1．蛋白质组学研究的研究意义和背景 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial  analysis  of  gene  expression,  SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA  mRNA  蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional  control  )，翻译水平调控(Translational  control)，翻译后水平调控(Post-translational  control  )。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。        传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1)  生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2)  多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。(3)  在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪90年代中期，国际上产生了一门新兴学科－蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。        虽然第一次提出蛋白质组概念是在1994年，但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早，尤其是80年代初，在基因组计划提出之前，就有人提出过类似的蛋白质组计划，当时称为Human  Protein  Index计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质。但由于种种原因，这一计划被搁浅。90年代初期，各种技术已比较成熟，在这样的背景下，经过各国科学家的讨论，才提出蛋白质组这一概念。        国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia  Proteome  Analysis  Facility  (  APAF  )。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白质组数据库“SWISSPROT”  著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。而当年提出Human  Protein  Index  的美国科学家Normsn  G.  Anderson也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实现的梦想。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（Human  Proteome  Organization,  HUPO）,随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（Human  Proteome  Project）。2．蛋白质组学研究的策略和范围        蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。        早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式（Expression  profile）,  随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。蛋白质-蛋白质相互作用的研究也已被纳入蛋白质组学的研究范畴。而蛋白质高级结构的解析即传统的结构生物学，虽也有人试图将其纳入蛋白质组学研究范围，但目前仍独树一帜。3．蛋白质组学研究技术        可以说，蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基（20/  4）,  而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外，通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制备大量的蛋白质。蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑战。蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。当前在国际蛋白质组研究技术平台的技术基础和发展趋势有以下几个方面：3.1  蛋白质组研究中的样品制备        通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋白质组研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。        对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记，是蛋白质组研究的重要方向之一。但临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一。如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以，常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较。而蛋白质组研究需要的通常是单一的细胞类型。最近在组织水平上的蛋白质组样品制备方面也有新的进展，如采用激光捕获微解剖(Laser  Capture  Microdissection,  LCM)  方法分离癌变上皮类细胞。3.2  蛋白质组研究中的样品分离和分析        利用蛋白质的等电点和分子量通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质区分开来是一种很有效的手段。它在蛋白质组分离技术中起到了关键作用。如何提高双向凝胶电泳的分离容量、灵敏度和分辨率以及对蛋白质差异表达的准确检测是目前双向凝胶电泳技术发展的关键问题。国外的主要趋势有第一维电泳采用窄pH梯度胶分离以及开发与双向凝胶电泳相结合的高灵敏度蛋白质染色技术，如新型的荧光染色技术。          质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术。它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳－质谱技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键指标。一般的质谱技术难以将三者合一，而最近发展的质谱技术可以同时达到以上三个要求，从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定。3.3  蛋白质组研究的新技术        做过双向凝胶电泳的人一定会抱怨它的繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点。发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。目前，二维色谱  (2D-LC)、二维毛细管电泳  (2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳  (LC-CE)  等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。另一种策略则是以质谱技术为核心，开发质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用  (CE-MS)等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。随着对大规模蛋白质相互作用研究的重视，发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测技术也被科学家所关注。此外，蛋白质芯片的发展也十分迅速，并已经在临床诊断中得到应用。3.4  蛋白质组生物信息学        蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大，种类最多的蛋白质组数据库。丹麦、英国、美国等也都建立了各具特色的蛋白质组数据库。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件；特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大学、UCSF等都有自主的搜索软件和数据管理系统。最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。另外，对肽序列标记的从头测序软件也十分引人注目。4．  蛋白质组学发展趋势        在基础研究方面，近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。        在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。        在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学（System  Biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。

    一、污染原因    1. 标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。    2. PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染。    3. PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最-常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性。    还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48 000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题。    4. 实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大。    二、污染的监测    一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。    1. 阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳 性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。    2. 阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。    3. 重复性试验。    4. 选择不同区域的引物进行PCR扩增。    三、防止污染的方法    1. 合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最-好能划分：①标本处理区；②PCR反应液制备区；③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用。实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。    2. 吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸 样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。    3. 预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先 配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一 冰箱。    4. 防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。    5. 设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病 原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照 及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。    6. 减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。    7. 选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前 应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出

    1. 引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。设计引物应遵循以下原则：（1）引物长度： 15-30 bp，常用为20 bp 左右。（2）引物扩增跨度： 以200-500 bp 为宜，特定条件下可扩增长至10 kb 的片段。（3）引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5 个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。（4）避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。（5）引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。（6）引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。（7）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1 umol或10～100 pmol，以最低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。2. 酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100 ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3. dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1 M NaOH或1 M Tris.HCL的缓冲液将其 PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200 umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。4. 模板（靶基因）核酸，模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。5. Mg2+浓度，Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200 umol/L 时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。6. 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90~95℃变性，再迅速冷却至40 ~60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70~75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100~300 bp 时）可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。（1）变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃~94℃ 1 min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。（2）退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20 个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）复性温度=Tm值-（5~10℃）在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60 sec，足以使引物与模板之间完全结合。（3）延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70~80℃ 150 核苷酸/S/酶分子70℃ 60 核苷酸/S/酶分子55℃ 24 核苷酸/S/酶分子高于90℃时， DNA 合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1 Kb 以内的DNA片段，延伸时间1 min 是足够 的。3~4 kb 的靶序列需3~4 min；扩增10 Kb 需延伸至15 min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。7. 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。8. 影响pcr特异性的因素：通过上述内容,可以看出有许多因素可以影响pcr的特异性，在此我们作一归纳，供大家参考：（1）退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。（2）减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。（3）引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化.（4）改变MgCl2浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对taq酶的直接作用。一般认为PCR产物应在48 h 以内完成电泳检测，有些最好于当日电泳检测，大于48 h 后带型就会出现不规则，甚至消失。

    PCR反应条件为温度、时间和循环次数。    温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。    ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。    ②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：    Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)    复性温度=Tm值-(5～10℃)    在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。    ③延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：    70～80℃150核苷酸/S/酶分子    70℃60核苷酸/S/酶分子    55℃24核苷酸/S/酶分子    高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。    PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

    原理：    细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。    由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。    基本步骤：    (1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。    (2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。    (3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。    (4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。    (5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。    软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。

    一.概述：    基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。    二.实现基因敲除的多种原理和方法：    1.利用基因同源重组进行基因敲除    基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。    (1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：    ①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。    ②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。    ③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。    ④.选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10-2 ～10-5 ，植物的概率为10-4 ～10-5 。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。其中应用最多的是PNS法。    ⑤.表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。    ⑥.得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。    (2)条件性基因敲除法    条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。    条件性敲除的原理:    利用Cre/LoxP 和来自酵母的FLP-frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞;而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。    (3)诱导性基因敲除法    诱导性基因敲除也是以Cre/loxp 系统为基础，但却是利用控制Cre 表达的启动子的活性或所表达的Cre 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型;干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。    诱导性基因敲除优点：    ① 诱导基因突变的时间可人为控制;    ② 可避免因基因突变而致死胎的问题    ③ 在2 个loxP 位点之间的重组率较高;    ④如用病毒或配体/DNA 复合物等基因转移系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带Cre 的转基因动物的过程.    2.2利用随机插入突变进行基因敲除。    2.2.1 原理：    此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞(原理见图5)[11,12] 。根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插入;对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用;噬菌体可用于细菌基因敲除。    2.2.2基因捕获法    基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法，其原理可见图6。通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES 克隆可以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100%地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得    2.2.3基因捕获法的优缺点    用常规方法进行基因敲除研究需耗费大量的时间和人力，研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的基因敲除载体以及筛选中靶ES 细胞等，通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间。面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心。因此，基因捕获法应运而生，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES 细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。    此方法的缺点是只能剔除在Es 细胞中表达的基因.单种的细胞类型中表达的基因数目约为I04，现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES细胞表达的基因，因此，在ES 细胞中进行基因捕获还是大有可为的。用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰，    2.3.RNAi引起的基因敲除。    由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更为简单方便的方法。    2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理    双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面双链RNA还能在RdRP (以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNA-directed RNA    polymerase，RdRP)的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯1已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。    2.3.2 RNAi基因敲除的优点及应用    ①.比用同源重组法更加简便，周期大大缩短。    ②.对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。    ③.由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。    ④.RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。    2.4实现基因敲除的其他原理。    除上述几种已经比较成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，还有一些基于其他原理的敲除技术正处于研究和完善过程中，如TFOs(Triple helix forming oligonucleotides)引导的基因敲除术[16]以及反义技术在基因敲除技术中的运用等[17]。随着遗传学，分子生物学理论的发展，新的基因敲除原理也在不断的发现和发掘中。    3.基因敲除技术的应用及前景：    ①.建立生物模型。在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。    ②.疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。    ③.提供廉价的异种移植器官。众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了α-1，3GT 基因。使每只猪都缺乏产生a1-3半乳糖基转移酶的基因的2个拷贝。这些酶在细胞表面产生一种糖分子，人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性，从而引发超急性免疫排斥反应。在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生。    ④.免疫学中的应用。同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。    ⑤改造生物、培育新的生物品种。细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。    4.基因敲除技术的缺陷    随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个    在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能;另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。1．原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。2．技术分类：⑴ 荧光抗体技术（荧光显微镜技术）　　抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。⑵ 免疫荧光测定技术：　　抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。（1）荧光物质　　1）荧光色素　　许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：　　(1)异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。　　(2)四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。　　(3)四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。（2）其他荧光物质　　1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。　　2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+ ）、铈（Ce3+ ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。　　Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。（3）常见荧光素：　　1）FITC　　2）RB200　　3）TRITC2　　4）镧系：Eu3+、Tb3+　　5）PE　　6）其它　　常见荧光素的特性：　　1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490～495nm，发射光：520～530nm，明亮的黄绿色荧光。　　2）RB200： 橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光 595～600nm，橘红色荧光。　　3）TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。　　4）镧系：Eu3+、Tb3+　　5）PE：吸收光490～560nm，发射光 595nm，红色荧光。　　6）其它：酶作用后产生荧光物质。4）合适荧光素的选择　　1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。2）荧光效率高，标记后下降不明显。　　3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。　　4）标记后能保持生物学活性和免疫活性　　5）标记方法简单、快速。　　6）安全无毒。

    体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下：    一、上皮细胞培养    上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳-腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。    体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2 含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。    以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）    1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流-产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5-1平方厘米小块。    2、置0.02?A中，室温，5分钟。    3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。    4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。    5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30-60分钟。    6、反复吹打，制成悬液。    7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。    8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。    二、内皮细胞培养    内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。    研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最-为简便，其法如下：    1、产后新鲜脐带，无菌剪取10―15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。    2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。    3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3-10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。    4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。    5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。    三、神经胶质细胞培养    神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增殖。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。    人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。    培养方法如下：    1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。    2、置于30―50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。    3、把悬液注入离心管室温中直立5-10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。    4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细胞密度。    5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。    该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。    四、肌组织培养    各种肌组织均可用于培养，以心肌和骨骼肌较实用。    （－）骨骼肌细胞培养    1、出生1一2天的乳鼠，引颈处死。    2、无菌取大腿肌组织，切成0.3-0.5cm2小块后，用不含钙镁离子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过。    3、计数调整细胞密度。    4、快接种量2×106/皿入培养基培养。    5、培养基内含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促进分化。    接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化，明胶配置：用Hanks液配成0.01%明胶。    该细胞接种率约50%，细胞生长开始呈纺锤形，培养50-52小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时可观察到横纹，一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。    （二）心肌细胞培养    心肌细胞是最早的培养材料，Carrel曾长期培养过心肌组织，至今心肌仍不失为好的培养物，最-常用的是鸡胚心肌。    心肌比较容易培养和生长，可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法，均可获良好的效果。取心室肌培养较好，原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，培养成功时，一周后可见节律性收缩现象。    五、巨噬细胞培养    巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2-3周，多用做原代培养，难以长期生存。    巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。    培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最-为实用，其法如下：    1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流-产生大量的巨噬细胞。    2、引颈处死小鼠。    3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3-5秒。    4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。    5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。    6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。    7、小心拔出针头，把液体注入离心管。    8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。    9、计数细胞。每只鼠可产生20-30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。    10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。    11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1-2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。    六、肾小球分离、移植培养    SD 大鼠颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡1～2分钟，2次，置超净台内，打开腹腔取出肾脏剪碎，置含Hank's液的无菌培养皿洗涤，置80目不锈钢筛网上。用扁平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网，滤过组织Hank's液混合物用吸管吸至120目不锈钢筛网，滤过，去小组织块，滤过物吸至200目不锈钢筛网，轻轻滤过，Hank's液洗涤1次，收集网上肾小球，镜下观察为分离良好的肾小球。肾小球用0.2%胰酶、0.1%胶原酶，37℃消化20分钟，加血清终止胰酶反应，离心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至24孔培养板或25ml培养瓶，使肾小球大于60个/cm2，加培养基5～10ml（培养基组成：F12―3T3上清1：1；5%马血清；2.5%胎牛血清；胰岛素5μg/ml；25ng/ml氢化-可的松；5μg/ml转铁蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲状腺素0.02ng/ml；D-缬氨酸150ng/ml）肾小球培养8～10天，去除肾小球未生长组分，细胞继续培养24 小时，形态学观察：细胞生长成单层多角型细胞，直径约100μm。    七、裸小鼠移植瘤单细胞分离培养    无菌条件下取出小鼠移植瘤组织，剪成1mm3小块，用0.5%胶原酶室温消化30分钟到1小时，再加等体积0.2%胰酶消化5～8分钟，在消化过程中用吸管吹打组织块或用自制装置（分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接而成，滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞）来回推动注射器吹打组织以分离单细胞，终止酶消化方法同上。常规方法接种培养收获细胞。

    一、概念    1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。    2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整    个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cellstrain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。    二、建立细胞系（或株）的要求    什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：    1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；    个体性别、年龄；取材的器官或组织。    如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。    2、细胞生物学检测：    了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。    如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。    3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。    三、若干细胞建株的要点及基本过程    （一）肿瘤细胞培养技术要点    1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养    材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。    2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。    3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率    根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。    （二）人类淋巴母细胞建株方法    l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。    2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。    3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。    4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。    5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混匀。    6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。    7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。    8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l—2次，并维持环胞霉素的浓度。    9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1—2ml培养基，37℃培养10—15天，一般每隔3—4天观察一次，决定是否 换液，传代。    10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。

    1）  传代培养细胞染色体显示法    1．培养细胞：取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80％～90％汇合单层培养细胞。    2．加秋水仙素：使用最终浓度为0.02～0.8微克/毫升营养液，温箱继续培养6～10小时；或用低温封闭法：把培养细胞置于4℃条件下6～12小时后，再于37℃温箱继续培养6～10小时处理（加秋水仙素）。    3．采集分裂细胞：可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点，此时手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲刷。应用此法可使90％的中期分裂细胞从瓶壁脱落，注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。    4．离心：收集培养液，1000转/分钟离心5～10分钟。    5．低渗处理：吸除上清液、加入预温至37℃的0.075M KCl溶液，在温箱中静置20～30分钟。    6．预固定：向悬液中加新鲜1：3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打调匀，此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。    7．固定：离心，同4，吸除上清液，加新鲜固定剂5～10ml；加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置15～20分钟。    8．重复7，末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5～1ml。    9．制片：用滴片法制片，按如下步骤：彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴2～3滴细胞悬液，滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。    10．  染色和封片：一般常用Giemsa染色：取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干、可直接观察。如标本需要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片后，再过二甲苯，然后封片亦可。    2）  人末梢血微量全血培养染色体显示法    1．培养液准备：取15ml培养瓶数个，每瓶内分别充入5ml培养液（pH 7.2），内含：1640培养液（含10％～15％小牛血清），PHA 0.1ml，青霉素100单位和链霉素100微克/毫升 培养液    2．抽血针管准备：取2～5ml针管一支，在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器，无菌抽肝素（100 U/ml BBS）少许湿润针管，如动作迅速不用肝素亦可。    3．采血：用棉签75％酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次，缚止血带，静脉取血1～2ml。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4～0.5ml，如系外出采血，安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作，但动作要迅速，以减少污染；在采血量不多或不应抽血的情况下，亦可在耳垂、手指肚（无名指）用刺血针采血。    4．培养和加秋水仙素：37℃温箱中培养到60～72小时之间，此时细胞分裂相最多，向每培养瓶内加秋水仙素，最终浓度0.02～0.08微克/毫升营养液，再培养4～6小时。    5．低渗：1000转/分钟离心10分钟，吸除上清液，加入预温过的0.075M KCl溶液10ml，置温箱中低渗处理15～20分钟。    6．其余步骤与处理传代细胞法相同。

    一、配制用水    培养基的大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。按Waymouth标准，水的电阻应为200万欧姆，一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。    二、培养基    培养基有天然、人工两种。一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以双蒸或三蒸水配制。NaHCO3（或HCl）调pH至7.2～7.4，若pH值超过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐高压灭菌，使用前需经灭菌0.22μm孔径滤膜滤过处理。    三、血清    培养中常使用小牛血清（或胎牛血清）。血清亦不能高压灭菌，无菌的小牛血清需在56℃水浴30分钟灭活补体，置4℃冰箱存放待用。配制时含量视培养细胞种类、时间而定，一般用10—15%。由于血清成分复杂、条件不易控制，可选用无血清培养基。    四、抗菌素    为防止培养时期细菌的污染，可在培养基中添加适当抗菌素，一般用量与组织细胞培养相同：卡那霉素100单位/毫升，或双抗--青霉素100单位/毫升，链霉素100微克/毫升。    五、植物血凝素（PHA）    非增殖期的细胞不能制备染色体，如人外周血淋巴细胞，但在离体培养过程中，在PHA的作用下，可被刺激转化为淋巴母细胞而进入有丝分裂。经实验测定其分裂高峰分别于培养后44—48小时和68—72小时。    PHA有粘多糖，蛋白质两种重要成分。粘多糖促使有丝分裂，蛋白质起凝集作用。PHA激活的细胞数随其浓度而增加，直至全部免疫活性细胞均被激活为止，但PHA浓度过高会引起凝集，一般采用4%浓度为好。

    生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。    影响生物大分子样品保存的主要因素有：    ⑴空气：空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。空气中微生物的污染可使样品腐败变质，样品吸湿后会引起潮解变性，同时也为微生物污染提供了有利的条件。某些样品与空气中的氧接触会自发引起游离基链式反应，还原性强的样品易氧化变质和失活，如维生素C、巯基酶等。    ⑵温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高10℃，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加1～3倍。因此通常绝大多数样品都是低温保存，以抑制氧化、水解等化学反应和微生物的生成。    ⑶水份：包括样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。    ⑷光线：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的紫外线能量大，对生物大分子制品影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因此样品通常都要避光保存。    ⑸样品的pH：保存液态样品时注意其稳定的pH范围，通常可从文献和手册中查得或做实验求得，因此正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类和浓度就十分重要。    ⑹时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不同的样品有其不同的有效期，因此，保存的样品必须写明日期，定期检查和处理。    现以保存蛋白质和酶为例：    ⑴低温下保存：由于多数蛋白质和酶对热敏感，通常35℃～40℃以上就会失活，冷藏于冰箱一般只能保存一周左右，而且蛋白质和酶越纯越不稳定，溶液状态比固态更不稳定。因此通常要保存于－5℃～－20℃，如能在－70℃下保存则最为理想。极少数酶可以耐热：如核糖核酸酶可以短时煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中可以耐受90℃；蔗糖酶在50℃～60℃可以保持15 min～30 min不失活。还有少数酶对低温敏感，如鸟肝丙酮酸羧化酶25℃稳定，低温下失活，过氧化氢酶要在0℃～4℃保存，冰冻则失活，羧肽酶反复冻融会失活等。    ⑵制成干粉或结晶保存：蛋白质和酶固态比在溶液中要稳定的多。固态干粉制剂放在干燥剂中可长期保存，例如葡萄糖氧化酶干粉0℃下可保存2年，－15℃下可保存8年。通常，酶与蛋白质含水量大于10％，室温低温下均易失活，含水量小于5％时，37℃活性会下降，如要抑制微生物活性，含水量要小于10％，抑制化学活性，含水量要小于3％。此外要特别注意酶在冻干时往往会部分失活。    ⑶在保护剂下保存：很早就有人观察到，在无菌条件下，室温保存了45年的血液，血红蛋白仅有少量改变，许多酶仍保留部分活性，这是因为血液中有蛋白质稳定的因素，为了长期保存蛋白质和酶，常常要加入某些稳定剂：例如：①惰性的生化或有机物质：如糖类、脂肪酸、牛血清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持稳定的疏水环境。②中性盐：有一些蛋白质要求在高离子强度（1 mol/L～4mol/L或饱和的盐溶液）的极性环境中才能保持活性。最常用的是：MgSO4、NaCl、(NH4)SO4等。使用时要脱盐。③巯基试剂：一些蛋白质和酶的表面或内部含有半胱氨酸巯基，易被空气中的氧缓馒氧化为磺酸或二硫化物而变性，保存时可加入半胱氨酸或巯基乙醇。    总之，对样品的保存必须给以只够的重视，一些常用酶的保存条件可参见《生物化学制备技术》（苏拔贤主编）一书中的"一些酶保存的条件和稳定性"表，其他各种生物大分子和生物制剂的保存条件，可查阅有关的文献和酶学手册。    6. 分离纯化方法的选择    生物大分子能否高效率地制备成功，关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。由本章前述的生物大分子制备的各种特点可以看出，分离纯化方案必然是千变万化的。    制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：① 以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。② 以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。③ 以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。④ 以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。

生物技术已经被世界各国视为一种高技术，在整个科学技术中占据了特殊的显著地位，特别是生命科学的发展更离不生物技术，生命科学的发展备受各国的重视。我国在很多大学中都设立了生命科学院。现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。细胞培养的发展，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的，所以牛血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证牛血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。一、 牛血清在细胞培养基中的主要功能牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。5.起酸碱度缓冲液作用。6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。二、 牛血清的主要成份血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。1.蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。纤维粘连素 细胞促进细胞附着；α2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白 促细胞附着；转铁蛋白 能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。2.多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。促生长激素：促细胞增殖效应。氢化可的松：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的氢化可的松，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。4其他成份氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。三、 牛血清的质量要求随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也不断提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。（一）、WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。2.有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。3.证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。4.血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。5.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。6.对细胞有良好的支持繁殖作用。（二）、我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。（三）、美国对牛血清的质量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美国牛血清供应商的牛血清都已进入到我国市场，他们对其质量标准要求都极为严格，从血清来源到产品质量都有明确规定。1） 血清来源：可从世界各国收集胎牛血清，但是必须符合他的质量标准和美国农业部进口要求。地方当局还不清楚本地是否有牛海绵状病毒流行的血清不收集，有说明血清质量的证明资料：包括收集过程的全部资料、检验结果和交付情况。2）血清的收集：胎牛血清是心脏穿刺取血，新生牛（10～14天）和小牛（10个月内）血清静脉取血。血清采集条件必须符合工业生产的标准：低温下采集、一次分离、分离后立即混合冻存。符合要求的血清56℃水浴30分钟灭活。3）血清的制备：a. 超低IgG胎牛血清：通过亲和层析工艺去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBS γ球蛋白含量减到最低，一般IgG≤5ug/ml，生物学活性不变。b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml（用葡萄糖氧化酶／过氧化酶方法测定）。c. γ－射线照射：已经证明γ－射线照射可以有效灭活血清中可能污染的病毒、支原体。照射剂量为30～45KG。而且这个剂量的γ－射线照射不会改变血清的理化性质和对细胞培养的影响。4）除菌过滤:经过上述处理的粗制血清再经过一系列除菌滤膜过滤包括0.2微米（micron）和0.1微米滤膜。FBS要通过三层0.1微米滤膜，其他血清可通过0.2微米滤膜。4.终产品血清质量1）化学检定：渗透压pH蛋白含量――电泳法白蛋白 球蛋白 血红蛋白随着牛年龄增加血清中总蛋白含量相应增加，总的血清蛋白含量可以确定产品规格和年龄。2） 微生物学检查：细菌、真菌符合USP标准。支原体：在支原体专业培养基上培养了3～4周，培养温度36℃±2℃分别在需氧和厌氧条件下进行，有的还需要在支原体琼脂培养皿上传4次，Hoechst荧光素DNA染色检查那些培养法无法检出的支原体如猪鼻支原体等。病毒检查：牛兰舌病毒 Bovin blue tongue牛腺病毒 Bovine Adenovirus牛细小病毒 Bovine Parvovirus牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus狂犬病病毒 Rabies呼肠弧病毒 Reovirus牛呼吸道合胞病毒 BRSV副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza检查方法：已证明无外源因子污染的牛细胞培养物，在细胞生长液中加15％待测血清，连传3代共21天。阴性对照细胞培养液中加15％已知无病毒污染的牛血清，与试验组同条件下进行。在观察期内注意细胞形态变化或细胞病变。在观察期内第14天待检样品和对照样品用标准病毒检测方法检查。如待检细胞培养物经胰酶消化后分种到6个含盖玻片的容器内。阴性对照样品按同样方法。再将牛腹泄病毒、牛细小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠弧病毒分别加入待检培养物盖玻片容器内作为阳性对照，再培养7天，用荧光抗体技术进行检查。细胞病变或病毒引起的其他改变通过苏木精或伊红染色进行观察。取另外一个待检细胞培养瓶用人“O”红细胞、豚鼠红细胞和新鲜鸡红细胞作血球吸附病毒检查。试验在2～8℃和20～24℃进行。阴性对照细胞预先感染副流感Ⅲ型病毒作为阳性对照。未感染的细胞作为阴性对照。3）内毒素检测用鲎试剂检查。4）细菌噬菌体检查主要检查E.Coli(C300 or K-12)噬菌体。5）激素含量测定每批FBS对某些激素含量都要进行测定，包括：雌二醇、胰岛素、孕硐、睾丸素、甲状腺素等。6）血红蛋白检测血红蛋白与氧合血红蛋白的比≥70％，血红蛋白含量≤mg15/dl。7）细胞生长效果测定a.细胞克隆效果测定细胞选择：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653血清浓度与细胞数:10％血清／1个细胞／孔4％血清／5个细胞／孔细胞培养基RPMI－1640， 96孔培养盘36℃±2℃，5％二氧化碳培养10～15天。试验中选择一个已知参考牛血清作对照。克隆效率计算：克隆效率＝(阳性孔平均数/ 培养孔总数) X100％相对克隆效率＝待测血清克隆效率/参考血清克隆效率b.贴壁效率试验：用人的传代细胞作每批血清的贴壁效率试验，A549（人肺癌细胞）该细胞可以反应出低浓度血清的贴壁变化。采用6孔培养盘每批血清用两种浓度和两种不同的细胞接种数即10％血清――100细胞／孔，4％血清200介细胞／孔。放36℃±2℃，湿润5％二氧化碳培养箱培养10～14天，计算着色细胞克隆，确定贴壁效率。从这两种不同血清浓度来确立实验血清支持细胞贴壁生长的水平，分析两种试验条件下平均贴壁效率。贴壁效率（％）＝(每孔克隆平均数/ 每孔活存的培养细胞平均数) X100％相对贴壁效率＝被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率c. 二倍体纤维细胞促生长试验人二倍体细胞株 WI28 MRc525cm2细胞培养瓶，5％血清，每瓶接种1.5X105细胞连传3代，每代血清浓度和接种细胞数相同，每代培养7天，每代接种二个细胞瓶，36℃±2℃培养。以同样条件用已知参考血清进行平行培养。每代收获细胞计数，计算每批待检血清与参考血清的相对生长率（RGR）。RGR＝(试验血清每瓶细胞平均数/ 参考血清每瓶细胞平均数) X100％牛血清主要质量要求（Sigma）胎牛血清 新生牛血清 成牛血清牛龄 胎 10～14天 ＜10个月无菌 － － －病毒 － － －支原体 － － －噬菌体 － － －内毒素（ng/ml） ≤1.0 ≤10.0 ≤10(15)血红蛋白（g%） 3.0～4.5 3.5～6.0 5.0～8.5pH 6.7～8.0 7.0～8.0 7.0～8.0渗透压（mom/Kg H2O） 240～340 240～340 240～340

细胞培养器材的选择：从大小来讲，细胞培养瓶约可分为约600ml，250ml，50ml和25ml的，一般都经过表面改性处理，适合细胞贴壁和生长。600ml 、300ml的多用于大规模培养时用（如单克隆细胞的培养等），50ml的多用于一般性细胞实验用（一般性的传代，保存细胞，为实验提供细胞等），25ml一般是用来复苏细胞或细胞较少时的培养，还有做原代细胞时也可以做多瓶而避免交叉污染。当然还有其他如圆形的等，都可根据个人爱好和实验需要自己选择。根据细胞培养瓶制作材料的不同，也有玻璃和塑料之分，这里谈一点自己的浅见。不同的细胞对胰酶的敏感度不一样，所以在实验中我们常常会遇到一些细胞消化半天也没有起色，导致细胞状态不断下滑，直至最后的死亡以至于实验进展的不顺利。当然，有时候是可以通过加一些EDTA等来增强胰酶的能力，或者提高胰酶的浓度来实现，在培养一些细胞过程中，我发现，一些细胞对玻璃和塑料制品粘附能力不同，如RAW264.7，平滑肌细胞等，在转换培养瓶之后，可以发现好消化了很多，并且在回到原制品的培养瓶时不会改变它的贴壁能力。这里希望有经验的战友可以分享你们的经验。关于培养板的购买其实也没有什么经验，想说的就是要尽量避免购买国产的培养板，国产的一些培养瓶还可以，但是培养板我们买过很多国产的，确实效果不是很好，细胞在里面基本上长的非常非常磕碜。所以经费富余的情况下，这些东西能买进口的就买吧。大公司的基本都可以买，BD，Corning等等。这些东西原则上是一次性的，但是我们大部分实验室根本不可能做到，其实泡酸，洗干净再用也没问题，毕竟我们没有老外那么富足的经费，所以我们就累点吧，多做点体力活锻炼一下身体吧。细胞培养耗材有好多牌子，最好的是Corning Costar、Nunc和BD Falcon三个牌子；较好的有德国的Greiner和瑞士的TPP,这两个牌子比较前面的三个主要劣势是在产品种类单一和知名度不够，另外质量方面也可能有一些差距；再下面就是Orange等一些杂牌子了，无论质量还是知名度都差距较大。因为国内目前主要还是Corning Costar，Nunc和Falcon三家的天下，下面就分别讲讲他们各自情况： Corning Costar这本来是两家公司,Corning是美国的一个世界500强公司，下面有一堆业务，涉及光纤、玻璃、陶瓷等各个领域。它的Life Science部门则作的是细胞培养耗材、移夜器、过滤等一系列的实验室产品；后Corning收购了Costar的细胞培养耗材这块业务，合称Corning Costar。Corning（Costar）的质量是同类产品中最好的，几乎没听说过投诉它质量的；它的产品线也全，其它牌子有的几乎它都有（除了BD的IVF和BioCoat，以及Nunc的多层培养瓶个别几个产品），它自己也有一些有特色的东西，比如Costar的Transwell，Corning的塑料试剂瓶和过滤器。此外，Corning在国内做的时间也最长，知名度高，客户基础好。 NuncNunc，一个丹麦的牌子。95年的时候和Nalgene合并，Nalgene大家肯定都听说过，几乎每个新建实验室都会买Nalgene，大家卖Epp的离心机时是肯定经常会碰到老师要求配大离心管的，哪些都是Nalgene的。国内前两年做得不错，不过现在好像不怎么样了，估计主要还是价格下不来，另外还有个分销商的问题，它现在的代理商是Invitrogen，下面好像就乱放分销商了，这些分销商良莠不齐，卖得掉的乱报高价，卖不掉的就乱降价。不过Nunc还是个很好的牌子，产品很全，另外它的酶标板很有优势，Falcon和Corning都没得比，估计也只有Greiner和它有一拼。现在没做好的原因主要还是代理商。BD FalconFalcon应该叫做Discovery Labware。这个Labware的供应商那就是美国的BD公司了。BD公司比前两家的Corning和Apogent也丝毫不差，一家百年老店，进过500强。BD Bioscience（BD 的生命科学部分）好几个产品：Pharmingen、Clontech和Discovery Labware。Discovery Labware本来只有Falcon，后来加了Biocoat，前段时间BD收购了Genetest，也算在了Labware的下面，但其中最主要的就是Falcon。据BD说，Faclon是这个领域里最早的牌子，国外占有率最高，一年能卖上亿美金，Corning什么的都是后来者，没得比。另外BD在培养器皿的处理方面很有一套，据她的技术人员说，这些培养器皿都是在密闭环境下处理，表面处理更均一；其它牌子都是在一个开放的环境下进行的处理，相对来说就差一些；另外Falcon的包装不错，是双层的，有一些中间商就会为了这点要选Falcon，因为这样的包装适合长途运输。

    （一）实验目的：学习自制水浸片观察霉菌的形态    （二）实验原理：霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。    霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。    利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态；也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。    （三）实验器材    1. 活材料：在马铃薯琼脂平板上或用玻璃纸透析培养法培养3-4天的根霉（Rhizpus sp.）、青霉（Penicillum sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）；    2. 染色液和试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%酒精（V/V）。    3. 器材：剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、解剖针、显微镜。    （四）实验方法    1. 制水浸制片观察法    在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水，用解剖针从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片），先用低倍镜，必要时转换高倍镜镜检并记录观察结果。    2. 玻璃纸透析培养观察法    （1）玻璃纸的选择与处理 要选择能够允许营养物质透过的玻璃纸。也可收集商品包装用的玻璃纸，加水煮沸，然后用冷水冲洗。经此处理后的玻璃纸若变硬，必定是不可用的，只有那些软的可用。将那些可用的玻璃纸剪成适当大小，用水浸湿后，夹于旧报纸中，然后一起放入平皿内121℃灭菌30min备用。    （2）菌种的培养 按无菌操作法，倒平板，冷凝后用灭菌的镊子夹取无菌玻璃纸贴附于平板上，再用接种环沾取少许霉菌孢子，在玻璃纸上方轻轻抖落于纸上。然后将平板置 28-30℃下培养3-5天，曲霉菌和青霉菌即可在玻璃纸上长出单个菌落（根霉菌的气生性强，形成的菌落铺满整个平板）。    （3）制片与观察 剪取玻璃纸透析法培养3-4天后长有菌丝和孢子的玻璃纸一小块，先放在50%乙醇中浸一下，洗掉脱落下来的孢子，并赶走菌体上的气泡，然后正面向上贴附于干净载玻片上，滴加1-2滴乳酸石炭酸棉蓝液，小心地盖上盖玻片（注意不要产生气泡），且不要移动盖玻片，以免搞乱菌丝。    标本片制好后，先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。注意观察菌丝有无隔膜，有无假根、足细胞等特殊形态的菌丝。注意其无性繁殖器官的形状和构造，孢子着生的方式和孢子的形态、大小等。

    样品制备原则    样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响2-DE结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。    根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂以及核酸酶。    样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条，这样都会造成2-DE的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。    核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。    因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。目前有很多方法适于2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、采用亲合纯化凝集素结合蛋白等）。    一、细胞样品    1. 细胞培养，加药与处理。    2. 胰酶消化贴壁细胞，PBS漂洗3次(1500ｇ，5min)，弃上清, 再次离心，去尽残液（非常重要！）。如要比较细胞膜蛋白组的差别，最好用细胞刮收获细胞。如用10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替PBS，可有效降低样品的盐浓度。    加入5倍体积裂解液，混匀（或将1×106细胞悬于60～100?l裂解液中）。    3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml Dnase，在4℃放置15分钟。    4. 15,000转，4℃离心60分钟（或40,000转，4℃离心30分钟）。    5. 收集上清。    6. 测定蛋白浓度(采用BioRad RC/DC protein assay kit)。    7. 分装样品，冻存于－70℃。    二、组织样品    1. 碾钵碾磨组织，碾至粉末状。    2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。    3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分钟。    4. 15,000转，4℃离心60分钟（或40,000转，4℃离心30分钟）。    5. 收集上清，测定蛋白浓度。    6. 分装样品，冻存于－70℃。    注意事项：    1. 8 mmol/L PMSF必须在添加还原剂之前用，否則PMSF会失去活性。    2. 40 mmol/L浓度以下的Tris可使有些蛋白酶在高pH值下失活。    3. 细胞清洗――大多用PBS，若PBS残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹，则可利用(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此问题。    双向电泳操作步骤    水化上样(被动上样)    1. 从冰箱中取出IPG胶条，室温放置10min。    2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1cm左右不加样，中间的样品液一定要连贯.注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。    3. 用镊子轻轻撕去IPG胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。    4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上.注意:不要将样品溶液弄到胶条背面,因为这些溶液不会被胶条吸收;还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。    5. 放置30~45min大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约3ml(17cm IPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。    6. 置等电聚焦仪于-20℃水化11~15h。    第一向 等电聚焦    1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 5~8?l润湿。    2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。    3. 将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。    4. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油。    5. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。    6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10分钟，使其溶解。    第二向SDS-PAGE电泳：    1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶。    2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。    3. 配制胶条平衡缓冲液I    4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。    5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml(17cm IPG)平衡缓冲液I，在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。    6. 配制胶条平衡缓冲液II。    7. 第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。    8. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。    9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。    10. 在100ml量筒中加入TGS电泳缓冲液。    11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。    12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中漂洗数次。    13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。    14. 用适当厚度的胶片,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触.注意:不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。    15. 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。    16. 打开二向电泳制冷仪，调温度为15℃。    17. 将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用的低电流（5mA~10mA/gel/17cm），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（20-30mA/gel/17cm）待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。    18. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。    19. 进行染色。    双向电泳蛋白点的切取和保存：    1. 用PDQuest软件或肉眼比对，找出感兴趣的蛋白点，并做好标记和记录。    2. 用MilliQ水冲洗胶2次。    3. 用色谱纯甲醇和MilliQ水冲洗Ep管    4. 将枪头(200?l)下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和MilliQ水冲洗枪头。    5. 对准斑点中央小心将蛋白切割下来，放入Ep管，MilliQ水漂洗2次，如胶块太大，将其切成1 x 1 mm的胶片。    6. 将切好的点做好标记和记录，置-80oC保存或冻干后-20oC存放。    注意事项：    1. 尽量避免皮肤和头发的角蛋白的污染，在操作过程中应戴一次性的PE手套（不用乳胶手套）和帽子。    2. 不要将胶长期存放于乙酸溶液中。    3. Ep管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗，尤其应与进行Western blotting的容器分开，以避免casein或BSA的污染。

    水是实验室内一个常常被忽视但至关重要的试剂。实验室用水有那些种类？能达到什么级别？不同实验对水的要求有那些？下面就来了解一下吧！    实验室常见的水的种类：    1、蒸馏水（Distilled Water ）：    实验室最常用的一种纯水，虽设备便宜，但极其耗能和费水且速度慢，应用会逐渐减少。蒸馏水能去除自来水内大部分的污染物，但挥发性的杂质无法去除，如二氧化碳、氨、二氧化硅以及一些有机物。新鲜的蒸馏水是无菌的，但储存后细菌易繁殖；此外，储存的容器也很讲究，若是非惰性的物质，离子和容器的塑形物质会析出造成二次污染。    2、去离子水（Deionized Water ）：    应用离子交换树脂去除水中的阴离子和阳离子，但水中仍然存在可溶性的有机物，可以污染离子交换柱从而降低其功效，去离子水存放后也容易引起细菌的繁殖。    3、反渗水（Reverse osmosis Water）：    其生成的原理是水分子在压力的作用下，通过反渗透膜成为纯水，水中的杂质被反渗透膜截留排出。反渗水克服了蒸馏水和去离子水的许多缺点，利用反渗透技术可以有效的去除水中的溶解盐、胶体，细菌、病毒、细菌内毒素和大部分有机物等杂质，但不同厂家生产的反渗透膜对反渗水的质量影响很大。    4、超纯水（Ultra-pure grade water）：    其标准是水电阻率为18.2MΩ-cm。但超纯水在TOC、细菌、内毒素等指标方面并不相同，要根据实验的要求来确定，如细胞培养则对细菌和内毒素有要求，而HPLC则要求TOC低。    评价水质的常用指标：    1、电阻率（electrical resistivity）：    衡量实验室用水导电性能的指标，单位为MΩ-cm，随着水内无机离子的减少电阻加大则数值逐渐变大，实验室超纯水的标准:电阻率为18.2MΩ-cm。    2、总有机碳（Total Organic Carbon ，TOC）：    水中碳的的浓度，反映水中氧化的有机化合物的含量，单位为ppm 或 ppb。    3、内毒素（Endotoxin）：    革兰氏阴性细菌的脂多糖细胞壁碎片，又称之为“热原”，单位cuf/ml。

    免疫检测试剂中常用的防腐剂有硫柳汞、叠-氮钠、抗生素等。    1.        叠-氮钠是HRP的抑制剂，凡是和HRP接触的试剂，一定不能用；    2.        硫柳汞在ELISA试剂中可普遍使用，但因其有毒，较少使用；    3.        市面许多试剂盒产品，用抗生素做防腐剂较多，如庆大。    4.        如果试剂仅在实验室短期使用，其实并不需加防腐剂，常规试剂放4度冰箱，抗体、酶等加甘油分装冻存即可。    5.        梅里埃生产的HIV诊断试剂中提到：对照血清的防腐用0.1g/L硫酸庆大霉素和0.2ml/L肉桂醛。    6.        防污染可添加0.02%的叠-氮钠，或0.01%的硫柳汞。叠氮钠在多数情况下有用且有效，但在有些实验中却不合适，因为它能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，因此不能用于活体实验；因为含有氨基而能干扰许多标记方法；不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体。而硫柳汞不含氨基，不影响基质的稳定性。如果将抗体应用于生物活性检测、体内实验，一般不使用任何防腐剂，这些实验用的抗体应少量分装冷存，切忌反复冻融。    7.        吐温-20是作为稳定剂，可减少非特异性黏合。    甘油是防止冻融过程中的固-液相变而引起蛋白变性，能有效地增强蛋白质的稳定性，-20度冻存时甘油的浓度可以在20~30%。

由于胶原是细胞外间质成分bai，在体du内以不溶性大分子结构存在，zhi并与蛋白多糖、糖蛋白等结合在一起，dao因此胶原的制备包括材料的选择、预处理、酸碱酶盐水法提取、不同类型胶原的分离和纯化。 除胶原蛋白外，动物骨中还含有油脂、多种矿物质和其他杂质，因此在被用于提取胶原蛋白之前必须进行预处理。先剔除动物骨上残留的肉质和肌腱等杂物，粉碎后用正丁醇或正己烷萃取出骨油。最后除去骨中无机物以提高胶原蛋白的得率。除去骨中的矿物质可用稀酸或EDTA溶液。有人用原料用5倍质量的1.0moL/LHCL脱钙处理2d，用正乙烷脱脂后再用胃蛋白酶酶解，在加酶量150U/g，pH值1.7，37℃条件下处理120min，然后在固液比1∶6的情况下抽提5h，在此条件下，提取率可达18%；还有人用EDTA溶液（pH7.4）浸泡骨料5d，可有效脱去骨料中的羟基磷灰石。胶原蛋白的提取一般有三种方法：一是高压辅助的物理方法；二是用溶剂预处理结合低温或热水抽提的化学方法，根据溶剂的不同，可分为热水浸提法、酸法、碱法、盐法；三是用酶的生物化学法。一般来说，高压辅助和热水抽提针对明胶的提取，而低温抽提和酶法针对胶原的提取，但其基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境，把胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来。在实际提取过程中，不同提取方法之间往往相互结合，可以得到较好的提取效果。采用超高压处理系统对原料给予高压处理一段时间，使其组织结构和胶原蛋白的三股螺旋结构发生松弛、变性，便于分离提取。 酸法提取是利用一定浓度的酸溶液在一定的条件下提取胶原蛋白，主要采用低离子浓度酸性条件破坏分子间盐键和希夫碱，而引起纤维膨胀、溶解，采用酸法提取的胶原蛋白通常成为酸溶性胶原蛋白。酸溶解法可将没有交联的胶原分子溶解出来，也可溶解含有醛胺类交联键的胶原纤维，然后释放到溶剂中。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法，用低温酸法提取的胶原最大程度的保持了其三螺旋结构，适用于医用生物材料及原料的制备。通常的做法是将适当浓度的酸液按一定料液比加入到经过预处理的骨粉中，于0～25℃搅拌提取一定时间。在采用酸法进行胶原蛋白的提取时，注意提取温度不宜过高，以免胶原蛋白的生物活性发生破坏。取样经前处理后，匀浆在低温下用酸浸提，离心即可得酸溶性胶原蛋白（acid-soluble collagen，ASC）。作为溶剂使用的酸，主要有盐酸、磷酸、甲酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸等，但大多数研究集中于乙酸抽提，像Maria Sadowska等用0.5mol/L柠檬酸在室温下提取骨胶原蛋白，其提取率略低于乙酸提取。柠檬酸因不产生颜色和异味得以广泛使用于食品工业的胶原蛋白的提取。酸法处理时，反应强烈，水解彻底，多生成氨基酸混合物，而且使用酸提取时，根据酸浓度、水解温度、水解时间等条件的不同，可以得到分子量不均的胶原水解物。但是在即使中等浓度酸彻底水解过程中色氨酸也会全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸也会部分被破坏，且设备腐蚀严重。因此，酸法溶出生物医用胶原要准确控制酸度、温度、时间等影响因素。由于各种不足，酸法很少单独使用，一般和酶法配合。比如以猪皮为原料，在柠檬酸(pH8.6)和胃蛋白酶协同下提取胶原蛋白。在处理后的猪皮中加0.05moL/L含有胃蛋白酶的柠檬酸溶液（pH2.5-3）处理一段时间，然后再用NaCL盐析，最后提取率为12.35%，提取物保持了完整三股螺旋结构的I型胶原蛋白。还有人以雏鸡胸软骨为原材料，在0.5moL/L醋酸条件下经胃蛋白酶多次消化，在4℃，20000r条件下离心20min，最后应用DEAE-Sephadex A-50进行离子交换层析，之后透析，再用NaCL盐析，最后得到纯化的胶原蛋白Ⅱ型。 碱法提取即利用一定浓度的碱在一定的外界条件下提取胶原蛋白，碱处理法中常用的处理剂为石灰、氢氧化钠、碳酸钠等，用氢氧化钠浸提时效果较好。一般的是把样品匀浆后，用碱溶液多次溶胀后，再离心提取。但由于易引起蛋白质变性，如胶原肽键水解，含羟基、疏基的氨基酸全部被破坏；所得产物等电点pH值较低，天冬酞胺和谷氨酞胺分别转变为天冬氨酸和谷氨酸，得到的水解产物分子量较在酸性溶液中比低等问题，若比较严重的话，还会产生 D、L-型氨基酸消旋混合物，若D型氨基酸含量高过L 型氨基酸，则会抑制L-型氨基酸的吸收，有些D型氨基酸有毒，甚至有致癌、致畸和致突变的作用。而且碱法提取的含量较低，用氢氧化钠从鱿鱼皮中提取碱溶性胶原蛋白，其得率只有3%（以湿基计）。所以，若想提取结构完整、使用安全的胶原蛋白，很少采用此方法。有关单独采用碱法提取胶原蛋白的报道不多，一般是碱法提取和酸法提法结合使用。比如在4℃条件下，鱼骨用0.1moL/L的NaOH浸泡6h，再用2.5%NaCl浸泡6h去除杂蛋白，用10%的异丙醇溶液去除脂肪，0.1moL/L的柠檬酸浸泡3d，最后得到无色无味的胶原蛋白，提取率为11.87%。注意，无论酸法或碱法，均可有效地提取胶原蛋白，有人分别采用醋酸- 盐酸的混合酸液（pH3.0）和NaOH溶液（pH12.0）提取骨胶原蛋白，提取率基本相当。但是，这两种方法提取胶原蛋白不仅容易影响胶原蛋白的生物活性，而且提取后产生的酸性或碱性废液必须进行适当处理，以避免对环境造成污染。 酶法提取是指可溶性胶原和酸溶性胶原被提取后，需用一些蛋白酶，如胶原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等水解，得到不同的酶促溶性胶原蛋白。所使用的蛋白酶主要分3种：动物蛋白酶（如胰蛋白酶，胃蛋白酶），植物蛋白酶（如木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶），微生物蛋白酶（如碱性蛋白酶，中性蛋白酶）。在对酶法水解胶原蛋白的研究中，以碱性蛋白酶应用最多。将胶原进行限制性降解，即将末端肽切割下来，由于胶原肽链间的共价键都是通过分子末端肽里的赖氨酸或羟赖氨酸的相互作用形成的，末端肽被切下后，含三螺旋结构的主体部分可溶于稀有机酸而被提取出来。用酶处理，可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率；而且还不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，保持其特性。影响酶提取的因素有很多，如酶浓度、酶与底物的比例、酶解时间、酶解温度、pH值以及料液比等。在实际操作中，大多数采用酶复合法提取胶原蛋白，较多的是使用胃蛋白酶提取，有机酸多为乙酸。酶解胶原蛋白的工艺主要分为单酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分为混合酶水解法（比如牛胰蛋白酶，链霉菌蛋白酶，芽孢杆菌蛋白酶混合）和分步酶水解法，酶法提取皮胶原具体实验工艺及条件的选取通常应考虑要开发的产品对分子量的要求，要得到分子量较小的胶原多肽一般采用多酶水解法。影响酶解效果的因素主要有：酶的种类、加酶量、酶解温度、酶解时间、pH值及料水比。采用酶法提取骨料中的胶原蛋白，既能有效缩短提取时间，又能获得具有良好生物活性的胶原蛋白，而且对环境的污染也较小。胶原蛋白不易被普通蛋白酶水解，但能被动物胶原酶断裂，断裂的碎片自动变性后可被普通蛋白酶水解。胃蛋白酶水解胶原蛋白的适宜条件为pH 1.65～1.70、温度37℃。有人以猪骨为原料，用蛋白酶的酶解反应代替传统制胶工艺，对骨胶原的酶解反应与酶法制胶工艺进行了试验研究。结果表明：以胃蛋白酶对骨胶原的提取率最高（46.14%），其次是胰蛋白酶（43.42%），接下来是中性蛋白酶（30.14%），最后是碱性蛋白酶（21.15%）。并且通过单因素和正交试验对胃蛋白酶酶解反应中各主要影响因素进行了优化。试验结果表明，胃蛋白酶提取的最优条件是，胃蛋白酶的浓度是1%，在pH2.0的条件下酶解48h，然后在浓度为10%（w/v）的NaCL溶液中盐析24h，最后骨胶原的回收率为64.77%，骨胶原的提取率为49.75%。还有人用胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白，分别在水解0、2、6、10、14、18、22、26h时对四种不同胃蛋白酶用量（分别为1%、2%、2.5%、3%）的试样取样检测，采用一阶HILL方程模拟胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白的进程以及胃蛋白酶水解速率的衰减过程，最后得出2%的胃蛋白酶用量和6-7h的水解时间提取率最大。还有人用以新鲜猪皮为原料，在50-52℃的条件下用胰酶进行水解，在酶用量为 5000：1～10000：1，pH值为9，反应2－3h，原料：水为1：2的条件下酶解。结果表明：总蛋白质的提取率≥80%。采用酶法提取胶原蛋白时，必须严格控制提取条件。首先，酶作用时间必须适当。如果时间过短，胶原蛋白就不能充分释放到提取液中，影响提取率；如果酶作用时间过长，胶原蛋白会水解过度，产生过多的苦味小分子低聚肽，不仅会增加分离纯化的难度，也会影响胶原蛋白的功能特性和生物活性。其次，酶解温度要适宜。温度过低，酶的作用效果不明显；温度过高会引起酶的失活和胶原蛋白的变性。据报道，当介质pH略低于中性时，胶原蛋白的变性温度为40～41℃，当介质pH为酸性时，胶原蛋白的变性温度为38～39℃，而且鱼皮胶原蛋白的变性温度要比猪皮胶原蛋白的变性温度低7～12℃。所以，如果要使提取的胶原蛋白具有良好的生物活性，在提取过程中应使提取温度低于变性温度。第三，需选用适当的酶。一般从陆生哺乳动物组织中提取胶原蛋白时，采用胃蛋白酶在其最适作用温度下进行提取是合理的，但对于鱼类等水生动物，由于其胶原蛋白的变性温度比陆生哺乳动物低，因此许多蛋白酶便不适用，如果在这些酶的最适作用温度下提取可能会破坏胶原蛋白的某些功能特性和生物活性。采用酶法提取胶原蛋白及其多肽的研究主要是从动物皮及其加工副产物中，应用酶法从动物骨中提取胶原蛋白及其多肽报道较少。 指使胶原分子内部和分子间通过共价健结合提高胶原纤维的张力和稳定性的方法。该法又分为物理方法、化学方法和低温等离子体法，生物学方法；其中物理方法、化学方法是最常用的交联改性方法，生物学方法改性胶原蛋白主要在研究有关动物老化的生命现象中涉及，在研制胶原基生物医学材料中少见报道。物理方法通过物理手段对胶原蛋白改性有紫外线照射、重度脱水、λ射线照射和热交联等方法。胶原溶液如被紫外线等照射，将在分子间产生交联，粘度增加，生成凝胶。常用的紫外线交联胶原膜的方法是将胶原膜放在铝箔上，距离254 nm紫外灯20 cm高度，照射1～5 h。对紫外线照射的胶原膜进行力学性能和胶原酶试验表明：交联胶原膜的萎缩温度Ts和抗胶原酶解的能力均显著高于未交联胶原膜。重度脱水也是胶原蛋白物理改性中常使用的方法，该法是通过脱水导致胶原分子间交联，从而增加变性温度，改善胶原的性能。改性后胶原膜生物相容性提高，降低了水溶性，影响了膜与成骨细胞的生物相容性。物理方法改性原蛋白的优点是可避免外源性有毒化学物质进入胶原内，缺点是胶原膜交联度低，且难以获得均匀一致的交联。化学方法化学方法比物理方法改性交联度高，且能获得均匀一致的交联，对调节、控制胶原的各性质均有效。已广泛应用于各种化学试剂交联胶原，以提高其交联度、力学性能及生物相容性。化学改性法具体又可分为使用化学试剂交联、侧链的修饰、生理活性物的固定化三种方法。化学试剂交联法中常用的化学交联剂有戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基磷等，其中戊二醛是应用最广泛的试剂，大量实验证明：戊二醛能提供有效交联，但有细胞毒性，且其用量难以控制。另外，随着交联度的增加，吸水能力和膨胀度却会降低。酰基叠氮化物、聚环氧化物或京尼平交联等，不会引入明显的毒性，且可获得理想的交联效果。所见报道中，多使用单一交联剂对胶原蛋白交联改性，但也有使用混合交联剂的，如为了解决人工心脏瓣膜晚期钙化问题，筛选出环氧丙烷化学改性戊二醛处理生物瓣的方法，可明显减低瓣膜组织胶原蛋白末端游离羧基含量。动物实验表明，经改性后的瓣膜组织能保持较好的组织稳定性和机械抗张强度、免疫原性测试为阴性，符合临床应用。侧链修饰就是对胶原分子侧链的氨基和羧基进行化学修饰，改善电荷分布，使胶原获得新的特性，例如将胶原氨基丁二酰化，可变成负电荷丰富的胶原。与未修饰胶原蛋白相比血小板粘附能，血纤维蛋白形成能都弱，有抗栓性；然而如将胶原羧基甲基化获得的正电荷丰富的胶原，生理条件下血小板粘附能、活化能都高。与交联改性相比，在生物材料领域，利用侧链修饰对胶原改性所做的工作还较少。化学方法虽然可获得均匀一致的交联，但存在着引入外源有毒试剂，残留试剂难清除等缺点。一些报道表明，低温等离子体技术改性胶原或胶原复合膜可使材料表面引入不同基团，改变材料表面化学组分和结构，从而改变材料的特性，如使之geng具有细胞识别位，提高表面能，改善表面极性等。 胶原单独使用，物理机械性能差（这几乎是天然材料共有的弱点），性能单一，且因有亲水性强，在体内易被胶原酶降解等不可避免的弱点限制了它的应用。但如将胶原与其它物理、化学性质不同的合成或天然高分子共混，组成一种多相固体材料，在性能上胶原与其它高分子互相补充，胶原基“复合材料”的概念由此产生。已见报道的与胶原共混的合成高分子有不可生物降解的聚甲基烯酸酯及丁烯酸酯、聚氨酯、聚酰胺和可生物降解的聚乙烯醇、聚乳酸、聚谷氨酸、聚乙醇酸等，20世纪80～90年代初最有代表性的是聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA）和聚乙烯醇与胶原共混，其报道集中于复合方法、复合机理、理化及生物学性能、材料表面和整体结构、表面修饰的方法和机理以及水凝胶的溶胀扩散等，尤其是水凝胶制备、作软组织替代、药物缓释等。后来利用可生物降解的聚乳酸、聚乙醇酸、聚酸酐、聚谷氨酸、聚亚乙基四乙酸等与胶原共混改性制备可吸收外科缝线、组织工程支架材料（如组织引导再生材料）的相关研究相对增多。不过合成高分子与胶原蛋白共混复合一些问题，如尼龙等不降解高分子材料不能进行生理代谢，与胶原蛋白复合后只能用做皮肤的外层敷料不能永久代替皮肤，而聚谷氨酸等可生物降解材料，如果相对分子质量小则强度不够，相对分子质量大难溶于水，溶解时还出现降解，影响材料的机械强度。天然高分子材料中最具代表性的是天然蛋白质和天然多糖，多糖主要有软骨素、HA（透明质酸）、壳聚糖、肝素等，多糖复合材料比较集中于可吸收性外科缝线、药物释放的载体、皮肤替代物、透析膜、止血剂、医用引导组织再生材料、骨替代材料、组织培养系统的支架。

    爆款促销，我们是认真的！    为迎接下半年的开学，我司为助力科研提供一批ELISA检测试剂盒，现货促销，当天定，当天发货，赶快来抢购，还可以提供全程技术指导以及实验室免费代测服，远慕生物欢迎来电咨询！    ELISA检测试剂盒我公司对客户的服务承诺：    1.有质量问题免费包换，合同上注明（质量问题包括运输不当，客户在使用过程中测不出结果，等等！）    2.全程技术指导。（包括售前的标本收集，使用过程中不明白的地方，实验结束后的数据分析，有任何疑问，公司技术人员会及时给你来电）    3.提供免费代测的服务。（你只需把标本寄过来，我们为你节省时间，帮你出结果，原始数据，分析数据均可提供，一般时间是5天左右）    4.客户有任何问题，我们都是在一个工作日之内给出解决方案。售后和技术这一块都是竭诚为客户服务    ELISA检测试剂盒规格多样：为了满足客户需求，隆重推出小包装。    产品特点：高浓度，高品质，高特异性。    活动规则:    1、本次活动不限用户种类，所有人都可参与参与；    2、数量有限，先到先得。    3、 所赠产品与购买产品享受相同的技术支持服务.    4、活动最终解释权归我司所有。    活动时间：2020年8月10日——2020年8月30日

    一.使用细菌总数测试片,只需要购买细菌总数测试片,再按要求使用,有说明书.    二.红细胞计数法    首先要了解这个方法的原理.把N个红细胞与细菌均匀混合,再数出一小块区域内的红细胞数n和细菌数m.因为细胞已经均均匀混合,所以,局部的细胞数比和整体的细胞数比是接近相同的.即 n/m=N/M (n为局部红细胞数,N为总红细胞数,m为局部细菌数,M为总细菌数）n,m已数出.N又已知.所以总细菌数N就可以算出来.再取几个局部,算平均值,就能得到较精确的细菌数目.    如果这样做,只要数出一小块区域内的细菌数就可以知道总细菌数.如果不加红细胞,一个一个数,用要数到何年何月啊!细菌可是对数增长.加入红细胞的作用就像比例尺一样,地图上总有1：XXX的比例尺,你在显微镜的一个是视野里看到的红细胞数目就像地图上你测得的距离,数清一个是视野的菌数后,乘以相应分散度就可以了,分散度时用红细胞算的,具体的教材上应该有.不用也可以,不过要换成相应大小别的东西代替,总之用光学显微镜差菌数,这是不可缺少的.    这里运用了样方法,就是在若干样方中计数全部个体,然后将其平均数推广,来估计种群总体数量的方法.样方法相关知识：    ①样 方：样方也叫样本,从研究对象的总体中抽取出来的部分个体的集合,叫做样方.    ②随机取样：在抽样时如果总体中每一个个体被抽选的机会均等,且每一个个体被选与其他个体间无任何牵连,那么,这种既满足随机性,又满足独-立性的抽样,就叫做随机取样(或叫做简单随机取样).随机取样不允许掺入任何主观性,否则,就难以避免调查人员想获得调查属性的心理作用,往往使调查结果偏大.    ③适用范围：植物种群密度,昆虫卵的密度 ,蚜虫、跳蝻的密度,细菌数量测量等.    样方法取样方法    ①点状取样法 点状取样法中常用的为五点取样法,如图A,当调查的总体为非长条形时,可用此法取样.在总体中按梅花形取5个样方,每个样方的长和宽要求一致.这种方法适用于调查植物个体分布比较均匀的情况.    ②等距取样法 当调查的总体为长条形时,可用等距取样法,如图B,先将调查总体分成若干等份,由抽样比率决定距离或间隔,然后按这一相等的距离或间隔抽取样方的方法,叫做等距取样法.例如,长条形的总体为100 m长,如果要等距抽取10样方,那么抽样的比率为1/10,抽样距离为10 m,然后可再按需要在每10 m的前1 m内进行取样,样方大小要求一致.    样方法的两种边角统计方式（红色为需统计边线）    样方法具体步骤如下：    ①确定调查对象；    ②选取样方：必须选择一个该种群分布较均匀的地块,使其具良好的代表性；    ③计数：计数每个样方内该种群数量；    样方法的两种边角统计方式    ④计算：取各样方平均数.

    单细胞扩增，全名叫单细胞全基因组扩增，它是基因测序的前奏，那么有关于单细胞扩增技术你又了解多少呢？下面就是一些单细胞扩增技术介绍与推荐。    随着生物医学的深入发展，基因测序已成为疾病诊断，法医鉴定，微生物检测等的常用手段，但通常的基因测序选用的材料是大量细胞的混合DNA样本，只能反映整体细胞平均水平和优势细胞的水平。单细胞全基因组扩增技术通过无偏向性地扩增单个细胞的全部基因组，大幅提高DNA的总量，充分反映了细胞个体水平，为生物医学研究作出新的贡献。    看了这些，大家应该了解了一些单细胞扩增了，远慕生物这款单细胞扩增试剂盒有以下特点：    1.可在四小时内获得高丰度的DNA    2.可使整个基因组得到完整扩增，且可最大限度降低等位基因偏倚    3.包含进行细胞裂解及之后的全基因组扩增所需的所有必要试剂    4.可用于扩增任何来源的单细胞基因组，包括淋巴细胞、癌细胞、上皮细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、聚碳酸酯固定细胞以及植物细胞。    试剂的级别：    （1）优级纯（GR：Guaranteed reagent），又称一级品或保证试剂，99.8%，这种试剂纯度zui高，杂质含量最低，适合于重要精密的分析工作和科学研究工作，使用绿色瓶签。    （2）分析纯（AR），又称二级试剂，纯度很高，99.7%，略次于优级纯，适合于重要分析及一般研究工作，使用红色瓶签。    （3）化学纯（CP），又称三级试剂，≥ 99.5%，纯度与分析纯相差较大，适用于工矿、学校一般分析工作。使用蓝色（深蓝色）标签。    （4）实验试剂（LR：Laboratory reagent），又称四级试剂。

实验试剂DMEM培养基胎牛血清PBSBD24孔细胞培养板Raininpipettips,1ml戊二醛乙醇结晶紫实验设备细胞培养仪：37°Cand5%CO2实验材料人MDA-MB-231cell实验步骤1. 细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中生长。2. 细胞以一定密度接种到24孔细胞培养板中，生长24小时后，单层细胞融合度应达到70-80%。3. 不要geng换培养基。用新的1ml枪头轻轻的在单层培养细胞间划痕，划痕横穿过孔，枪头尽量与板孔的底部垂直，不要倾斜。这样产生的gap的距离才与枪头末端的外直径相等。Gap的距离可以选用不同型号的枪头调节。划痕在同一方向成一条直线。4. 在垂直与第一条划痕的方向制作另一条划痕，每孔划痕成十字交叉型。5. 划痕后，用培养基轻轻的清洗板孔2次，以去除脱落细胞。6. 每孔添加新鲜培养基。7. (培养基中含有某些成分，如抑制/促进细胞迁移和/或增殖的化学物质)。8. 细胞生长48小时(或根据时间需要)。9. 1xPBS清洗细胞两次，然后使用3.7%多聚甲醛固定30分钟。10. 0.1%的结晶紫(2%乙醇溶解)染色30分钟。11. 染色的单层细胞选取不同的视野，显微镜拍照。gap的距离可通过Photoshop或ImagJ软件测量.为了降低实验结果的可变性，建议每孔选择多个视野观察，每组做多个重复。

微生物数量的测定细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最-大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。一  显微镜直接计数法（一）目的要求1．明确血细胞计数板计数的原理。2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。（二） 基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lmL菌液中的总菌数。设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A?B（个）同理，如果是16个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A?B（个）（三）器材1．菌种  酿酒酵母2．仪器或其他用具 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。（四）操作步骤l．菌悬液制备以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。2．镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。3．加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。4．显微镜计数加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。5．清洗血细胞计数板使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。二  平板菌落计数法（一）目的要求学习平板菌落计数的基本原理和方法。（二）基本原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或geng多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝-对菌落数来表示样品的活菌含量。平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最-大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。（三）器材1．菌种 大肠杆菌菌悬液。2．培养基 牛肉-膏蛋白陈培养基。3．仪器或其他用具1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。（四）操作步骤l．编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2．稀释用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精-确地放0.5mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10 1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精-确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。其余依次类推。放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精-确，结果误差较大。3．取样用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。4．倒平板尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛-肉膏蛋白胨培养基约15mL/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。5．计数培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精-确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛-肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。涂布平板用的菌悬液量一般以0.1mL较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。三  光电比浊计数法（一）目的要求1．了解光电比浊计数法的原理。2．学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。（二）基本原理当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精-确测出。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过zui大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。（三）器材1．菌种  酿酒酵母培养液2．仪器或其他用具  721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。（四）操作步骤1．标准曲线制作（1）编号  取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。（2）调整菌液浓度  用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1至7号无菌试管中。（3）测OD值  将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，每管菌悬液在测定OD值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定（4）以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。2．样品测定将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、lcm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数×稀释倍数polly110是这样做的，摇菌8-12h，然后对菌液十倍稀释进行平板计数法，得出每毫升的含菌量，再对菌液进行稀释，得到你所要求的10的9次方/CFU的悬液。

微生物细胞大小，是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。实验方法原理     镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片。一般将1 mm 等分为100格（或2 mm等分为200格），每格长度等于0.01 mm（即106 μm）。是专用于校正目镜测微尺每格长度的。目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的刻度，有等分50小格或100小格两种，每5小格间有一长线相隔。由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同，因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，在使用前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。实验材料     枯草芽孢杆菌染色玻片标本试剂、试剂盒     香柏油仪器、耗材     目镜测微尺 镜台测微尺 显微镜 擦镜纸实验步骤     1.  目镜测微尺的标定（1）放置目镜测微尺取出接目镜，旋开接目镜透镜，将目镜测微尺的刻度朝下放在接目镜筒内的隔板上，然后旋上接目透镜，最后将此接目镜插入镜筒内。（2）放置镜台测微尺将镜台测微尺置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。（3）校正目镜测微尺先用低倍镜观察，对准焦距，当看清镜台测微尺后，转动接目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两对刻度线完全重合，然后计数出两对重合线之间各自所占的格数。根据计数得到的目镜测微尺和镜台测微尺重合线之间各自所占的格数，通过如下公式换算出目镜测微尺每小格所代表的实际长度。同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。2.  菌体大小的测定目镜测微尺校正后，移去镜台测微尺，换上枯草芽孢杆菌染色玻片标本，校正焦距使菌体清晰，转动目镜测微尺（或转动染色标本），测出枯草芽孢杆菌的长和宽各占几小格，将测得的格数乘以目镜测微尺每小格所代表的长度，即可换算出此单个菌体的大小值，在同一涂片上需测定10至20个菌体，求出其平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体来进行测定。3.  取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭后，放回盒内保存。 4.  结果（1）将目镜测微尺校正结果填入下表。（2）在高倍镜下测量枯草芽孢杆菌大小结果填入下表。

微载体细胞培养法 1.微载体选择：先用利用三种小量微载体做培养实验，观察细胞在一定时间内细胞的吸着率和计算细胞数，以得到zui大量细胞为佳。 2.水化：称一定量的微载体放入容器中，按每克微载体加50～100ml的比例，加入无Ca2＋和Mg2＋的磷酸缓冲液（PBS），室温下放置应不少于3小时，并不时轻微搅动，然后再用新鲜PBS洗一次。 3. 消毒：可采用高压蒸汽消毒，也可在水化后用70％酒精浸泡消毒，再用无菌的PBS漂洗一二次。 4.传代培养：在连续进行微载体培养时，可以不必把细胞从微载体分离下来，可将带有细胞的微载体和新的微载体混合进行培养细胞能移动到新载体上。如果进行其它实验或需要分离细胞进行传代培养时，和常规培养相同，先用EDTA＋胰蛋白酶溶液作用使细胞脱离微载体表面。细胞脱离微载体后，可用自然沉降法，即在室温下静止5分钟，微载体将先自沉在底部，细胞大部分仍在上清中，然后离心上清即可得到细胞。如果需要分离程度较高时，需用孔径为100微米的尼龙网或不锈钢网过滤后，再离心滤过液，就可得到较纯净的细胞。 生物试剂的使用常识：（1）试剂切忌与手接触（有些试剂有强腐蚀性、等特性）。（2）要用洁净的药勺，量筒或滴管取用试剂，绝对不允许用同一种工具同时连续取用多种试剂。取完一种试剂后，应将工具洗净（药勺要擦干）后，才可取用另一种试剂。（3）试剂取用后一定要将瓶塞盖紧，不可放错瓶盖和滴管，绝不允许张冠李戴，用完后请及时将瓶放回原处，以免遗忘，带来不便。（4）已取出的试剂不能再放回原试剂瓶内（怕产生原试剂的再次污染）。

污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。 （一）污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。1、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最-常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。2、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最-常见的一种，最-常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。3、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独-立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。4、病毒污染组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。5、非同种细胞污染由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。（二）、污染的鉴别1、细菌、真菌污染的检测（1）肉眼观察细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到，例如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。（3）接种观察采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。（2）镜下观察在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。2、支原体污染的检测（1）相差显微镜观察直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。（2）荧光染色法观察用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。A positive（3）电镜检测若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。

培养细胞就像养育BABY一样，要精心照料，用心呵护。最-好每天都去看看它们，满足它们所需要的物质需求，防止出现培养箱缺水、二氧化碳不足、温度不够等各种小意外，还要注意很多小细节，以免开展重复的实验导致不必要的人力物力浪费。 那培养细胞都要注意哪些小细节呢？就让我们一起来看看吧！ 1.细胞生长的营养来源 不同的细胞的培养基是不相同的，对于大多数肿瘤细胞来说，营养配方一般为：90%合成培养基（DMEM、RPMI1640、MEM等）和10%胎牛血清(FBS)；为了防止污染，可以适时加1%双抗，抗生素的使用应为短期。 Q：细胞培养基配方如何选择？ A: 一般购买细胞时，针对不同的细胞株，会有详细的介绍，包括生长的状态图、培养基的类型等。如人源肺癌细胞A549可用DMEM培养基，在胎牛血清的选择上也可以选用大品牌、来源可靠的胎牛血清，能提供较好的营养成分，以满足细胞株生长的需要。 Q：如果细胞生长缓慢，需要增加血清比例吗？ A：可以。 2.细胞生长的环境 舒适无菌的环境是细胞健康生活的重要基础。需要合适的器皿，不同形状、规格、用途多样的培养皿、培养瓶及培养板等，最终进入合适的恒温箱培养，如肿瘤细胞就需37℃，5%CO2的恒温箱中生长。  Q：细胞培养板及培养皿或培养瓶如何选择？ A：根据不同的应用选择不同的培养皿或容量板，如MTS用96孔板，细胞爬片用24孔，流式分析用6空等，具体应用可参见下表：  而选择培养皿还是选择培养瓶，就细胞培养状态来说差别不大，主要是培养瓶的安全系数更高一些，数量也会大一些，但是成本也相对较高，因此没有特殊要求时，一般用培养皿即可。 Q：血清是否要灭活处理，保证环境无菌？ A：这取决于您的应用。 灭活过程中，会导致血清中某些成分被破坏，如氨基酸，维生素，生长因子等。所以只有在您的实验对血清有特殊要求时，才会考虑对血清进行灭活处理。如您的实验对血清中的某种组分敏感，需要去除该组分。最-常见的情况是需要去除血清中的补体蛋白，因为补体在机体中参与细胞杀伤，巨噬细胞和淋巴细胞活化，肥大细胞和血小板组胺释放，平滑肌收缩等过程，所以一般在免疫学相关研究中及肌细胞和干细胞的培养过程中需要对血清进行灭活处理。 另外，用gamma 射线辐照血清可灭活血清中的病毒，一般情况下，25-40kGy和30-45kGy是常用的辐射剂量。 3.细胞复苏与冻存 细胞复苏是指将冻存的细胞解冻之后再重新培养，细胞从冷冻停止生长状态恢复生长的过程。复苏过程如下图所示：  Q：细胞复苏后，为什么很多难以贴壁？ A：忽略培养基的问题，主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。 细胞冻存则是将细胞放在低温（-70℃~196℃）环境，降低细胞内的代谢活动，最大限度的保存细胞活力，以便长期存储。 Q：目前细胞冻存液多采用的什么配方？ A：目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂，细胞冻存液的配方有很多种，如培养基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，复苏存活率在80%～90%以上。 4.细胞的传代培养 细胞在培养过程中不断增殖，培养皿空间有限，细胞过密生长就会受到抑制，影响细胞的状态，因此我们要把细胞中的一部分分到别的培养皿里，这样细胞才能生长的好。 Q：细胞传代培养为什么要选择对数期细胞？ A: 细胞的生长和分裂，一般遵循以下模式：停滞期，对数期（指数期），平稳期（平台期）和衰退期。为了确保活力，遗传稳定性和表型稳定，必须使细胞保持在对数期。一般细胞长到70%~80%左右就可以传代了。  除了上述几个环节的关节问题外，细胞培养还有很多小问题如下： Q：培养基多久换一次？ A: 正常情况下，培养液偏红色。如果细胞维持在pH6.5～6.6条件下，培养基变黄，说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，细胞会脱落死亡，需要更换新鲜培养液。一般细胞生长旺盛时1～2天换一次，生长缓慢时，3～4天亦可。针对复苏后的细胞，建议隔天换液。 Q：血清应如何融解？ A：从冰箱中取出血清，放于2-8℃融化，融化过程中不时旋转（swirling mix）混匀。充分融解后分装或平衡到室温后使用。 Q：如果细胞形态不清晰或有异物等，如何处理？ A：可以考虑如下操作：首先，倒掉旧的培养基，用新的培养基或者PBS洗涤2-3次，再开始正式的消化、吹打。其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内。后续再密切观察。 Q：血清中出现絮状沉淀是否需要去除？如何去除？ A：多种原因可能导致絮状沉淀的形成，最-常见的原因之一是融化过程中，脂蛋白聚集所致。该现象一般不会影响产品质量。可以400g离心5分钟，取上清，然后过滤。根据需要选择合适的滤膜孔径，一般最-常用的是0.22um PES材质的滤膜。为避免滤膜阻塞，建议离心后取上清加入培养基内一起过滤而不是直接过滤血清。 总之，细胞培养是后续实验的基石，留心各种细节问题，严守灭菌处理的程序，保护好自己养的细胞，这样才能快乐地进行后续的实验。

1.蒸馏共沸法， 优点：价格也比较便宜，选择性好，适合测量石油类产品。缺点：精-确也较差，测量时间长。含水量较大的产品适合。2卡尔费休容量法， 优点：测试品种多，相对库仑法通用性geng好，敏感度不高所受副反应干扰较少，如（如酮类、醛类）。缺点：在zui佳状态下仅能测至10-4级；耗材（试剂）大；测定时间偏长。3.卡氏库仑法 优点：仪器价格中等；耗材少；可以测定至10-6级；时间短，一般物质在掌握好进样量的前提下60秒内即可完成测定，是过程控制和仲裁判定的zui佳方法。缺点：由于精-确度高，过于敏感有些具有副反应的物质如酮类、醛类测定较困难，需要一定的经验控制反应方向。4.其他特殊方法：电容/电阻法，适合粗测纸张、木材、粮食等物质；近红外法，适合在线测量大含水量物质；电解（磷酸）法，适合气体的在线测量；压差法，适合测量易挥发物质；露点法，适合测量气体；此外还有浊点法；磷酸重量法；结晶法等不常用方法。5.传统烘干法，优点：仪器价格低廉，通用性好。 缺点：精度差；仅能测定至10-3级；在干燥蒸馏过程中挥发性物质亦被蒸发，不能测定物质中水分含量的真值，试验时间过长。6.光谱、色谱法， 优点：可以测至10-6级。缺点：仪器价格昂贵；环境要求高；准备时间长（几个小时）；不利于产品的过程控制。

1.蒸馏共沸法， 优点：价格也比较便宜，选择性好，适合测量石油类产品。缺点：精确也较差，测量时间长。含水量较大的产品适合。2卡尔费休容量法， 优点：测试品种多，相对库仑法通用性geng好，敏感度不高所受副反应干扰较少，如（如酮类、醛类）。缺点：在zui佳状态下仅能测至10-4级；耗材（试剂）大；测定时间偏长。3.卡氏库仑法 优点：仪器价格中等；耗材少；可以测定至10-6级；时间短，一般物质在掌握好进样量的前提下60秒内即可完成测定，是过程控制和仲裁判定的zui佳方法。缺点：由于精确度高，过于敏感有些具有副反应的物质如酮类、醛类测定较困难，需要一定的经验控制反应方向。4.其他特殊方法：电容/电阻法，适合粗测纸张、木材、粮食等物质；近红外法，适合在线测量大含水量物质；电解（磷酸）法，适合气体的在线测量；压差法，适合测量易挥发物质；露点法，适合测量气体；此外还有浊点法；磷酸重量法；结晶法等不常用方法。5.传统烘干法，优点：仪器价格低廉，通用性好。 缺点：精度差；仅能测定至10-3级；在干燥蒸馏过程中挥发性物质亦被蒸发，不能测定物质中水分含量的真值，试验时间过长。6.光谱、色谱法， 优点：可以测至10-6级。缺点：仪器价格昂贵；环境要求高；准备时间长（几个小时）；不利于产品的过程控制。