菌种在分离、保藏和生产过程中，极易遭致杂菌污染，因此必须对染有杂菌的菌种进行提纯，方能用于生产。根据污染的类型和程度，需采用不同的纯化措施。（1）排除细菌或酵母菌污染在菌种培养中，用肉眼仔细观察培养基表面，不难发现被细菌或酵母菌污染的分离物常出现黏稠状的菌落。取被纯化物接种在无冷凝水、硬度较高（琼脂用量2.3%～2.5%）的斜面上，再降低培养温度至15～20℃，利用某些大型真菌在较低的温度下，菌丝生长速度比细菌蔓延速度快的特点，用尖细的接种针切割菌丝的前端，转接到新的试管斜面培养基中培养，连续2～3次就能获得所要的纯菌丝。也可打破试管，挑取内部长有基内菌丝的琼脂块，移入无冷凝水的培养基上，该法适于被好气性细菌污染的母种。（2）排除霉菌污染霉菌和细菌不同，它和食用菌菌丝很相似，也有气生菌丝和基内菌丝。分离的方法主要是抑制杂菌生长，拉大食用菌菌丝生长和杂菌菌丝生长的范围差，从食用菌菌落前端切割，移植入新培养基。杂菌发现越早，分离的成功率越大。严格地说，在斜面培养基上的非接种部位发现的白色菌丝，应认为是杂菌菌落，应马上提纯。若有色孢子已出现，一方面易使分生孢子飘散，另一方面其基内菌丝早已蔓延，可能和食用菌菌丝混生一起。如霉菌刚出现孢子且尚未成熟、变色，则可采用前端菌丝切割法提纯。转管时先将菌丝接种在斜面尖端，当长满斜面后，及时将原接种点连同培养基一起挖掉；如霉菌菌落颜色已深，说明孢子已成熟，稍一振动孢子就会飘满培养基，若再行上法意义不大。如菌丝蔓延范围较大，可将0.2%升汞溶液或1%多菌灵处理过的湿滤纸块覆盖在霉菌的菌落上，可抑制霉菌生长，防止孢子扩散，后用灭菌接种铲将表层铲掉，随之用接种针钩取基内菌丝移入新的培养基，如此2～3次。（3）限制培养取直径7～10毫米、高4～6毫米的玻璃环或不锈钢环，经酒精灯火焰灼烧后趁热放到斜面培养基中央，将环的一半嵌入培养基内，然后将染有细菌的接种块放入环内进行培养。细菌生长会被限制在环内，而食用菌菌丝则可越过环而长到环外的培养基上，转管后即可得到纯化。（4）覆盖培养在污染了细菌的食用菌菌丝斜面上倾注一层厚约2毫米的培养基，培养一段时间，当食用菌菌丝透过培养基形成新的菌落时，即可切割转管。最好进行二次覆盖。（5）基质菌丝纯化培养对棉塞长有霉菌的试管斜面，可将试管打碎，取出培养基，用0.1%升汞浸泡2分钟，用无菌水淋洗，再用无菌滤纸吸干。取一段2厘米的培养基从中部切开，在断面上用无菌刀片切成米粒大小的块，移入新的斜面上进行培养。（6）药物处理菌种提纯时，可向培养基中注入选择性强的抗菌制剂，如加入 5～10毫克/升的多菌灵（MBC）、涕必灵（TBZ）或托布津等，可有效地防止菌霉混生；在每毫升培养基中加入30～40毫克链霉素、20～30毫克四环素、金霉素，或50毫克高锰酸钾，可以有效地防止细菌混生；加入灰黄霉素（20单位/毫升），可抑制真菌生长。（7）破碎菌丝从试管中取出已污染的培养基，放在0.1%升汞水中处理2分钟，用无菌水冲洗，无菌纸吸干，再放入有玻璃珠的无菌水内，经组织破碎，稀释后注入平板培养，取其单个菌落纯化培养。

　　稳定细胞系是指将外源基因整合到宿主细胞基因组中，使外源基因能够在宿主细胞中长期稳定表达，这样的细胞系称为稳定细胞系。其原理是将外源基因克隆到具有某种抗性的载体上，通过转染宿主细胞，外源基因整合到宿主染色体上，用载体中所含抗性基因进行筛选即可得到成功整合目的基因的细胞。在试验过程中，常用的真核表达载体抗性筛选标志物有嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)等。通过筛选可得到符合实验要求的稳定高表达目的蛋白细胞株或者稳定沉默目的基因的细胞株。　　其建立的原理是，将我们所要的目的基因真核到宿主细胞上，随着细胞的生长繁殖，目的基因可以稳定的表达，在通过抗生素的不断加压筛选，得到构建稳定细胞系的过程。相对于瞬时转染，稳定转染技术持续周期长，细胞整合稳定，能够满足后期对蛋白的大量需求。　　以下情况需要使用稳定细胞系：　　1、实验周期长，要求外源DNA在分裂细胞中长期表达，>2周。　　2、需要构建诱导表达系统。当目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性，或者会引起细胞毒性等不利影响。　　3、基因敲除/插入等修饰宿主细胞基因组的实验。　　4、筛选拷贝数适宜的细胞。　　5、对于某些很难转染的细胞种类。即使病毒载体也无法实现高效率转导。　　6、通过构建稳定细胞株实现更好的基因干扰效果。　　7、后续实验中需要将转染细胞注射进入动物体内。　　8、需要构建单克隆细胞株可以去除个体差异。

在组织学中，石蜡切片和冰冻切片都是常用的方法，前者常用于进行免疫组化实验，后者则常用于免疫荧光实验。组织学常规制片技术中最为广泛应用的切片方法，为石蜡切片与冷冻切片。石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤，为永久性显微玻片标本。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法。多应用于手术中的快速病理诊断。而且也被用于其他许多学科领域的研究中。冷冻切片技术，是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。被称为病理科的急诊工作----在外科手术过程中，医生切取部分肿瘤组织或其它病变标本，送检到病理科通过快速冷冻标本制作切片，病理科诊断医师对该切片进行观察快速做出判断得出良、恶性结果或某种疾病的诊断。冷冻切片与常规石蜡切片有什么区别呢？远慕简单介绍一下：1、制作方式不同：①冷冻切片要求送检新鲜组织，采用低温恒冷切片机，将取材组织置于-25℃冷冻箱内速冻3-5分钟，切8微米厚度切片，固定后水洗直接染色，针对不同组织采用不同温度进行切片。②石蜡切片--送检组织用10%中性福尔马林固定，标准取材后，置入全自动脱水机进行脱水、透明、浸蜡，再进行包埋、切片，厚度3-5微米，将切片烤片后，置入全自动染色机进行染色。2、镜下观察不同：①冷冻切片---因为冷冻组织未经过固定是新鲜组织冷冻切片，没有经过充分的脱水，对组织的观察会有一定的影响，所以切片镜下细胞、组织略显肿胀，诊断准确率95%以上。②石蜡切片---因为组织块经过10%中性福尔马林固定，酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，所以切片平整、颜色鲜艳、细胞组织结构清晰可见，诊断准确率99%以上。3、用途不同：①冷冻切片用于术中病理诊断，达到迅速做出诊断，包括良、恶性、切缘及淋巴结转移情况。所以要求病理诊断医师具有高年资病理诊断经验，取材部位精准， 病理技术人员具有冰冻切片的经验。②石蜡切片用于术后病理诊断，要求离体组织及时固定，保持组织原有结构及成分固定在原有位置，经过一系列技术处理，通过这些处理可以使得切片在显微镜下清晰的辨认其形态结构，组织细胞形态结构保存良好，可以帮助医生更加准确的做出诊断。由于冷冻切片存在质量和时间上的限制，冷冻切片病理诊断对肿瘤的分型不一定非常准确，对部分无法确定组织学类型的病/例，还需要等待常规的石蜡切片予以确诊。冷冻切片较石蜡切片制作厚，做出来的切片没有石蜡切片清晰。总之，简单概括起来，两者之间最大区别是冰冻切片操作便捷性高，能很好保持抗原活性、脂肪、类脂成分。石蜡切片组织形态好，能切更大组织，切片厚度薄，连片性好，对标本的长期保存非常适合。

Treatment of porcine ovarian follicles with tert-butyl hydroperoxide as an ovarian senescence model in vitro治疗猪卵泡与叔丁基氢过氧化物作为卵巢衰老模型IF: 5.2文献介绍：卵巢衰老是女性生殖问题的主要原因。过度氧化应激可以诱导卵巢衰老和卵泡闭锁,从而减少繁殖性能。毛囊被分成五组文化基于刺激的持续时间与叔丁基氢过氧化物(t-BHP)阀门组和组1 h, 2 h, 6 h,和12 h。结果显示,孕激素的比例(P),雌二醇(E)增加24和36 h后的卵泡文化,转变对闭锁卵泡(引用产品：猪雌二醇(E2)ELISA试剂盒产品货号：YM-S2619猪雌二醇(E2)ELISA检测试剂盒原理：酶联免疫吸附测定是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗原（抗体），再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）-待测抗体（抗原）-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。我司所有产品仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用。

酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。戊二醛二步法1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。2.标记步骤：(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。3.结果判定：(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。(2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程25px)。酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 440,000 160,000IgG量(3)本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。4.试剂及器材：(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。(2)1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。(3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。(5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。(8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。(9)HRP(RZ>3.0)。(10) Sephadex G-25层析柱(50px×1250px)。(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。简易过碘酸钠法本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。2.标记步骤:(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。3.结果判定：除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.624.试剂及器材:(1)0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml加蒸馏水至2,000ml。(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:Na２CO３ 0.32克NaHCO３ 0.586克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)NaBH４溶液(4mg／ml):临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。(三)工作浓度的选择在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４0.05ml终止反应。结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到最适的实验条件。(四)注意事项1.在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。2.所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。3.室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。4.浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。

细胞培养是细胞生物学研究方法中最常用也是最重要的技术之一，在现代医学、生物科学、农业科学等领域被广泛应用以提供研究模型和实验材料。在细胞培养过程中，完全培养基对细胞生长状态起到关键作用，决定实验成功与否。而血清是完全培养基中的关键成分之一，除为细胞生长提供基本营养物质、结合蛋白、一些参与解毒代谢的微量元素和可起到中和保护的酶类之外，还可以保护细胞免受机械损伤，因此被业内认为是细胞增殖过程中最重要的试剂。在生命科学领域的细胞培养技术中，动物血清的应用十分广泛，特别是牛来源血清。而牛源血清又分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，它们的区别方式主要由于牛龄和采血方式不同，其中胎牛血清因其抗体水平含量低对后续实验结果影响小、生长因子含量水平高利于细胞增殖而应用最广。因此关注胎牛血清的品级、质量以及使用过程的一些注意事项，会对实验结果起到直接影响作用，并可以确保科研人员在实验操作过程中的安全性。今天我们就来看看在细胞培养过程中血清使用方面常见的问题，如：血清储存条件、如何程序解冻、细胞污染与血清之间的关系、传说中的“黑胶虫”是什么以及血清热灭活是否有必要等等，“工欲善其事，必先利其器”，通过今天的解析与学习可以让我们在做细胞培养相关实验时事半功倍！Q1：血清长期储存的条件和方法是什么？A1：血清如需长期保存，则必须储存于-10℃或更低温冰箱中，建议存放于-20℃的冰箱中。研究表明储存在-80℃条件下的血清在性能方面变化不大，但由于解冻时温差过大，会导致析出更多沉淀，使得背景杂乱，因此血清长期保存不建议处于-80℃条件下。如果近期会频繁使用血清，我们建议不要在4℃条件下存放超过1个月，若一次无法用完整瓶建议分装后保存，且要避免反复冻融。另外，血清冰冻后体积会增加约10%，因此血清分装时请留意预留一定的体积空间。Q2：如何进行血清的程序性解冻？血清才不会使产品质量受损？A2：程序性解冻血清可以确保血清制品质量的稳定性，且不会因为温差过大而析出过多蛋白等沉淀。程序性解冻方法是于实验开始之前将冷冻的血清置于4℃冰箱中融解，并且在解冻过程中每隔1小时摇匀一次，使温度与成分均一，减少沉淀析出，直至全部解冻，然后再移入室温条件下使用。Q3：血清解冻后发现絮状沉淀该如何处理？A3：造成血清发生絮状沉淀的原因主要是血清解冻过程中温差带来了脂蛋白变性和纤维蛋白析出，沉淀本身不会影响血清质量，也不会对实验结果造成影响。但如必须处理沉淀，则可通过离心方式去除，如500-1000×g离心5-10 min。Q4：血清沉淀是什么？A4：用于细胞培养的胎牛血清及其他血类制品中均存在各种类型的沉淀，如纤维蛋白和磷酸钙等。一些絮状沉淀主要就是纤维蛋白，通常我们肉眼可见，大小在1-2mm之间；而磷酸钙在显微镜下观察呈现布朗运动的小黑点，通常被误认为是微生物污染。血清沉淀往往比较难以预测和控制，但幸运的是这些沉淀不会影响血清品质。Q5：血清中的小黑点是“黑胶虫”么？A5：血清解冻过程温差过大、经反复冻融或通过热灭活处理后更容易产生沉淀，这些沉淀物在镜下观察时有一些会呈现以布朗运动的小黑点，业内流行一种“黑胶虫”污染的说法，但“黑胶虫”一直以来都是极为神秘的存在，至今科学家们也没有完整的实验结果可以证实它究竟是一种生物还是非生物，更有人认为“黑胶虫”是血清的原虫，或误以为是细菌或真菌污染。但科学家通过进一步的研究发现它们更可能是血清中的蛋白结晶。这种结晶可能为蛋白析出，如纤维蛋白原凝结成纤维蛋白；或是盐析出，如磷酸钙等；也有一些是胆固醇和脂肪酸。Q6：如何判断血清污染？A6：（1）首先检查并判断外包装是否有破损，一般瓶身破损的血清发生污染的可能性极大；（2）将血清接种到血酯板上，培养后看是否有菌落形成；（3）可通过质量检测试剂盒检测结果判定，如支原体检测试剂盒等。血清污染主要包括细菌污染、真菌污染和支原体污染。在细胞培养时想要确定血清存在细菌污染，可尝试使用5-10倍浓度青链霉素双抗冲击培养24-48h；真菌污染的细胞无法抢救，应立即将细胞瓶进行高压灭菌处理，并彻底消毒培养箱；支原体污染可考虑更换早期代次细胞，或使用商品化支原体去除试剂。Q7：细胞形态不正常、生长状态异常或增殖速率缓慢是否与血清有关？A7：细胞形态异常需要综合关注细胞代次、传代操作、培养基和血清等诸多因素。如传代次数过多或传代时间过晚都有可能影响细胞的生长状态。有些细胞对血清具有一定适应性，更换新批次血清时可能出现所含因子水平的差异而导致的细胞生长状态受到影响的现象，可以通过血清梯度替换或者增加细胞适应时间来解决此类问题。与此同时也要关注基础培养基和传代操作等方面是否存在一定问题。Q8：如何做血清的梯度替换？A8：当细胞培养实验需更换血清品牌时，做程序性梯度替换方案尤为重要，因为不同品牌的血清所含成分有所差异，血清更换会使细胞发生不适，从而出现细胞增殖缓慢或细胞状态不佳等情况。建议的梯度替换方法为：完全培养基配置过程中先用25%新血清与75%原血清进行混合，培养传代1-2次；而后用50%新血清与50%原血清混合培养传代；再用75%新血清与25%原血清混合培养传代；最后完全使用新血清培养传代。Q9：培养基中添加血清和抗生素后可长期保存吗?A9：新鲜培养基中添加血清和抗生素后，建议在2周内使用完。Q10：血清的热灭活是必须的吗?A10：实验表明，经热灭活处理的血清对细胞生长可能仅有微小促进或完全没有任何作用，甚至通常因高温处理而损失掉血清中部分营养成分从而影响血清质量，造成细胞生长速率降低。热灭活过程中因局部温度过高、摇晃不均匀或灭活时间过长，都会造成血清品质下降，且经热灭活后的血清会增加发生蛋白沉淀概率。因此，若非必须血清不需要做热灭活，而少数对补体敏感的细胞实验，如某些免疫学实验或腺病毒包装等，可酌情对血清进行热灭活操作。Q11：血清热灭活应如何操作？A11：1.热灭活前，必须先将解冻后的血清摇匀，并恢复至室温；2.取部分摇匀血清置于50ml离心管中，并准备同规格对照管一个；3.对照管内加入血清等体积水；4.对照管内插入温度计进行温度预试，当温度达到 56℃时将恢复至室温的血清放入水浴锅30min；5.灭活过程中需要每隔5min轻轻晃动摇匀，以保证温度均一。Q12：血清为什么存在批间差？A12：血清批间差是客观存在的，因为血清制品来源于天然活体，供体牛只的生理状况、健康状况均不同，且受饲养环境的地形、风貌、饮食、水源等影响，体内各类蛋白、生长因子和酶类的含量均有巨大差异，所以血清具有含量复杂且不固定的特性，批间差异在所难免，因此批间差异小的血清不仅可以保证血清质量，确保细胞培养效果，还能减少由于批间差异带来的使用前测试，且避免实验结果的不可重复性。

大肠杆菌（E.coli）重组蛋白表达技术经过多年的发展，相对于其他表达体系，算是非常成熟的一个体系。大肠杆菌蛋白表达系统主要有以下特点：遗传背景清楚；易于培养和控制；转化操作简单；表达水平高；成本低；周期短。本篇将对大肠杆菌重组蛋白表达系统的常见技术问题进行一一解答。1、大肠杆菌表达体系的优点是什么？（1）菌体繁殖速度快：20分钟倍增一次，这意味着按照1/100的比例接种（MOI），只需要几个小时培养基细菌即可到达稳定期；（2）容易实现高密度培养：理论培养密度是1 × 1013 cells/ml，实际培养过程中使用LB培养基在37℃培养大肠杆菌，（3）转染外源DNA容易，质粒转染效率高。2、选择什么样的质粒体系？目前最为常用的重组蛋白表达质粒载体融合了复制子(Replicon)、启动子(promoter)、筛选标签(selection marker)、多克隆位点（MCS）和融合蛋白移出策略(fusion tag removal strategy)。复制子：包含复制起始点及相关顺式作用控制元件（cis-acting control elements）。在选择合适的质粒载体时，质粒拷贝数应当是需要考虑的一个重要参数。几个常用的载体系列，如pET、pUC、pACYC 、pBAD和pSC101。pET系列载体含有pMB1起始子，在单个菌体中通常含有15-60 copies，通过改造pET载体，可以获得双表达质粒（BiPlasmid vector），该质粒含有双MCS位点，双T7启动子，双lac操纵子和双核糖体结合位点；pUC系列含有一个突变版本的pMB1起始子，在该系列的载体在单个细菌通常有500–700 copies；pACYC和pBAD系列常被用于双表达体系，如FRET系统，该系列含有p15A起始子，单个细胞含有10-12个copies；pSC101系列载体单个细胞中的拷贝数通常启动子：重组蛋白大肠杆菌表达体系中，lac启动子是最为常用的启动子之一。当培养基中只存在乳糖（lactose）作为wei一碳源时，lac启动子被激活，开始重组蛋白表达。常用带T7启动系统的pET系列载体表达目的蛋白，当含有T7启动系统的质粒转染进入细菌后，挑取单克隆，培养并加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，一种非水解性的乳糖类似物）诱导细菌表达重组蛋白。为了消除重组蛋白本底表达，可以在原先的pET系列质粒载体基础上加入T7溶酶体与T7 RNAP（RNA polymerase）共表达，T7溶酶体能够结合T7 RNA聚合酶并限制T7启动子介导的起始转录。亲和标签：重组蛋白表达过程中采用亲和标签一方面是为了使蛋白纯化过程更加容易；另一方面是为了促进某些不溶性蛋白可溶。蛋白标签可分两类：一类是短肽类标签；一类是长肽以融合蛋白（fused partner）形式共表达。长肽类标签更多的作用是促进蛋白可溶性，往往需要同时加入短肽标签以帮助蛋白纯化；短肽类标签一般只含几个氨基酸，分子量均3、去除蛋白标签的方法有哪些？去除蛋白标签的方法分为两类，一类是酶消化法；一类是化学裂解法。化学裂解法通常被用于融合伴侣蛋白的移除，如CNBr用于裂解与Met氨基酸C-端连接的多肽，该方法优点是价格便宜，缺点是蛋白序列中不能存在Met氨基酸残基。酶消化法是目前最为常用的蛋白标签去除方法，如腸激脢（Enterokinase），凝血酶（thrombin），factor Xa和烟草蚀刻病毒蛋白酶 (TEV protease)等移除蛋白标签，只残留少数几个氨基酸残基。带有His标签的TEV蛋白酶逐渐被广泛接受用于蛋白标签移除实验，该蛋白酶具有一个非常优秀的特点:切除标签后，只残留一个Ser或Gly残基或完全不残留氨基酸残基。4、什么是合适的蛋白表达宿主？重组蛋白原核表达常采用BL21（DE3）和K-12衍生菌株作为表达宿主。BL21菌株缺乏Lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT，Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基质蛋白。同时BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突变，菌株失去甲基化和降解外源转染质粒的能力，使得质粒能够传代保留至子代细菌中（hsdSB突变基因来源于父辈B834菌株）。K-12系列菌株具有两大优点：一个是能够促进胞质中蛋白二硫键的形成，主要原因是trxB（thioredoxin reductase）基因发生突变；另外一个是recA基因突变，改基因突变后外源质粒在宿主菌种中得以稳定存在。5、大肠杆菌表达体系为什么会出现无或低蛋白表达的结果？诱导前后蛋白存在毒性或者表达过程中密码子有偏向性，都可能造成蛋白不表达或低表达的结果。建议从以下几个方面来解决问题：1）控制本底表达水平：基于lac-based启动子表达，加入葡萄糖；选择以葡萄糖为碳源培养基；基于T7-based启动子表达，使用含有T7溶酶体质粒；使用严谨控制型质粒，降低拷贝数。2）控制诱导表达水平：采用可调节启动子；采用可控制诱导菌株；降低拷贝数；采用适用毒性蛋白表达菌株；采取分泌性表达策略。3）优化质粒DNA密码子，以适应宿主密码子体系使用密码子调整菌株。4）增加生物质：尝试新培养基；改善通气条件，避免泡沐。6、为什么会形成包涵体？重组蛋白体系表达过程中，形成不正确的二硫键、进行错误的折叠、产生低可溶性蛋白，以及缺少翻译后修饰这一重要环节，都可能形成包涵体。可以采取以下策略来解决这些问题。1）使用胞质具有氧化功能的E. coli进行分泌性表达。2）共表达分子伴侣。3）补充含有化合物伴侣和共因子的培养基。4）移除诱导剂，增加新鲜培养基。5）通过低温诱导表达或调整诱导剂浓度来降低表达速率。6）改变融合伴侣蛋白，促进可溶蛋白表达。7）改变表达宿主，如原核改变成真核表达系统。

乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)是单一多肽，分子量18848u。HBcAg在HBV感染中占有重要地位，他能反映血清中：Dane颗粒的存在及肝内HBV的复制，并可与其他的HBV血清学标志物起互相配合和互相补充的作用。只是由于其抗体具有很强的亲和力，能迅速地与血清中的HBcAg结合，形成免疫复合物，因而难以在血清中测得游离的HBcAg。常用ELISA和IRMA双抗体夹心法检测HBcAg。产品名称：小鼠抗乙肝核心抗原产品货号：CR2123缓冲液成分：0.01M CB、PH:9.6、N防腐剂。蛋白浓度：OD280吸光值一般为7合蛋白浓度5mg/mL，但具体以标签标识为准。制备方法：大规模细胞培养或者单抗腹水中亲和提取。特异性：不和HBsAg和HBeAg发生结合。产品纯度：以抗体计不低于90%。储存方法：请避光存放在-20℃。注意事项：虽然本产品很稳定但您还是避免过于反复融化。如果每次使用很少量可以将本抗体适度分装，每次使用一管，如需长期4℃存放请联系我们定制。另外此抗体仅用于科研不可用于诊断。有效期限：请您在管体注明有效期内使用。克隆号和使用建议：此单克隆抗体克隆号有：C0克隆，单抗为小鼠Ig3亚类，轻链为Kappa。适合标记后配合HBcAg用于竞争法检测HBcAb的研究。

Hydrogen peroxide mediates spermidine-induced autophagy to alleviate salt stress in cucumber过氧化氢介导亚精胺诱导的自噬以缓解黄瓜的盐胁迫IF: 13.3文献介绍：自噬是一种进化上保守的细胞降解过程，在植物发育和胁迫反应中起着关键作用。尽管有大量关于自噬在应对环境压力中的重要作用的信息，但对自噬的调控知之甚少。在本研究中，我们证明了亚精胺（Spd）是一种多胺，在盐胁迫下通过激活（自噬相关）基因的表达和自噬体的形成参与黄瓜耐盐性的调节。此外，NADPH氧化酶衍生的质外体HO介导的Spd诱导耐盐性和自噬。外源Spd显著提高了对盐胁迫的耐受性，抑制了不溶性蛋白质的积累和泛素化。叶面喷施Spd可促进基因转录水平和自噬体形成。此外，Spd诱导了（呼吸爆发氧化酶同系物）的表达，以及HO在叶和根中的积累。然而，用二甲基硫脲（DMTU，一种HO清除剂）或二苯基碘氯化铵（DPI，NADPH氧化酶抑制剂）预处理都可以减少Spd诱导的质外体HO的积累。重要的是，当植物被DMTU或DPI预处理时，Spd诱导的耐盐性和自噬能力受到损害。此外，沉默和减少Spd诱导的耐盐性和自噬体形成。综上所述，这些结果表明，依赖性HO介导了Spd诱导的黄瓜自噬和耐盐性Asat：光饱和共同化速率；ATG：自噬相关；DCF-DA:2，7-二氯荧光素二乙酸酯；DMTU：二甲基硫脲；DPI：二苯基碘氯化铵；DW：干重；EL：电解液泄漏；FW：鲜重；Fv/Fm：光系统II的最大量子产率；绿色荧光蛋白；MDC：单丹酰尸胺；PDS：植物素去饱和酶；PE：磷脂酰乙醇胺；PLD：磷脂酶D；RBOH：呼吸爆发氧化酶同系物；ROS：活性氧；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；SIN1：盐诱导的NAC1；Spd：亚精胺；TOR：雷帕霉素的靶点；VIGS：病毒诱导的基因沉默。引用产品：Hoagland's(霍格兰氏)营养液(母液)货号：R18965产品介绍：植物组织培养技术即植物无菌培养技术，又称离体培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、花、茎尖、果实等)、组织(如形成层、表皮、表层、髓部细胞、胚乳等)或细胞(大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体，在细菌和适宜的人工培养基及环境条件下，能够诱导出愈伤组织、不定芽、不定根、最后形成完整菌株的技术。在配制培养基前，为了使用方便、简化操作、用量准确，减少每次配药称量各种化学成分所花费的时间和误差，常将配制培养基所需无机大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素成分分别配制成比需要量大若干倍的浓缩母液，当配制培养基时按预先计算好的量分别吸取各种母液即可。Hoagland's(霍格兰氏)营养液(母液)主要由磷酸二氢铵、硝酸钾、硝酸钙、硫酸镁、磷酸盐等组成，其中硝酸钙工作浓度为945mg/L、硝酸钾工作浓度为607mg/L、硫酸镁工作浓度为493mg/L，使用时按比例稀释即可使用，主要用于培养植物组织，检测植物生长速率。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。操作步骤(仅供参考):1、按试剂(A)：试剂(B)：试剂(C)：试剂(D)：蒸馏水=4：4：1：1：390(共400份)的比例充分混匀，调节pH至5.5~5.9，即为改良Hoagland's营养液。4℃保存1个月有效。2、如需做半剂量(1/2剂量)或1/4剂量，将上述营养液按比例加入蒸馏水稀释即可。有效期：12个月有效；常温运输，4℃保存。

　　抗凝是用物理或化学方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固。能够阻止血液凝固的物质,称为抗凝剂或抗凝物质。检查项目不同，所用的也不同。　　实验室常用抗凝剂的选择有以下几种，实验中最常出现的几个抗凝剂。　　(一)枸橼酸盐　　主要为枸橼酸三钠，能与血液中钙离子结合形成螯合物，从而阻止血液凝固。枸橼酸钠与血液的抗凝比例是1∶9或者1∶4，一般用于凝血和红细胞沉降率的检查。因其毒性小，也是输血保养液的成分之一。　　(二)肝素　　肝素是一种生理性抗凝剂，广泛在于肺、肝、脾等几乎所有组织和血管周围肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中。它是一种含硫酸基团的粘多糖，是分散物质，平均分子量为15000，带有较多负电荷。其抗凝机制较为复杂，主要是加强抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)灭活丝氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶的形成，并且有阻止血小板聚集等多种抗凝作用。每毫升血液抗凝需要肝素(15±2.5)IU，多为肝素的钠盐或钾盐 。它不影响血细胞体积，极少产生溶血，常用于血细胞比容、血pH、血气分析及其他生化测定，是红细胞渗透脆性试验理想的抗凝剂。每管加含肝素1g/L的溶液1mL，在60℃以下烘干备用，可使5～10 mL血液不凝。肝素抗凝血不适于血涂片检查。因其在瑞氏染色时会出现背景偏蓝，不适全血液学一般检查，也不适合凝血因子的检查。　　(三)乙二胺四乙酸盐(EDTA)　　常用的有钠盐和钾盐，能与血液中的钙离子结合形成螯合物，使钙离子失去凝血作用，从而达到抗凝目的。对血细胞形态和血小板计数影响很小，适用于多项血液学检查，尤其是血小板计数，但钠盐溶解度低于钾盐，EDTA-K2最适用于全血细胞分析及血细胞比容测定，室温下6h，红细胞体积不改变。国际血液学标准化委员会(ICSH)建议血细胞计数使用EDTA-K2作为抗凝剂，用量为EDTA-K2-2H2O 1.5~2.2mg/ml血液。EDTA可抑制血小板聚集，不适用于凝血检查及血小板功能试验。　　(四)草酸盐　　常用的有草酸钠、草酸钾和草酸铵，草酸根与血液的钙离子形成草酸钙沉淀使钙离子失去凝血作用而阻止凝血。此种抗凝剂溶解度大，抗凝作用强。2mg可使1mL血不凝。因草酸盐与血液中钙离子结合生成草酸钙沉淀，可使血细胞形态发生变化，故不宜制作血涂片检查。同时草酸盐也影响血液中某些成分的生物活性，故血液学中很少应用。　　双草酸盐抗凝剂是以草酸钾和草酸铵按一定比例(通常4∶6)混合而成，适于血细胞比容测定。

　　一、缓冲液的含义　　当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化的作用，称为缓冲作用，这样的溶液叫做缓冲溶液。弱酸及其盐的混合溶液（如HOAc与NaOAc），弱碱及其盐的混合溶液（如NH3·H2O与NH4Cl）等都是缓冲溶液。　　二、缓冲液的种类　　1、弱酸及其盐（弱酸及其共轭碱）体系pH=pKaφ±1　　（1）醋酸－醋酸钠缓冲液　　取醋酸钠18g,加冰醋/酸9.8ml,再加水稀释至1000ml，即得。　　（2）醋酸－醋酸钠缓冲液　　取无水醋酸钠20g，加水300ml溶解后,加溴酚蓝指示液1ml及冰醋/酸60～80ml，至溶液从蓝色转变为纯绿色，再加水稀释至1000ml，即得。　　（3）磷酸盐缓冲液　　取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧/化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，即得。　　2、弱碱及其盐（弱碱及其共轭酸）体系pOH=pKbφ±1　　（1）氨－氯化铵缓冲液　　取氯化铵1.07g，加水使溶解成100ml， 再加稀氨溶液(1→30)调节pH值至8.0，即得。　　（2）氨－氯化铵缓冲液　　取氯化铵5.4g，加水20ml溶解后，加浓氨溶液35ml，再加水稀释至100ml，即得。

一、标准物质的定义按照《国际通用计量学基本术语》和《国际标准化组织指南30》，标准物质有如下定义：1、标准物质（Reference Material）（RM）具有一种或多种规定特性足够均匀且稳定的材料，已被确定其符合测量过程的预期用途。2、有证标准物质（Certified Reference Material）（CRM）采用计量学上有效程序测定的一种或多种规定特性的标准物质/标准样品(RM)，并附有证书提供规定特性值及其不确定度和计量溯源性的陈述。3、基准标准物质（Primary Reference Material）（PRM）这是一个比较新的概念。国际计量委员会（CIPM）于1993年建立了物质量咨询委员会（CCQM），在1995年的物质量咨询委员会会议上提出了如下定义：基准方法（Primary Method of Measurement）（PMM）具有最高计量品质的测量方法，它的操作可以完全的被描述和理解，其不确定度可以用SI单位表述，测量结果不依赖被测量的测量标准。基准标准物质：一种具有最高计量品质、用基准方法确定量值的标准物质。标准物质已经确定了具有一个或多个足够均匀的特性值的物质或材料，作为分析测量行业中的“量具"，在校准测量仪器和装置、评价测量分析方法、测量物质或材料特性值和考核分析人员的操作技术水平，以及在生产过程中产品的质量控制等领域起着不可或缺的作用。根据定义标准物质具有三个显著特点：1. 具有特性量值的准确性、均匀性、稳定性;2. 量值具有传递性;3. 实物形式的计量标准。其中，准确性、均匀性和稳定性是标准物质量值的特性和基本要求。下面具体分析一下：1）准确性定值准确，可靠是标准物质的主要特征，通常标准物质证书中会同时给出标准物质的标准值和计量的不确定度，不确定度的来源包括称量、仪器、均匀性、稳定性、不同实验室之间以及不同方法所产生的不确定度均需计算在内。2）均匀性材质均匀是标准物质的首要条件，计量方法的精密度即标准偏差可以用来衡量标准物质的均匀性，精密度受取样量的影响，标准物质的均匀性是对给定的取样量而言的，均匀性检验的小取样量一般都会在标准物质证书中给出。3）稳定性稳定性是指标准物质在指定的环境条件和时间内，其特性值保持在规定的范围内的能力。根据标准物质的特性，通常把标准物质分为一级标准物质和二级标准物质。1. 一级标准物质：主要用于标定比它低一级的标准物质、校准高准确度的计量仪器、研究与评定标准方法;2. 二级标准物质：主要用于满足一些一般的检测分析需求，以及社会行业的一般要求，作为工作标准物质直接使用，用于现场方法的研究和评价，用于较低要求的日常分析测量。标准物质的用途1、校准2、建立计量溯源性3、为其他材料赋值4、测量方法/程序确认5、测量质量控制6、药品检测标准物质，有助于保证药物及相关产品符合管理者和法规的质量要求。

　　酸碱缓冲溶液有三种类型：　　1、弱酸和它的盐（如：HAc---NaAc）的水溶液组成；　　2、弱碱和它的盐（如：NH3·H2O---NH4Cl）的水溶液组成；　　3、多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐（如：NaH2PO4---Na2HPO4）的水溶液组成。　　酸碱缓冲溶液的选型一般应根据具体情况进行选择。缓冲酸性可选用碱性缓冲液，缓冲酸性可采用碱性缓冲液。常用作缓冲溶液的酸类由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液具有缓冲作用。生化实验室常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴bi妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的化学反应。　　【酸碱缓冲溶液】由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。这种溶液称为酸碱缓冲溶液。

1．蛋白质测定的Folin-酚比色法（即Lowry法）的定量范围为5～100μg蛋白质，灵敏度高；但操作要费较长时间，且Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用；不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度也稍有不同。 紫外吸收法测蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。但该法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液中有时混杂有核酸，应予以校正2．当样品中含有核酸类杂质，可以根据核酸在260nm波长处有最强的紫外光吸收，而蛋白质在280nm处有最大的紫外光吸收的性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差

Hoechst染色方法1．贴壁细胞1)   取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。2)   刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。3)   去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。4)   加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。5)   用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。6)   滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。7)   荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。2. 悬浮细胞1)   离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。2)   离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。3)   最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。4)   稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。5)   均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。6)   用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。7)   滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。8)   H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。3. 组织切片1)   常规包埋切片后，脱蜡，透明。2)   PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。可在六孔板中操作。3)   加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动。4)   用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。5)   将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。6)   荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

　　IgG抗体（immunoglobulin G）在免疫应答中起着激活补体，中和多种毒素的作用。IgG抗体持续时间长，是唯1能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。它们还从乳腺分泌进入初乳，使新生儿第一时间得到抗体保护。IgG是四链单体，占血清Ig总量的75%，是血清和细胞外液中最主要的抗体成分，可将人IgG分为四个亚类，依其在血清中浓度高低，分别为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG自出生后三个月开始合成，三到五岁接近成人水平。主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生，血清半衰期较长，约20~23天，是再次体液免疫应答产生的主要抗体，其亲和力高，在体内广泛分布，具有重要的免疫效应，是机体抗感染的主力军，故临床使用丙种球蛋白进行免疫治疗时，应以每2～3周注射一次为宜。　　IgG1、IgG3、IgG4可穿过胎盘屏障，在新生儿抗感染免疫中起重要作用；IgG1、IgG2、IgG4可通过其Fc段与葡萄球菌蛋白A（SPA）结合，借此可纯化抗体，或用于免疫诊断；IgG1、IgG3可高效激活补体，并可与巨噬细胞、NK细胞表面Fc受体结合，发挥调理作用、ADCC作用等；某些自身抗体和引起二、三型超敏反应的抗体也属于IgG。　　IgG抗体的功能简介　　1.激活补体经典途径，介导溶菌和细胞毒作用；　　2.介导ADCC效应；　　3.调理吞噬作用；　　4.结合SPA；　　5.中和毒素和病毒。　　在抗感染免疫尤其是再次免疫应答中发挥重要作用。IgG类自身抗体参与Ⅱ、Ⅲ型超敏反应。　　我司所有IgG抗体产品仅供科研实验使用！

　　（1）酶原（zymogen）　　某些酶在细胞内合成或初分泌时没有活性，这些没有活性的酶的前身称为酶原(zymogen),使酶原转变为有活性酶的作用称为酶原激活(zymogenactivation)。　　比较著名的例子是消化酶的酶原（胃蛋白酶原，胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原）和血液凝固酶的酶原（凝血酶原，纤溶酶原）。酶原可以贮存在其合成部位而没有引起细胞或组织自我消化（水解）的危险，待细胞需要时再被激活。·某些酶在细胞内合成或初分泌时没有活性，这些没有活性的酶的前身称为酶原(zymogen),使酶原转变为有活性酶的作用称为酶原激活(zymogenactivation)。　　酶原之所以没活性是因为活性中心未形成或未暴露。　　（2）酶（enzyme）　　早期是指inyeast在酵母中的意思,指由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。如哺乳动物的细胞就含有几千种酶。它们或是溶解于细胞液中，或是与各种膜结构结合在一起，或是位于细胞内其他结构的特定位置上。这些酶统称胞内酶；另外，还有一些在细胞内合成后再分泌至细胞外的酶——胞外酶。酶催化化学反应的能力叫酶活力（或称酶活性）。　　酶活力可受多种因素的调节控制，从而使生物体能适应外界条件的变化，维持生命活动。没有酶的参与，新陈代谢只能以极其缓慢的速度进行，生命活动就根本无法维持。例如食物必须在酶的作用下降解成小分子，才能透过肠壁，被组织吸收和利用。在胃里有胃蛋白酶，在肠里有胰脏分泌的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等。又如食物的氧化是动物能量的来源，其氧化过程也是在一系列酶的催化下完成的。

每年1月1日，标志着新年的到来，人们习惯将这天称为“元旦”，俗称“公历年”、“阳历年”或“新历年”。2024年元旦放假安排来了！感谢您对远慕生物一直以来的支持。在您的支持和信赖下，我们才得以在激烈的市场环境下不断进步！根据国务院办公厅通知，公司对元旦放假安排如下：2024年元旦2023年12月30日（星期六）至2024年1月1日（星期一）放假 共3天。如有需要请客户及早下单备货以免耽误您的宝贵时间，在此远慕生物携全体员工祝您节日愉快，身体健康，工作顺利！

Effects of tannic acid on the immunity and intestinal health of broiler chickens with necrotic enteritis infectionIF: 7文献引用产品：鸡分泌型免疫球蛋白A(SIgA)ELISA试剂盒品牌：远慕生物货号：YM-A3724AbstractBackground In broiler chickens, necrotic enteritis (NE) infection can reduce production performance. Tannic acid has shown great potential as a treatment of NE in broilers. However, the appropriate dosage of tannic acid in NE of broilers and the improvement effect on intestinal health are not very clear. In this study, we aimed to investigate the effects of different doses of tannic acid on the production performance, immunity, and intestinal health of broilers by constructing an NE model with C. perfringens infection and determining the appropriate dosage of tannic acid with regard to NE.Results Challenged birds showed significant reduction in body weight, villus height, and the ratio of villus height to crypt depth (P Conclusions Tannic acid in the diet alleviated NE by enhancing the intestinal barrier and absorption function. The recommended dietary tannic acid additive level is 500–750 mg/kg. Our study findings would be useful in reducing related economic losses in the broiler industry.Keywords Broiler chicken, Immunity, Intestinal health, Necrotic enteritis, Tannic acid

一. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？一般来说，如果用多聚赖氨酸包被过的片子做正常免疫组织化学染色的话是不会掉片子的。但如果要做抗原修复的话，如果片子处理不好的话是有可能掉片子的。你可以试试一下的方法：1.一般用APES：丙酮=1:50的处理液来处理片子，处理5min左右，然后水洗，烘干既可用于贴片。如果把水滴再处理好的片子上，水比较聚的话说明片子处理的好。2.贴片子的时候，展片的时间要把握好，不要太长，否则不利于贴牢。3.烤片子也很重要，切好的片子最好先不要马上收起来，而是水平至于烘片台上37度两个小时以上，一是水分彻底烘干。然后做染色前最好再在60度烘箱烘1个小时。4.再补充一点 ，石蜡包埋时，酒精梯度脱水以及浸蜡等一点要充分，这对贴片也有影响。如果这些导致掉片的因素都已经排除但是片子还是掉的厉害，那么也可能是以下原因造成的：1、多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。2、组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。3、组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。4、没烤好，时间短温度不够之类。5、操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。6、修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。二. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系，可能原因有：1.切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。2.有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。3.如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。三. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？a.也许是抗体本身有问题，因为有很多公司的抗体质量并不好，很容易上背景，可以换一种抗体 试试。b.如果经费不允许换抗体的话，你可降低抗体的浓度，并随时注意观察显色，在能看到信号的情况下尽量降低背景。c.可以换一种封闭液，不同的封闭液对某种来源的抗体来说，会有不同的封闭效果。d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所检测动物组织的正常血清，这样可以去除一部分非特异性染色。全片着色：全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会 游离出 氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到 理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组 化染 色，如果将装有切片和修复液的容器放在4?C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太 长。（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。四. 免疫组化结果老是出现阴性结果？免疫组化出现阴性结果有可能组织本身就没有信号，也有可能是抗体出了问题。可以找一些阳性组织做一下，以确定是抗体的问题还是组织本身就没有所检测的抗原表达。还有，可以提高抗体的浓度，或者试一试抗原修复等方法，也许会得到意想不到的结果。五. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？1. 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。六. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。关于抗原修复，我个人的观点和panther75有点不同。我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果 来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加 热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是在载玻片四周垫些棉花什么的，然后盖 上盖玻片，这样修复的话就能够尽量减少载玻片上小气泡的形成。我们用的微波修复条件为：2.94g柠檬酸三钠溶于1000ml的水，调ph值至6.0，微波修复10分钟。你可以试试，时间可以根据需要自己调整。七. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？用石蜡切片做免疫组化是不需要透膜处理的，一是因为石蜡切片比较薄，另外一个原因我认为是在包埋过程中细胞膜已经被破坏，所以这一步可以省略。八. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？复染时间不需要太长，当然这也要根据苏木精的质量来确定，但基本上不要超多一分钟。染色过深的话可以用酸性的水溶液（在水里滴加少量浓盐酸）分色，分色的另 外一个目的是洗掉苏木精在细胞质中的非特异性结合，这样可以使细胞质中的特异信号更明显。所以不管复染是不是过度，分色这一步最好不要省掉。分色后记得再 用氨水返蓝一下。

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。01.引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为宜。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。02.酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。03.dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL缓冲液将其pH值调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)。当其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。04.模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理样本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。05.Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

　　细胞培养中常见污染的是细菌、真菌和支原体污染。细胞一旦污染，大多数较难处理（只有扔）。那么，哪些情况我们不注意的话就会造成细胞污染呢？接下来一起来了解一下。　　一、违规操作：　　1. 为节省时间，有人已经用超净台四个多小时，不开紫外灭菌30min,酒精擦拭后直接开始试验。　　2. 器材或者溶液很久没用，未检测是否污染而直接使用；离心管多次使用，枪头为了方便交叉使用。　　3. 超净台不点酒精灯；点了酒精灯放在右上角，而你在左下角做试验。　　4. 不带手套，徒手操作。　　5. 细胞培养间配备枪式移液器、手术器械、离心机、冰箱等仪器设备以及的实验服和拖鞋，未定期消毒。物品被带出细胞房使用。培养细胞过程中使用的所有实验用具，如移液管、一次性枪头、一次性塑料离心管、冻存管等未按要求灭菌使用（通常需121°C高压灭菌20分钟后37％烤干备用）。　　二、超净台和桌面，东西太多太乱　　超净台不是储物箱，什么培养皿、各种规格的板子、枪头就不要堆在超净台！这样就会有许多紫外线顾不到的卫生死角。细胞房其他的桌面，切忌东西堆积如山，不要将酒精棉球、标签纸、牛皮纸买来后全部堆在细胞房！一不小心“飘”进你的细胞培养板里，细胞就会养的不好，啥时候死了都不知道！　　三、培养箱太久没清洁　　细胞污染了，并非直接扔了培养皿就不管了，首先你还得看看这个恒温培养箱里其他培养皿或孔板里的细胞是否污染，如果有而且好几个板子都有类似的污染块，那很可能是培养箱中的水或者空气污染了，得给培养箱做个大扫除，重新酒精消毒，照紫外；孵箱里的水，水没了要记得加，还得记得十天半个月的就用酒精擦擦托盘。　　四、细胞房人多口杂，难管理　　在细胞房这种卫生要求高，人多了，不确定因素多了，难以保证试验在无菌条件下操作。出入试验室，实验服当风衣穿，不扣纽扣，不戴鞋套，就容易造成细胞污染；超净台做实验时，喜欢说话聊着做试验，要是还不带口罩，里面就有很多细菌等着去攻击你的细胞呢！

　　配制微生物培养基需要：　　1、根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。　　2、注意各种营养物质的浓度及合适配比，保持合适渗透压。　　3、将培养基的 pH 控制在适宜的范围之内，以利于不同类型微生物的生长繁殖或代谢产物的积累。　　4、要注意各种原料的配比，每种培养基的配比合适的配比，可以按照老师的要求去做。　　5、如需要加热的时候注意时间的把握。　　步骤：　　(一)准确称量试剂：根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基，培养基所需试剂必须纯净。　　(二)校正pH值：将称量好的培养基各种成分放入容器内，标记划线，加热溶解，补充水分，测定酸碱度，常用pH6.8～8.0的精密试纸或酸度计测定。用1NNaOH和1N HCl调节pH值到适宜范围内。　　(三)过滤：将玻璃漏斗置铁架上，再用纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中，将上述培养基倒入其中过滤至透明。　　(四)分装：将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内(试管内每支装5mL；三角瓶中装100～150ml)，塞好棉塞用牛皮纸包扎好，准备灭菌。　　(五)灭菌：培养基的灭菌，常用高压蒸汽灭菌法。一般微生物的营养细胞在水中煮沸后即被杀死，但细菌的芽胞有较强的抗热性，须经高压蒸汽灭菌才能达到彻底灭菌的目的。根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理，即压力越大，蒸汽温度就越高。因此，在同一温度条件下，采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下，菌体吸收水分后，其蛋白质易于凝固变性，因为蒸汽的穿透力强，杀菌效果好。

IF: 14.9 Promotion effect of TGF-β-Zfp423-ApoD pathway on lip sensory recovery after nerve sacrifice caused by nerve collateral compensation文献使用产品：大鼠载脂蛋白D(apo-D)elisa试剂盒供应商：远慕生物摘要：Resection of oral and maxillofacial tumors is often accompanied by the inferior alveolar nerve neurectomy, resulting in abnormal sensation in lower lip. It is generally believed that spontaneous sensory recovery in this nerve injury is difficult. However, during our follow-up, patients with inferior alveolar nerve sacrifice showed different degrees of lower lip sensory recovery. In this study, a prospective cohort study was conducted to demonstrate this phenomenon and analyze the factors influencing sensory recovery. A mental nerve transection model of Thy1-YFP mice and tissue clearing technique were used to explore possible mechanisms in this process. Gene silencing and overexpression experiments were then conducted to detect the changes in cell morphology and molecular markers. In our follow-up, 75% of patients with unilateral inferior alveolar nerve neurectomy had complete sensory recovery of the lower lip 12 months postoperatively. Patients with younger age, malignant tumors, and preservation of ipsilateral buccal and lingual nerves had a shorter recovery time. The buccal nerve collateral sprouting compensation was observed in the lower lip tissue of Thy1-YFP mice. ApoD was demonstrated to be involved in axon growth and peripheral nerve sensory recovery in the animal model. TGF-β inhibited the expression of STAT3 and the transcription of ApoD in Schwann cells through Zfp423. Overall, after sacrificing the inferior alveolar nerve, the collateral compensation of the ipsilateral buccal nerve could innervate the sensation. And this process was regulated by TGF-β-Zfp423-ApoD pathway.

磷酸盐标准溶液是用于化学分析中的一种常见试剂，常常用于测定水样中的磷含量、环境监测及生物化学研究等领域。如制作标准工作曲线、验证仪器的准确度、作为水样标准的对比浓度、研究磷酸盐浓度对实验的影响等。磷酸盐标准溶液的制备方法1.选用高纯度的磷酸二氢钾和氢氧化钠，以及去离子水。2. 在清洁的容器中，称取适量的磷酸二氢钾，将其溶于去离子水中，直至完全溶解。3. 将氢氧化钠溶液缓慢加入到磷酸二氢钾溶液中，并用磁力搅拌器充分搅拌，直到pH值稳定在7.0左右。4. 将溶液转移至250毫升容量瓶中，加入足够的去离子水，使溶液体积达到标记线。5. 用色谱法或重量法准确测定制备的磷酸盐标准溶液的浓度，以确保其精确度和准确性。磷酸盐标准溶液的配制过程中的注意事项1.在制备磷酸盐标准溶液的过程中，必须注意杂质的控制，避免对溶液的影响。2. 制备过程中要注意操作的精细，尽可能避免系统误差。3. 制备完毕的磷酸盐标准溶液必须密封保存，防止被空气氧化影响其质量。4. 使用前，需先充分均匀混合，以确保浓度均匀。磷酸盐标准溶液的应用领域1.环境监测：用于测试水中的磷含量，并进行环境污染监测。2. 生物化学研究：用于分子生物学和生物化学中的实验分析。3. 化学分析：主要用于气相色谱、液相色谱、毛细管电泳和萤光法等分析技术中。磷酸盐标准溶液是一种广泛应用的试剂，具有精确度高、灵敏度强等优点，因此在科学研究和实验分析中扮演着极其重要的角色。

任何检测均会产生检测误差，分析测试误差来源很多，如，样品的代表性、均匀性、稳定性。质量保证的任务就是把所有的误差，包括：系统误差、随机误差，减少到预期的水平。分析测试的质量保证可分为取样的质量保证和分析检测系统的质量保证两大方面。质量保证的两大方面取样的质量保证：样品是从大量物质中选取的一部分物质；样品的测定结果是总体特性量的估计值；由于总体物质的不均匀性，用样品的测定结果推断总体，必然引入误差，称此误差为取样误差；取样误差可分为随机误差和系统误差；1、取样的随机误差：由取样过程中无法控制的随机因素引起，增加取样次数，加大取样量，可减小取样的随机误差。2、取样的系统误差：由于取样方案不完善、取样设备有缺陷、操作不正确、环境等影响因素引起的，该误差只能通过严格的取样质量保证工作避免或消除。取样误差总是和测量误差相关联，通过重复测定多个实验室样品和一个实验室样品的多次测定，可估计取样误差。分析检测过程的质量控制分析检测过程一般包括样品的处理、测量方法和计量标准的选用、测量仪器的校准、测定、数据的统计分析和报告测量结果，其中每个环节都和测量者的操作技术、理论知识和质量意识密切相关。样品处理与回收率在样品处理过程中可能产生溶解、分离、富集不完全，或被测组分挥发、分解而产生负的系统误差；另一方面还会由于器皿、化学试剂、环境和操作者玷污被测组分而产生正的系统误差。在样品处理过程中即使没有产生明显的系统误差，也会引入较大的随机误差。分析空白的控制与校正（1）分析空白及其作用：分析空白及其变动性对痕量和超痕量分析结果的准确度、精密度以及分析方法的检出限起着决定性作用。（2）分析空白的控制：主要有以下几点：①消除或控制实验环境对样品的玷污；②化学试剂对样品中被测组分的玷污随试剂纯度和用量而变；③贮存、处理样品所用的器皿，如果材质不纯或者未洗涤干净均可能玷污样品；④避免分析者对样品的玷污。（3）空白试验：根据空白试验值及其标准差，对试样测定值进行空白校正。测量方法的适用性（1）测量方法的类别与等级：现有标准方法数以千计，大体可分为3种类型：①检测产品技术规格的普及型标准方法。②为贯彻某些法规而开发的标准方法，称为官方方法。如，美国官方分析化学家协会（AOAC）拟定了用于分析食品、药品、肥料、农药、化妆品的标准方法，以保证有关农业和公共健康法规的贯彻。③基础性标准方法，如，英国分析化学学会（SAC）拟定的分析方法和美国材料测试学会（ASTM）拟定的标准方法。（2）测量方法的主要技术参数和控制指标：包括：线性范围、准确度、精密度、灵敏度、检出限。测量方法的校准测量方法校准的目的是建立测量信号与被测化学成分量值的函数关系，即物理信号与化学成分定量关系。制作准确而有效的校准曲线是获得准确可靠测量结果的重要前提。（1）使用准确可靠的计量标准（2）消除或者测定干扰与基体效应的影响（3）控制实验条件，合理设计实验应按以下原则设计实验：①为了尽可能保持测量样品的实验条件与制作校准曲线的条件一致，应在较短时间间隔内制作和使用校准曲线；②校准曲线上的实验点数最好在5个以上，且实验点的量值范围尽可能宽，以提高校准曲线的可靠性与稳定性；③各实验点最好作重复测量取平均值，至少应在校准曲线的端点作重复测定，以减少实验误差。标准分析方法和分析方法标准化标准分析方法又称分析方法标准，是技术标准中的一种。一个项目的测定往往有多种可供选择的方法，这些方法的灵敏度不同。对仪器和操作的要求不同。而且由于方法的原理不同，干扰因素也不同，甚至其结果的表示含义也不尽相同。实验室重视检验工作，满足社会对检验数据的质量要求，就必须对影响检验数据的技术人员、仪器设备、样品处置、检测方法、药品试剂、环境条件、量值溯源等所谓人、机、样、法、环、溯诸多因素作为一个有机的整体进行全面控制，系统地、协调地将检验工作全过程涉及到影响检验质量的、对其质量形成过程中各个活动的相互联系和相互关系加以有效的控制，才能确保检验数据的准确公正、真实可靠，才能保证实验室分析测试工作质量的不断改进和提高。具体阐述如下：（1）人员人员是最宝贵的资源。一个实验室水平的高低优劣，很大程度上取决于人员素质与水平。（2）仪器设备仪器设备是实验室开展检测工作所必需的重要资源，是保证检测工作质量、获取可靠测量数据的基础。（3）药品试剂药品试剂是指检测用的消耗性材料。随着社会的发展，人们对检测精度要求越来越高，从常量到微量、再到痕量、超痕量分析，待测元素含量很低、甚至极微，对药品试剂的纯度要求、质量要求就很严。实验试剂质量的优劣直接影响检测工作质量，主要有两种情形：一种是试剂不纯（本身含有被测组分）而使结果偏高；另一种是试剂灵敏度降低或失效而影响检测结果的准确性。实验室应建立药品试剂的采购验收制度，建立试剂验证、合格（不合格）记录和合格供方名录制度，确保试剂符合技术规范要求，同时为正确采购提供依据。化学试剂等消耗品的采购是整个检测工作中的重要组成部分，试剂直接影响检测工作质量，因此必须对外部支持服务和供应品的质量进行严格控制，以确保检测质量不受影响。（4）检测方法检测方法是实验室实施检测工作的依据，是确保分析数据质量最重要的因素。检测方法不同，质量水平不同。（5）环境环境是指实验设施和环境条件。为保证检验工作质量，实验室的设施和环境条件必须满足工作需要。（6）量值溯源量值溯源是指通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准值能够与规定的参考标准（国家计量标准或国际测量标准）联系起来的一种特性，量值溯源是检验工作中的关键环节。（7）样品处置样品处置是指对送检样品进行分析检测。实验室应根据国家技术规范或标准编制样品采集、封存运输、交接验收、留样保存的程序；对有特殊检测要求的样品，应配备符合样品储存条件的设备设施，以避免样品在保存或检验过程中发生变质、损坏或交叉污染，确保检测样品的完整性和检测结果的有效性。

 ONCOLOGY RESEARCH （IF=3.1 ）LSM12 facilitates the progression of colorectal cancer by activating the WNT/CTNNB1 signaling pathway文献引用产品： 10%甲醛固定液  摘要: Aberrant activation of the WNT signaling pathway is a joint event in colorectal cancer (CRC), but the molecular mechanism is still unclear. Recently, RNA-splicing factor LSM12 (like-Sm protein 12) is highly expressed in CRC tissues. This study aimed to verify whether LSM12 is involved in regulating CRC progression via regulating the WNT signaling pathway. Here, we found that LSM12 is highly expressed in CRC patient-derived tissues and cells. LSM12 is involved in the proliferation, invasion, and apoptosis of CRC cells, similar to the function of WNT signaling in CRC. Furthermore, protein interaction simulation and biochemical experiments proved that LSM12 directly binds to CTNNB1 (also known as β-Catenin) and regulates its protein stability to affect the CTTNB1-LEF1-TCF1 transcriptional complex formation and the associated WNT downstream signaling pathway. LSM12 depletion in CRC cells decreased the in vivo tumor growth through repression of cancer cell growth and acceleration of cancer cell apoptosis. Taken together, we suggest that the high expression of LSM12 is a novel factor leading to aberrant WNT signaling activation, and that strategies targeting this molecular mechanism may contribute to developing a new therapeutic method for CRC. 

一、细胞因子受体的结构和分类根据细胞因子受体cDNA序列以及受体胞膜外区氨基酸序列的同源性和结构性,可将细胞因子受体主要分为四种类型:免疫球蛋白超家族(IGSF)、造血细胞因子受体超家族、神经生长因子受体超家族和趋化因子受体。此外,还有些细胞因子受体的结构尚未完全搞清,如IL-10R、IL-12R等;有的细胞因子受体结构虽已搞清,但尚未归类,如IL-2Rα链(CD25)。(一)免疫球蛋白超家族该家族成员胞膜外部分均具有一个或数个免疫球蛋白(Ig)样结构。已知,属于IGSF成员的细胞因子受体的IL-1RtI(CD121a)、IL-1RtⅡ(CD121b)、IL-6Rα链(CD126)、gp130(CDw130)、G-CSFR、M-CSFR(CD115)、SCFR(CD117)和PDGFR,并可分为几种不同的结构类型,不同IGSF结构类型的受体其信号转导途径也有差别。(1)M-CSFR、SCFR和PDGFR:胞膜外区均含有5个Ig样结构域,其中靠近胞膜区为1个V样结构,其余4个为C2样结构。受体通常以二聚体形式与相应的同源二聚体配体结合。受体胞浆区本身含有蛋白酷氨酸激酶(proteintyrosinekinase,PTK)结构。(2)IL-1RtI和IL-1RtⅡ:胞膜外区均含有3个C2样结构,受体胞浆区丝氨酸/苏氨酸磷酸化可能与受体介导的信号转导有关。(3)IL-6Rα链、gp130以及G-CSFR:胞膜外区N端均含1个C2样区,在靠近胞膜侧各有1个红细胞生成素受体超家族结构域,此外在胞有胞膜外区还含有2-4个纤粘连素结构域。gp130胞浆区酷氨酸磷酸化与信号转导有关。这种结构类型的受体其相应配体IL-6、OSM、LIF和G-CSF在氨基酸序列和分子结构上也有很大的相似性。(二)造血细胞因子受体超家族造血细胞因子受体超家族(haemopoieticcytokinereceptorsuperfamily)又称细胞因子受体家族(cytokinereceptorfamily),可分为红细胞生成素受体超家族(erythropoietinreceptorsuperfamily,ERS)和干扰素受体家族(interferonreceptorfamily)。1.ERSERS所有成员胞膜外区与红细胞生成素(erythropoietin,EPO)受体胞膜外区体在氨基酸序列上有较高的同源性,分子结构上也有较大的相似性,故得名。(1)ERS的成员:属于ERS的成员有EPOR、血小板生成素R、IL-2β链(CD122)、IL-2Rγ链、IL-3Rα链(CD123)、IL-3Rβ、IIL-4R(CDw124)、IL-5Rα链、IL-5βα链、IL-5Rβ链、IL-6Rα链(CD126)、gp130(CDw123)、IL-7R、IL-9R、IL-11R、IL-1240kDa亚单位、G-CSFR、GM-CSFRα链、GM=CSFRβ链、LIFR、CNTFR等,此外,某些激素如生长激素受体(GRGR)和促乳素受体(PRLR)亦属于ERS。(2)ERS的结构特征:红细胞生成素受体超家族成员在胞膜外与配体结合部位有一个约含210氨基酸残基的牲性同源区域,主要特点①同源区靠近N端有4个高并能保守的半胱氨酸残基Cysl、Cys2、Cys3、Cys4和1个保守的钯氨酸,Cys1与Cys2之间、Cys3与Cys4之间形成两个二硫键。②同源区靠近细胞膜处,约在细胞膜外18～22氨基酸基处有一个色氨酸一丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基序,所谓Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser即WSXWS基序,其生物学功能尚不明了。IL-3α链、IL-3Rβ链、GM-CSFRβ链、LIFR办有两个ERS结构域,其中GM-CSFRβ链第一个ERS结构中有一个类似WSXWS基序,即为脯氨酸一丝氨酸-赖氨酸-色氨酸-丝氨酸(PSKWS)基序。1994年Hilton等合成WSXWS基序相应的寡核苷酸为探针,从成鼠肝cDNA文库中克隆小鼠IL-11受体α链cDNA获得成功。IL-6Rα链和gp130以及G-CSFrN端有一个IGSF结构。IL-7R靠近N端侧的部位只有Cys1和Cys3,与其它成员相比,缺乏Cys2和Cys4以及色氨酸残基。IL-1240kDa亚单位有ERS的同源结构,但为非膜结合的,而且与IL-12另一35kDa亚单位通过二硫键开成异源双体。GM-CSFrN端在ERS中可以看作由2个Ⅲ型纤维粘连素组成,每个Ⅲ型纤维粘连素结构域由7股反平行β折叠股形成一个桶状结构,两个桶状结构之间的槽是配体膜外保守区域有明显的进化同源性,这种同源性的程度与IGSF成员间相似。EPoR似科与其它家族成员有更高的同源性,在进化上可能处于主导的地位。ERS的胞浆区长度不一,从54个氨基酸残基到568个氨基酸残基,除IL-2Rβ链与EPOR之间胞浆区有一定同源性外,其它成员在胞浆区未见明显的同源性。ERS成员胞浆区本身均不具备PTK结构,其信号传递的途径和机理也有所不同。IL-2Rβ链胞浆区的本双重性区与胞浆中酪氨酸激酶相关联,富含丝氨酸区与非激酶信赖途径有关。IL-2Rγ链胞浆区具有SH2结构,参与信号传递。细胞浆中的PTK和PKC可能参与IL-4R介导的信号传递。gp130胞浆区丝氨酸富含区以及酷氨酸磷酸化与gp130介导的信号转导有关。此外,酪氨酸磷酸化与IL-7R、GM-CSFRβ链、IL-3Rβ链、IL-5Rβ链介导的信号转导有关。2.干扰素受体家族属于这一家族的成员有IFN-α/βR、IFN-γR和组织因子(TF)(为凝固白酶因子Ⅶ的细胞膜受体),其结构与红细胞生成素受体家族相似,但N端只含有两个保守性的Cys,两个Cys之间有7个氨基酸。近膜处也有两个保守的Cys,两个Cys之间间隔有20-22个氨基酸。IFN-α/βR由两个上述的结构域所组成。(三)神经生长因子受体超家族1.NGFR超家族的成员属于该家族成员,除神经生长因子受体(nervegrowthfactorreceptorNGFR)外,还有TNF-RⅠ(CD120a)、TNF-RⅡ(CD120b)、CD40、CD27、T细胞cDNA-41BB编码产物、大鼠T细胞抗原OX40和人髓样细胞表面活化抗原Fas(CD95)。2.NGFR超家族的结构特点NGFR超家族成员其胞膜外由3-6个约40个氨基酸组成的富含Cys区域,如NGFR、TNF-RⅠ、TNF-RⅡ有4个结构域,CD95有3个结构域,CD30有6个结构域。所有成员N端第一个区域中均含6个保守的Cys以及Tyr、Gly、Thr残基各一个,其它区域亦含4-6个Cys。TNF-RⅠ、CD95、CD40分子之间胞浆区约有40-50%同源性。(四)趋化因子受体1988年IL-8基因克隆成功以来,已形成了称之为趋化因子(chemokine)的一个家族。到目前为止,趋化因子家族的成员至少有19个。部分趋化因子的受体已基本搞清,它们都性属于G蛋白偶联受体(GTP-bindingproteincoupledreceptor),由于此类受体有7个穿膜区,又称7个穿膜区受体超家族(sevenpredicatedtransmembranedomainreceptorsuperfamily,STRsuperfamily)。G蛋白偶联受体(或STR)包括的范围很广,除了趋化因子受体外,如某些氨基酸、乙酰胆碱、单胺受体,经典的趋化剂(C5a、fMLP、PAF)受体等都属于G蛋白偶联受体/STR。1.趋化因子受体的种类和结构(1)趋化因子受体的种类:已发现的趋化因子受体种类有IL-8RA、IL-8RB、MIP-1α/RANTEsR、NCP-1R和细胞趋化因子受体(red blood cell chemokine receptor,RBCCKR)。有人将能与IL-8结合的IL-8RA、IL-8RB和RBCCKR(Duffy抗原)归为IL-8受体家族。(2)趋化因子受体的结构:所有趋化因子受体都属于G蛋白偶联受体/STR,N端在胞膜外,C端位于胞浆内。7个穿膜区(transmembranedomain,TMD)为α螺旋,在TMDⅡ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ由α螺旋内保守的肺腑氨酸所扭结(kinked),胞膜外和胞浆内各有由亲水氨基酸所组成的三个一不,分别简称为e1-e3(e:extracellularconnectingloops)和il-i3(iintracellularconnectingloops)。e1和e2之间由两个保守的Cys形成一个二硫键,有些受体在胞外N端和e3之间也形成二硫键,如IL-8Ra30Cys与277ys形成二硫键。在STR超家族中,趋化因子受体以及经典的趋化剂受体具有以下特点:(1)其长度在STR超家族中最短,约为350氨基酸,其主要原因是N端、C端较短,i3环只含16-22个氨基酸;(2)在氨基酸水平上同源性大于20%;(3)i3富含碱性氨基酸,带正电;(4)N端仿酸,带负是电;(5)胞浆区含有多个丝氨酸和苏氨酸,可能是磷酸化位点;(6)mRNAs多表达于白细胞。2. IL-8受体家族IL-8R家族是趋化因子受体中能与IL-8结合的不同受体的总称,包括IL-8RA、IL-8RB和RBCCKR。(1)IL-8RA:IL-8RAcDNA1991年基因克隆成功,是Holmes等从中性粒细胞cDNA表达文库中分离得到,人IL-8RA基因定位于染色体2q35,与IL-8RB基因密切连锁和高度同源,可能是从同一祖先基因经复制而来。从cDNA推算出IL-8RA由350氨基酸组成,有5个N连接的糖基化位点。裸肽分子量为40kDa,糖基化后55～69kDa,在氨基酸水平上与IL-8RB的同源性为77%。IL-8RA只与配体IL-8(碱性,PI8.0-8.5)结合,这与IL-8RA的结构有关,IL-8RaN端酸性氨基酸是与IL-8结合的位置,N端Asp11和e3中Gly275和Arg280对于与配体结合至关重要,由于Cys30与Cys277之间形成二硫键,Asp11,Glu275和Arg280在空间置上十分接近,共同参与同配体的结合。IL-8RA基因表达的细胞种类较为广泛,如中性粒细胞、单核细胞、PGA活化的T细胞、单核细胞样细胞系、黑素瘤细胞、滑液成纤维细胞、HL60细胞和前髓样细胞系THP-1等。(2)IL-8RB:IL-8RBcDNA是首先从HL60细胞中克隆成功,推断的氨基酸残基数为335,有一个潜在的N连接糖基化位点。IL-8RB可与CXC亚族中IL-8、GROα、GROβ、GROγ和NAP-2结合。人IL-8RB主要表达于髓样细胞,如中性粒细胞、HL60、THP-1和AML193细胞。(3)RBCCKR:这种受体结合配体的特异性较宽,又称multi-specificreceptor,可结合CXC亚族中的IL-8、NAP-2、GROα和CC亚族中的MCP-1和RANTES。人RBCCKRcDNA1993年克隆成功,基因定位于1q21-q25,成熟受体分子由338个氨基酸组成,分子量为39kDa,与IL-8RB和MIP-1α/RANTESR分别有27%和23%同源性。胞膜外区为66个氨基酸,含有2个潜在的N连接糖基化点,酸性。C端胞浆区长24个氨基酸残基,RBC-CKR似乎不G蛋白调节,可能是一种G蛋白的非偶联受体。RBCCKR是人红细胞Duffy抗原(gpD),也是微小间日疟原虫(Plasmodiumvivax)受体。Duffy血型阴性个体尽管存在着该血型的原因,但不表达Duffy抗原/RBCCKR。RBCCKR作为一种清除受体(clearancereceptor)清除血液中趋化因子。这种受体与配体结合的亲和力Kd为5nM,正常血清中IL-8水平在pM水平。在成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脓毒症时,血清IL-8水平可升高至8nM,过高水平的IL-8结合到RBCCKR而得以清除。IL-8等趋化因子结合到红细胞上后即失去了对靶细胞作用。红细胞的这种清除作用的意义还在于维持一个合适的趋化因子浓度,保证中性粒细胞等敏感地从血液中向趋化因子浓度高的炎症部位动。RBCCKR除表达在红细胞上外,还表达在肾脏、大脑,基因表在这还见于脾、肺和胸腺等。3.受体的信号转导IL-8RA和IL-8RB中紧接第三个穿膜区(TMDⅢ)的第二个胞内环(i2)有一段高度保守的DRYLAIVHA序列,与受体信号的转导密切相关,其中DRY对于受体有效地偶联G蛋白是必要的,如用突变方法改变此序列,虽然不影响受体与配体的结合,但几乎完全丧失了配体刺激的生物学活性。IL-8R与配体结合后使与受体结合的异源三体G蛋白分解为α亚单位和βγ亚单位,α亚单位活化磷脂酶C(phospholipaseCPLC),导致胞浆内三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)增加,分别诱导胞浆内Ca库释放Ca2 和PKC的活化。此外,IL-8RA和IL-8RBC端丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化可能与信号的转导有关。4.趋化因子受体与病毒发现某些感染人或灵长类病毒的开放读框产物与某些趋化因子受体有较高的同源性,这可能与病毒的致病以及病毒所具有的某些生物学特性有关。(1)人巨细胞病毒(humancytomegalovirusHCMV):是一种可感染人上皮细胞、髓样和淋巴样细胞的β疱疹病毒(βHerpesvirus)。HCMV3个开放读框US27、US28和UL33所推断的氨基酸序列在分子结构上均可模拟STR,其中US28产物与人MIP-1α/RANTEsR约有30%同源性,与该受体N端的同源性高达56%。US28产物可与趋化因子β亚族中MIP-1α、MIP-1β、MCP-1和RANTES相结合,但不能结合α亚族中的趋化因子。(2)Saimiri疱疹病毒(HerpesvirussaimiriHVS):是一种感染灵长类动物嗜T细胞的γ疱疹病毒(γHerpesvirus)。HVS开放读框ECRF3产物与IL-8R有近30%的同源性,与IL-8RbN端的同源性为44%。ECRF3产物与IL-8、GROα和NAP-2均可发生一定程度的结合。HCMV-US28和HVS-ECRF3探针不能与人基因组DNA杂交,提示疱疹病毒不仅从宿主体内获得了趋化因子受体基因拷贝,而且进行了修饰。类似的现象见于嗜人B淋巴细胞的γ疱疹病毒-EB病毒(EBV),EBV开放读框BCRF1是从宿主体内获得的IL-10基因,BCRF1产物又称为病毒IL-10(vIL-10),可模拟哺乳动物IL-10的抗炎症和抗增殖效应。二、细胞因子受体中的共享链大多数细胞因子受体是由两个或两个以上的亚单位组成的异源二聚体或多聚体,通常包括一个特异性配体结合α链和一个参与信号的β链。α链构成低亲和力受体,β链一般单独不能与细胞因子结合,但参与高亲和力受体的形成和信号转导。应用配体竞争结合试验、功能相似性分析以及分子克隆技术发现在细胞因子受体中存在着不同细胞因子受体共享同一种链的现象。(一)细胞因子受体共享链的种类在众多的细胞因子中,某些细胞因子的作用十分相似,如IL-3、IL-5、GM-CSF都作用于造血系统,促进造血干细胞或定向干细胞的增殖。IL-6、IL-11、LIF、OSM都能作用于肝细胞、巨核细胞、浆细胞瘤,发挥相似的生物学作用。IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-13均具有刺激T细胞或和B细胞增殖的作用。上述细胞因子功能的相似性已部分在受体水平得到解释,在很大程度上是由细胞因子受体共享链所决定的。已知,细胞因子共享链主要有gp310、GM-CSFRβ链和IL-2Rγ链。1、gp130/LIFR为IL-6R、单抗MT18在骨髓瘤细胞系U266共沉淀中得到一种130kDa的糖蛋白,命名为gp130。1990年Hibi克隆成功,gp130,属于造血因子受体家族。IL-6、IL-11均能刺激IL-6信赖的小鼠浆细胞瘤系T1165的增殖,能在IL-3、GM-CSF的作用下缩短骨髓多能干细胞的Go期,增强IL-3依赖的人和小鼠的巨核细胞集落的形成,促进体内、体外的特异性抗体反应,诱导肝细胞急性期蛋白的产生。抗gp130能阻断IL-6、IL-11两种细胞因子分别诱导的TF1细胞的增殖,而抗IL-5R只能阻断IL-6诱导的TF1的增殖,表明IL-6、IL-11受体共用一个信号转导链。OSM受体存在着低亲和力及高亲和力两种受体,低亲和力受体即gp130,gp130与LIFR构成高亲和力受体。与在IL-6R、IL-11R中不同,gp130在OSMR中只形成低亲和力受体且不能单独转导细胞因子信号。高亲和力的LIF受体由LIFR和gp130组成,OSM与LIF能竞争结合高亲和力LIF受体,但不竞争结合低亲和力的LIF受体。(4)IL-11Rα链(小鼠)与IL-6Rα链和CNTFRα链氨基酸同源性分别为24%和22%。2、KH97/AIC2B为IL-3R、IL-5R、GM-CSFR所共用。在造血方面,IL-3与GM-CSF均能促进未成熟细胞、混合细胞及粒细胞-巨噬细胞集落的形成,激活单核细胞,促进嗜酸性粒细胞集落形成。IL-5除了促进B细胞分化和分泌抗体外,也具有刺激嗜酸性粒细胞分化作用。用GM-CSFRβ链分别与IL-3、IL-5、GM-CSFRα链共转染的试验证明,这三种细胞因子高亲和力受体中的β链在小鼠和人分别为AIC2B和KH97,它们有56%的同源性。3、IL-2受体γ链除IL-2R含有γ链外,IL-4R、IL-7R、IL-9R和IL-13R复合物中也共用IL-2Rγ链(γc)。这些受体的相应配体是一组主要作用于T细胞的生长因子。以IL-2γ链异常为主要特征的X联锁严重免疫缺陷综合症患者显示出T细胞发育异常,T细胞的缺乏或数量明显减少,提示IL-2γ链在T细胞的发育中起至关重要的作用。IL-4、IL-7均在T细胞的发育中起作用,它们共用一条信号转导链IL-2Rγ链来传递T细胞增殖的信号。在IL-2受体系统中,α链构成低亲和力受体,中亲和力受体由β、γ链组成,高亲和力受体由α、β、γ三条链组成,其中,γ链相当于其它细胞因子受体的β链,参参与信号传递,而αβ链则相当于α链,主要发挥识别和结合配体的作用。(二)共享链与细胞因子受体信号转导细胞因子信号转导首先需要配体与受体结合并诱导受体二聚体(或三聚体)的形成,使二聚体(或三聚体)胞浆部分的相互作用,由此引起不同途径的信号转导。在IL-2R系统中,受β、γ链的二聚作用对于信号的转导是必须的,缺乏β链胞浆区的IL-2R不能转导IL-2刺激所发生的信号。大多数的细胞因子对细胞的刺激及信号转导与酪氨酸激酶的活化及细胞内蛋白的酪氨酸磷酸化有关,细胞因子与受体结合可以引起受体成分的酪氨酸磷酸化。ERS胞浆区近膜端的60个氨基酸残基是高度保守的,这段同源序列对IL-6、G-CSF、EPO、IL-7的信号转导起着关键作用,提示这些受体可能利用相似的胞膜内信号转导机制。1、gp130介导信号转导在IL-6R、IL-11R、OSMR、LIFR、CNTFR的信号转导共用链gp130中,其胞浆区约277个氨基酸残基中包含丝氨酸富含区、核苷酸结合区及4个GTP结合模式区。其中的丝氨酸富含区也存在于G-CSFR、IL-2Rβ、IL-4R和EPOR,其它的ERS成员有着明显的同源性。其中一个片段在所有ERS成员中都是保守的,另一个片段存在于G-CSFR、EPOR、KH97中。这两个短的片段中,无论哪个发生突变都将使gp130不能发生酪氨酸磷酸化,丧失信号转导的能。LIFR/gp130异源双体也与酪氨酸磷gp130不能发生要酪氨酸磷酸化,丧失信号转导的功能。LIFR/gp130异源双体也与酪氨酸磷酸化有关。虽然大多数造血因子受体家族成员均不具有酪氨酸激酶结构域,但它们与酪氨酸激酶型生长因子受体相似,生长因子引起与之相关的受体酪氨酸激酶二聚体的形成和激活,而造血因子可能是诱导其受体的二聚体形成并导致相关酪氨酸激酶的活化。发现在IL-6、IL-11刺激的TF1细胞中检测出分子量97/95kDa的蛋白发生了酪氨酸磷酸化,抗gp130的信号转导中很重要。在不同的细胞系3T3-L1、B细胞杂交瘤、髓样白血病系中发现有不同分子量蛋白的要酪氨酸磷酸化,提示在不同的细胞系中存在细胞特异的酪氨酸激酶及各自特异的底物,这可能是共用gp130的IL-6、IL-11、LIF、CNTF、OSM在不同细胞中生物学作用差异的原因一。JAK2是一种非受体型的酪氨酸激酶,可以被EPO、IL-3、G-CSF、IL-6等多种细胞因子刺激所激活,JAK2可能是这些不同的细胞因子受体信号转导途径中的一个共同因素,这种与受体相联的JAK2激酶可能因受体结构的不同而催化不同的底物,从而导致了JAK2介导了许多不同的生物学功能。此外,gp130在IL-6、IL-11、CNTF、LIF的刺激后也发生了自身的酪氨酸磷酸化。2、KH97/AIC2B介导信号传导在IL-3、IL-5、GM-CSF的信号转导链KH97/AIC2B的胞浆区内也存在着两个产生不同信号所必需的区域:一个是Glu517上游近膜端的约60个氨基酸的区域,它是诱导c-myc和pim-1所必需的;另一个区域是Leu623至Ser763约140个氨基酸的胞浆区域,是Ras、Raf、MAP(丝裂原激活的蛋白激酶)的激活以c-fos、c-jun的诱导所必需的。hGM-CSFRα、β链无任何已知酶的催化区,共转染hGM-CSFα、β链的Ba/F3细胞的地冽同C-Myc、pim-1水平的延长增加相关联的。在小鼠淋巴细胞系转染GM-CSFα、β链后可以引韦胞内数种蛋白的酪氨酸磷酸化并引起增殖反应,α、β链共转染小鼠NIH3T3细胞表达GM-CSFR高亲和力受体,可引起表达的β链胞浆区和另外一个有包浆内40-45kDa蛋白的酪氨酸快速磷酸化。三、可溶性细胞因子受体在自然状态下,细胞因子受体(cytokine receptor,CK-R)主要以膜结合细胞因子受体(membrane-bound cytokine receptor,mCK-R)和存在于血清等体液中可溶性细胞因子受体(soluble cytokine receptor,sCK-R)两种形式存在。细胞因子复杂的生物学活性主要是通过基与相应的mCK-R结合后所介导的,而sCK-R却具有独特的生物学意义。sCK-R水平变化与某些疾病的关系日益受到学者们的重视。部分重组sCK-R(rsCK-R)基因工程产品已进入临床验证,关于sCK-R的产生机理,结构特点及基免疫学功能等方面的基础研究也取得了长足的进展。(一)sCK-R的产生机理及作用特点人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)感染的HUT102B2、MT-2等细胞,髓样白血病细胞(HL-60,KG1)及某些人B细胞系(Raji)除了表达多种mCK-R外还可以通过不同方式产生sCK-R,如HUT102B2细胞培养丰清中也可检出高水平sCK-2R和sIL-6R。人PMC体外经PHA刺激培养后也产生大量sCK-2R和sCK-6R。1.sCK-R的产生大多sCK-R主要来自膜受体的脱落,因此将膜受体阳笥细胞溶解是获得大量sCK-R的一种方法。大多数sCK-R氨基酸序列与mCK-R胞膜外区同源,只缺少跨膜区及胞浆区,但仍可与相应配体发生特异性结合所应。除了膜受体的裂解、脱落产生sCK-R形式外,另一种产生sCK-R的机理是通过受体mRNA不同剪接,产生分泌型mRNA,通过翻译后直接分泌到细胞外,已经证实,细胞内可含有同一种CK-R不同形式的cDNA。sIL-4R、sIL-5Rα链、sIL-6Rα链、sIL-7R以及sG-CSFR等可以这种形式产生。2.sCK-R的生物学作用多数sCK-R与相应细胞因子结合的亲和力较与mCK-R为低,可能与sCK-R为单链结构或缺少某些结构区域有关。也有的sCK-R如sIL-4R同天然mIL-4R与相应配体结合的亲和力是相同的,即使低剂量sIL-4R也可特异地抑制IL-4诱导的细胞增殖反应。sCK-R以其多种方式发挥其独特的免疫学功能。(1)做为细胞因子转运蛋白,将细胞因子运至机体有关产啊位,造成局部细胞因子高浓度区以充分发挥细胞因子的生物学效应。(2)是膜受体正常代谢途径,有利于处于活化状态细胞恢复至正常水平。(3)竞争性地结合mCK-R相应配体,抑制mCK-R所介导的生物学作用。(二)sCK-R与临床1.检测sCK-R水平在临床中的应用检测某些sCK-R水平辅助临床对某些疾病的早期诊断,了解病程的发展与转归,并可对患者免疫功能状态及预后进行评估,对临床治疗也有一定指导意义。(1)sIL-2R的检测:来国内外学者对sIL-2R进行了大量研究,发现其在血清及其他体不认中水平的变化与临床多种疾病如器官移植排异反应、病毒性感染、恶性肿瘤、创伤及自身免疫性疾病等的病情、病程密切相关。(2)其他sCK-R的检测:在尿中发现一种50kDasIL-6R分子称为IL-6R-SUP,可以促进小剂量IL-6诱导的小鼠浆细胞瘤T1165的生长。多发性骨髓瘤病人血浆中sIL-6R水平明显升高。风湿性疾病患者血清sTNFR水平异常增设,关工了腔滑液中亦可检出高水平sTNF-R,且活动期水平明显高于非活动期。正常妇女尿中仅可检测到TNF-RⅡ类型的sTNFR,而妊娠妇女尿中TNF-rI和TNF-RⅡ两种类型sTNFR均可被检出,随胎龄增加sTNFR水平逐渐升高,分娩后随之降低,这可能是使胎儿免受TNF作用的一种防护机制。肝脏感染性腹水及癌性腹水中亦可检出高水平sTNFR。此外还发现,sTNFR水平的增设与患者肾功能的减退密切相关。2.sCK-R在临床应用前景大多数sCK-R与细胞因子结合后阴断细胞因子与膜受体结合,从而抑制细胞因子的生物学活性,应用sCK-R减轻或防止炎症性细胞因子造成的病理损害提供了新的治疗途径。动物实验结果表明,局部注射sIL-1R可抑制IL-1介导的炎症反应。sIL-1R可降低小鼠同种异体心脏移植的排异反应以及大鼠实验性关节炎和过敏性大脑炎。在体外sIL-1R可明显抑制急性髓样白血病病人骨髓细胞的增殖。应用IL-1R基因工程产品开始对治疗关节炎、糖尿病以及防治器官移植排斥等进入临床验证。动物体内注射sIL-4R可延长同种异人本移植物的存活,抑制GVHR,降低I型超敏反应。应用sTNFR可减轻TNF在自身免疫性疾病中所介导的病理损害,并可减轻败血症休克。

扫描电镜通过用聚焦电子束扫描样品的表面而产生样品表面的图像。它由电子光学系统、信号收集及显示系统、真空系统和电源系统组成，应用于生物、医学、材料和化学等领域。扫描电镜作为一种精密仪器，为延长其使用寿命，在使用时应需要以下事项：1、将试样置于载物台垫片，调整粗/微调旋钮进行调焦，直到观察到的图像清晰为止；2、调整载物台位置，找到要观察的视野，进行分析；3、扫描电镜调焦时注意不要使物镜碰到试样，以免划伤物镜；4、当载物台垫片圆孔中心的位置远离物镜中心位置时不要切换物镜，以免划伤物镜；5、在做切换动作时，动作要轻，要到位，关机时要将亮度调到小；6、亮度调整切忌忽大忽小，也不要过亮，影响灯泡的使用寿命，同时也有损视力；7、非专业人员不要调整显微镜照明系统（灯丝位置灯），以免影响成像质量；8、更换卤素灯时要注意高温，以免灼伤；注意不要用手直接接触卤素灯的玻璃体；9、设备不使用时及时关掉电源。

 封闭血清用于免疫组化（IHC）或者免疫荧光（IF）实验中样本的封闭，降低背景，减少假阳性。远慕提供多种属封闭血清，液体形式产品（原液），无需溶解，用PBS直接稀释即可使用，低防腐剂含量，对细胞和蛋白的毒性/影响更小。什么是封闭血清封闭血清就是将养殖的非免疫的正常动物采血，然后不加抗凝剂，血液凝固，血块收缩，析出的淡黄色液体。经过特殊工艺处理后的血清，特别适在各类免疫学实验中用于封闭处理， 比如：IHC、IF/ICC、ELISA等。血清与血浆的区别血浆是指血液中除去细胞成分后剩下的淡黄色或无色半透明液体，一般需要经过抗凝处理 。血清与血浆的区别在于血清中不含某些在凝血过程中被消耗的凝血因子如纤维蛋白原，增添了在血液 凝固过程中由血管内皮细胞和血小板所释放的化学物质。正常驴血清正常山羊血清正常兔血清正常大鼠血清正常小鼠血清特点：用于免疫组化（IHC）或者免疫荧光（IF）实验中样本的封闭，降低背景，减少假阳性。液体形式产品（原液），无需溶解，用PBS直接稀释即可使用，低防腐剂含量，对细胞和蛋白的毒性/影响更小。为什么需要封闭封闭步骤可减少一抗和二抗与非靶标位点进行非特异性结合时所产生的本底信号。理想情况是，封闭剂将占据样本中的“黏性”位点，比如暴露的带电性或疏水性蛋白表面，同时不会干扰一抗/二抗识别靶表位，从而尽可能提高信噪比(S/N)。封闭血清效果封闭血清适用于免疫组化或者免疫荧光实验中样本的封闭。可以封闭待检样本中与蛋白质非特异性结合的位点，另外还可以封闭样品中内源性的Fc片段结合位点，阻断抗体与样品中的Fc受体结合，从而降低背景，减少假阳性。对于适用多抗的实验，二抗种属来源的正常血清是封闭处理的金标准。封闭血清使用方法推荐用PBS将封闭血清原液稀释5-20倍，配成5%-20%的工作液，直接滴加在组织切片或者细胞涂片上，37℃度孵育10-30分钟，清除血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗工作液，37℃孵育1-2h或4℃过夜。远慕实用Tips：最佳的稀释比例需研究者通过实验来确定。建议的起始稀释比例如下：IHC-p（1：10-20）；IF / ICC（1：10-20）；ELISA（1：100）。封闭用血清中不能含有目标蛋白，且与一抗来源不同，可用与二抗相同来源的封闭血清。封闭结束后，用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加一抗。每张切片需要量，可以参考50ul PBS + 5ul 血清 来计算。如何如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损：将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。长时间储存在2～8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。因此，推荐在-20℃以下储存血清，并避免反复冻融。如果开盖后未使用完，我们建议存放于4℃，但请勿超过一个月。