上的受体结合，而且对结合的受体具有极高的亲和性。同时它也在调节微生物和细胞的正常生长代谢中有着极其重要的作用，可以作为行使多种细胞功能的催化剂。生长因子对于不同类型的细胞具有一定的专一性，它们主要是在血小板和各类胚胎、成体以及大多数体外培养的细胞中生成。一般来说，体外的细胞培养都需要多种生长因子协调着共同进行，但肿瘤细胞不同，它可以完全不依赖生长因子的帮助自主进行生长，因此癌细胞理论上可以无限繁殖。生长因子的分类生长因子的种类众多，主要可分为血小板来源生长因子(PDGF)、骨肉瘤来源生长因子(ODGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-oL和TGFl3)、成纤维细胞生长因子（FGF）、类胰岛素生长因子（IGF）、神经生长因子(NGF)、白细胞介素类生长因子(IL—l、IL—ll、IL一lll等)、红细胞生长素(EPO)、集落刺激因子(CSF)等。1. 成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子(FGF)是促进微血管生成的重要生长因子，它们的主要功能是对细胞的有丝分裂，迁移作用有明显的促进作用，同是还参与了细胞的分化和组织的修复等功能。目前已发现有23种，其中包括酸性成纤维细胞生长因子(aFGF／FGFl)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF／FGF2)及角化细胞生长因子(KGF／FGF7)等。当人体患有胰腺癌时，癌变组织中可高度表达成纤维细胞生长因子（FGF）极其受体（FGFR）。正常的胰腺组织也是通过旁分泌和自分泌激活了FGF的相关信号导致的胰腺癌。酸性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维细胞因子在人体胰腺癌中的表达量是正常组织中的8-11倍，同时碱性成纤维细胞因子被认为与内皮细胞及肿瘤细胞的增殖有关，并与患者的生存期缩短有密切的关联。2. 表皮生长因子表皮生长因子（EGF）是人类发现的第1个生长因子，表皮生长因子受体（EGFR）的两种主要配体则是除了EGF，还有功能相似的转化生长因子（TGF）。他们通常都是在正常的导管细胞核胰腺腺泡中生成，他们这两种生长因子和受体的过度表达会刺激细胞的增殖，而阻断他们的信号传递通路则可以一直增殖并防止胰腺癌的发生。经过研究发现，EGF可通过激活NF—K B的活性诱导MMP一9的表达，促进胰腺癌细胞的侵袭，因此使用NF—K B抑制物就可以抑制此过程的发生，降低胰腺癌的发病几率。3. 胰岛素样生长因子胰岛素样生长因子（IGFs）可以分为IGF-I型和IGF-II型，他们都是多功能的一类细胞增殖调控因子，在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中的过程中具有重要的促进作用。与FGF一样，IGF可以通过旁分泌和自分泌其I型因子来激活受体，然后再激活其中的P13K小分子，从而导致AKT的磷酸化，同时使得Bad凋亡蛋白也发生丝氨酸的磷酸化过程，磷酸化的Bad凋亡蛋白与凋亡抑制因子的受体蛋白结合后，激活了游离的凋亡抑制因子，从而抑制了细胞的凋亡。研究表明，胰岛素样生长因子受体（IGFR）在胰腺癌的发病过程中起了重要的作用，抑制IGFR可以缩小胰腺癌的体积，减轻其重量，降低血管的密度并且增加胰腺癌细胞的凋亡，因此研究IGFR抑制剂对胰腺癌的治疗有很重要的意义。4. 肝细胞生长因子肝细胞生长因子（HGF）通常是在间质细胞中产生的，一般是通过旁分泌的方式作用在各个组织的上皮细胞中，它的主要受体是上皮细胞表面的酪氨酸激酶受体。主要的功能是影响细胞的分化，增殖，移行和浸润，同时对血管的生成也有辅助调节作用。肝细胞生长因子受体（HGFR）通常显著表达与胰腺癌细胞当中，而在正常的胰腺细胞中表达极低。研究表明。使用酪氨酸激酶抑制剂tyrphostin抑制HGF受体依赖的信号转导可以阻断HGF的促生长效应，减少胰腺癌的发生。生长因子的作用生长因子普遍来说都与细胞的生长发育有关，它不但可以调控相关细胞的增殖和凋亡，而且对人体的造血系统，血管，免疫系统以及肿瘤的发生都有密切的关系。人体组织中出现的炎症，感染，创伤愈合以及胚胎发育都是生长因子重要的调控对象。每种生长因子都可以调控不同的细胞，同时在调控过程中产生的作用也略有不同，但细胞并不是只受一种生长因子的调节，多种生长因子共同的协调作用才能geng好地提供给细胞全面成效。当然，其中大部分的生长因子都是为细胞核组织提供正向调节，少数具有负调节功能，还有一些具有特殊的正、负双重调节作用。1、生长因子的作用模式内分泌：生长因子分泌后，通过血液运输作用于远端靶细胞，比如血小板源生长因子就是以这种方式实现自己生物学效用的。旁分泌：细胞分泌的生长因子对邻近的其他类型细胞产生相应的生物学作用，对合成、分泌该生长因子的细胞本身则不发生作用。自分泌：生长因子作用于合成及分泌该生长因子的细胞自身，并进行相关的细胞作用。生长因子常见的作用模式是以自分泌和旁分泌的方式为主，而内分泌的作用方式则较少一些。2、生长因子的作用机制生长因子在不同的细胞中产生后，通过自分泌或旁分泌甚至内分泌的方式结合在靶细胞细胞膜或细胞内的相应受体上。生长因子经过与受体的结合作用，会激活细胞内的信号传递系统，从而介导了相关的促进或抑制的生物学效用。如下图中所示，原癌基因可以产生不同的生长因子或其相关的受体，它们的产生和过表达的量都将会影响癌细胞的生长，繁殖。若生长因子一味的促进癌细胞的增殖，并且原癌基因还不断的诱使细胞产生相应的结合受体，那么癌细胞就会开始失控并产生肿瘤。同时由于癌细胞的可以自主的进行生长，所以原癌基因的相关产物还可以发生各种类型的变异，导致癌症geng难治愈。生长因子的应用除了作为细胞培养试剂在细胞生物学等领域发挥作用外，生长因子已经被用于临床治疗的行列当中，由于它是在正常细胞中产生，因此生长因子既没有药物毒性，又不会产生相关的免疫反应，是非常合适的治疗癌症和伤口愈合等方面疾病的药物。表皮生长因子是十分常见的一种治疗机体损伤和溃疡的一类药物，它可以促进伤口的愈合和加快表皮细胞的再生，对于医疗中的烫伤，烧伤以及各种创口和溃疡的损伤都有很好的效果，并且已经被用于美容产品当中，减轻或治疗疤痕的出现，对痘印，痘坑以及孕妇的妊娠纹修复都具有很好的改善效果，加快了皮肤的修复作用。生长因子还与下列多种疾病相关，广泛用于医学研究领域：肿瘤：癌细胞与生长因子及其受体高度活化有关，如EGF／EGFR(非小细胞型肺癌、乳腺癌)、VEGF、TNF、IGF及PDGF等。心血管疾病：原发性高血压与MYC和FOS原癌基因的激活有关，而TP53基因表达降低，则会导致血管平滑肌细胞增生。动脉粥样硬化：癌基因高表达产生过量的血小板源生长因子(PDGF)，引起组织细胞增生，造成血管壁斑块形成，血液的浓稠度增加产生栓塞。心肌肥厚：多种癌基因(RAS、MYB、MYC、FOS)的过量表达导致心肌肥厚。与此有关的生长因子有胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)及成纤维细胞生长因子(FGF)等。免疫适应症：白细胞介素-2是趋化因子家族的一种细胞因子，它主要由活化的T细胞中产生，对肾癌、黑色素瘤的治疗效果明显，也可以被用于制作免疫调剂试剂和治疗自身免疫有关的疾病。白细胞介素-3则被用于治疗血小板缺失和骨髓功能衰竭等的适应症。

经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。    无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。    无血清培养基的基本配方为基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。   添加组分包括以下几大类物质：  （1）促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。 （2）促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。 （3）酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。zui常用的是大豆胰酶；抑制剂。 （4）结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 （5）微量元素：硒是zui常见的。

动物细胞培养技术在生物技术领域起着重要的作用。它在生物医药领域、细胞工程、酶工程等领域中都是不可缺少的工具。培养基是人工配制的满足细胞生长和维持的营养基质。培养基的发展大致经过3个阶段：天然培养基阶段(直接采用某些组织凝块、生物性液体和组织提取液等作为细胞的培养基)，合成培养基阶段(如DMEM、RPMl 1640等)和无血清培养基阶段。合成培养基通常需在其中添加一些诸如血清(常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5% - 10%)等天然的体液性补充物才能较长时间地维持细胞生长。在无血清培养基出现之前，血清被广泛用于细胞培养达几十年之久。动物血清主要包括胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清等，其中以胎牛血清的使用zui为普遍。动物血清在细胞培养中提供细胞增殖所需的生长因子、激素、转移蛋白、贴壁和铺展在培养基质上的因子、蛋白酶抑制剂和其他营养物质。使用血清的优点是血清含有促进细胞增殖和维持的大部分因子，它几乎是通用的生长添加物，适用于动物、人和昆虫细胞等的细胞培养。因而使用血清不需要为每一个细胞系优化培养基，节省了大量时间和精力。动物血清成分复杂，含有丰富的蛋白质、多肽、氨基酸、脂肪酸、葡萄糖、激素等，其组分及含量常依动物性别、年龄、生li状态、营养条件不同而有差异。尽管大部分成分已知，仍然存在不清楚的组分。因而血清在细胞培养中的作用至今没有完全明确。由于不同生产厂家的血清间及同一厂家生产的不同批次的血清间所含因子的质量和数量差异大，因此影响细胞培养的可重复性，制约动物细胞规模化培养。很多研究人员为了保证同一实验的一致性，不得不购买和储存大量同一批次的经筛选后确定为优质的血清。这一问题也使得比较不同研究者的实验数据极为困难。血清中蛋白含量大且成分复杂（大于100种），使得实验和生产的标准化困难，使疫苗、单克隆抗体及生物活性蛋白等用培养细胞生产的生物产品的下游分离和纯化geng复杂。干细胞培养要求在促进细胞增殖的同时，又要保持细胞的发育特性，不发生分化，对培养基组分的要求geng加苛刻。使用血清可能改变细胞在体内的正常状态，可能促进某种细胞（成纤维细胞）生长的同时，抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。在培养原代细胞时使用含血清的培养基可能不能阻止成纤维细胞过度增殖，而影响原代细胞的生长。虽然血清含有促进细胞生长的成分，但同时含有内毒素、血色素、补体、抗体等其他有害成分，影响细胞生长甚至导致细胞死亡，需要大量测试工作才知道对细胞生长的净作用。低质量的血清常被病毒、真菌和支原体等微生物感染。 此外，血清来源不稳定，可能受来源地区环境及牛群疾病影响发生供应紧张，造成价格上的波动。另外，血清使用不方便。胎牛血清的收集过程遭到伦理学的质疑。怀孕母牛在屠宰前腹部被刨开，取出胎牛。在无菌条件下，刺po胎牛的心脏或颈动脉/脐带静脉以获取血清，给胎牛造成痛苦。geng符合人道的无血清培养基应该得到支持。要实现细胞培养标准化，不要在细胞培养过程中使用血清。无血清培养基是不含动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。无血清培养基的研究有两个方向：一是培养基中不含有任何动物来源的添加组分；二是培养基中不含有不明确的添加组分。当前应用较多的无血清培养基归纳为以下四种：1. 一般意义上的无血清培养基：用各类可代替血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白（BSA）、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高，添加物质的化学成分不明确，其中含有大量的动物来源蛋白。2. 无动物来源培养基：许多无动物来源培养基是基于生产重组药物安全的考虑，培养基中的添加组分无动物来源，需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物，这些组分可以保障细胞生长及增殖的需要。3. 无动物蛋白培养基：培养基完全不用动物来源的蛋白，但仍有部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培养基组分相对稳定，但必须添加类固醇激素和脂类前体，并且对培养的细胞是高度特异性的。4. 化学组分限定培养基：此类培养基是目前zui安全的，zui为理想的培养基，shou先可以保证培养基批次间的一致性，其中所添加的少量动物来源的蛋白水解物、蛋白都是成分明确的组分。其特点是培养基的性质确定，配起培养基来也比较方便。无血清培养基可满足细胞生长需要，不仅避免了血清的许多不利因素，还有血清培养无法比拟的优点：组分稳定可大量配制，蛋白含量低，不含有丝分裂原抑制剂可促进细胞增殖，简化各种提纯和鉴定细胞产物的程序。在含血清的合成培养基中，往往不能较长时间地维持细胞高密度培养，同时衰老死亡的细胞可把细胞内的蛋白酶释放到培养基中，降解蛋白类目的产物，这对蛋白类生物制品的生产是极为不利的。在无血清培养条件下，细胞的生长速率和细胞密度及蛋白的表达水平都不亚于血清培养，甚至在某些方面超过血清培养，某些细胞的生长和抗体的产量甚至高于有血清时数倍。细胞易受搅拌等机械因素的影响，无血清培养基粘度小，因此对细胞影响小。在控制细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的调节机制的研究中和细胞工程等现代生物技术中，对一致性和确定的条件要求，来自产物纯化的生物技术上的压力，世界范围的血清供应的逐渐紧张的情况，以及严格的质量控制要求，都将迫使普遍采用无血清培养基。无血清培养基取代含血清的培养基已成为未来细胞培养的趋势。然而无血清培养基也存在着一些劣势。无血清培养基目前价格偏高，另外，一般无血清培养基通用性不高，不同类型的细胞株或细胞系可能需要不同的添加成分。处于发育的不同分化阶段的细胞(例如干细胞与定向前体细胞相比)需要不同的配方，对生长因子和细胞因子的选择尤为重要。细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。而且在去除血清的同时，也去除了一些血清蛋白具有的保护、解毒作用，因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求geng高。目前市场上部分血清替代品：KnockOutTM Serum Replacement (Gibco) 胚胎干细胞（ESC）/诱导多能细胞（iPSC）的血清替代品，成分明确，支持未分化的多能干细胞培养。保存：避光，-5 至 -20℃冻存；有效期：12个月。KNOCKOUTTMSR XenoFree CTSTM（Gibco）支持人胚胎干细胞（hESC）的生长和增殖，只含有人源蛋白或人的重组蛋白。保存：避光，-5 至 -20℃冻存；有效期：18个月。HyClone AdvanceSTEM Srum Replacement（HyClone）为培养小鼠胚胎干细胞（mESC）设计的配方。保存：冻存。XerumFreeTM（TNC Bio） 世界shou创通用的完全无动物成分的血清替代品，成分明确，含少量重组蛋白，适用于干细胞、其他常用细胞系及昆虫细胞等的培养。100多个研究机构和生产单位成功试用，效果相当或好于血清。保存：避光，2 至8℃；有效期：12个月。

细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。 特点： 1. 在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。 2. 非常适合研究细胞与胞外基质（ECM），细胞与细胞之间相互作用引起的细胞 迁移。 3. 与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用 4. 研究细胞迁移的体外实验中zui简单的方法。 传统实验方法实验步骤： 1. 培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记（方便拍照时定位同一 个视野）。 2. 细胞消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜（数量少时可培养一段时间至铺满板底）。 3. 细胞铺满板底后，用1 ml枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。（人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法zui大的缺陷。） 4. 吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。 5. 加入无血清培养基，拍照记录。 6. 将培养板放入培养箱培养，每隔4-6小时取出拍照。 7. 根据收集图片数据分析实验结果。 Culture Insert方法 1. 准备细胞，培养液，culture Insert。 2. 如图，将细胞接种于Dish中间的Insert，细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500 μm宽度的划痕。 3. 每隔4-6小时拍照记录。 4. 根据收集图片数据分析实验结果。 总结：相比较于传统的划痕实验，Ibidi的设计geng科学、重现性geng好

1、细菌：识别：细菌在显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，有球形，链形，杆形等。大家不必深究。只要发现培养液浑浊变黄，培养瓶顶部有一层细沙一样的东西。就知道大事不好啦。见下图。处理：可在培养液中加相应的抗生素处理。可以用四环素，庆大霉素，或者链霉素，前两者的工作浓度是50 μg/mL；链霉素的工作浓度是100 μg/mL。其实，毛毛虫说句实话，一旦发生污染，就已经大势已去了。如果细胞不是特别特别珍贵的话，还是趁早扔了，重起炉灶吧。所以，最重要的还是防范于未然。做好培养间，CO2孵箱，器皿和培养液的消毒灭菌工作。在操作的时候，严格执行无菌操作规范。2、霉菌识别：因为培养液是清亮的，所以霉菌污染非常难以早期发现，等发现时往往已经为时过晚了。培养液中慢慢地出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，如同风中柳絮。细胞仍可生长，但时间一长，细胞的状态就变差。见下图。处理：细胞一旦被霉菌污染，很难挽救，两性霉素B或制霉菌素都于事无补，建议果断舍弃该污染细胞，将环境彻底消毒。采用酒精彻底底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新洁尔灭擦洗一遍。把水盘里加上饱和量的硫酸铜。3、支原体：识别：多为多边形，培养液一般会变浑浊。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是和你一起慢慢变老。支原体污染后，可影响所有的细胞生长参数。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。处理：没有什么好处理的。直接扔了吧。4、黑蛟虫：识别：谁都不知道所谓的“黑胶虫”是什么东西。据说是纳米级的细菌。低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去。培养液也是不浑的，一般不会太影响。但是如果太多了，也会影响细胞生长和实验结果。处理：因为根本不知道这是什么物种，所以也谈不上什么处理方式。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。5、真菌：识别：真菌污染和霉菌污染差不多。一般培养液清亮，所以很难早期发现。镜下有时候象丝状，有时候象珊瑚状。慢慢地会长出很细的黑色丝状物。这个时候，已经晚了，细胞很难救活了。处理：同霉菌污染一样，没有什么好处理的，直接扔了吧。然后彻底消毒灭菌培养间，CO2孵箱，器皿和培养液。综上所述，两个原则：预防为主，果断扔掉。如果细胞实在特别特别特别珍贵。那就只好死马当活马医了。用广谱抗生素5倍推荐浓度冲击一下。当然细胞状态差的话不一定熬得住。同时增加传代时的细胞的密度，培养基中的血清浓度，勤换液。也可以不加抗生素进行单克隆有限稀释至96孔板，再克隆化。

    一般为48h以内，有些zui好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。    假阴性，不出现扩增条带    PCR反应的关键环节有：    ①模板核酸的制备。    ②引物的质量与特异性。    ③酶的质量及。    ④PCR循环条件。    寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。    模板：    ①模板中含有杂蛋白质。    ②模板中含有Taq酶抑制剂。    ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。    ④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。    ⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。    酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。    引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：    ①选定一个好的引物合成单位。    ②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。    ③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。    ④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。    Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。    反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul。或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。    物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。    靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。    假阳性    出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。    引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。    靶序列或扩增产物的交叉污染：    这种污染有两种原因：    一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。    这种假阳性可用以下方法解决：    ①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。    ②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。    ③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。    二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。    出现非特异性扩增带    PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。    非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：    ①必要时重新设计引物。    ②减低酶量或调换另一来源的酶。    ③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。    ④适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。    出现片状拖带或涂抹带    PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：    ①减少酶量，或调换另一来源的酶。    ②减少dNTP的浓度。    ③适当降低Mg2+浓度。    ④增加模板量，减少循环次数。