干细胞与免疫细胞作为细胞界的“网红”两兄弟，这两年在圈内可谓是艳惊四座，轰动全球。干细胞—构筑人体的钢筋铁骨如果把人体比作城堡，那么干细胞对生命成长发育的重要性就如同建筑中用到的钢筋水泥等基本原材料。它是构筑人类形态的原始细胞，通过分化源源不断地提供新生细胞，根据需要发育成人体内各种类型的组织和器官。当框架搭建好之后，后期的添砖加瓦等维修工作也是靠干细胞来支持的。因为数量非常丰富，可塑性极强，又被医学界称为“万-能细胞”。免疫细胞—守护人体健康的作战部队当城堡竣工后，就需要部署强大的安保体系——免疫系统。而免疫细胞正是免疫系统的核心，众多类别的免疫细胞在人体内分区驻扎，各司其职，共同组成了一支强悍的“超能陆战队”。能力不同，出身也有不同目前，干细胞可以从多种人体组织中提取，以目前临床应用最广泛的间充质干细胞为例，它最初是从骨髓中提取的，后来在新生儿脐带、脂肪、牙髓等多种人体组织也都能提取到。而免疫细胞的主要来源则是血液，如成人的外周血。血液中含有大量功能成熟的免疫细胞，在我们身体内不停循环，保护我们的健康。干细胞与免疫细胞作用干细胞当我们的身体细胞有创伤，需要被替换或修复时，就需要干细胞发挥修复作用。例如，当身体发生严重外伤时，或者发生糖尿病、冠心病、老年痴呆、肝硬化等慢性病时，本质上是那些器官的细胞受到了损伤，这时就可以应用干细胞对受损组织、器官进行修复。免疫细胞可以清除叛徒（正常细胞突变成为癌细胞）和外来入侵者如细胞和病毒。

石蜡切片与冰冻切片在组织学中，蕞常用到的有石蜡切片与冰冻切片。两者各有优缺点，在实验的应用上也有所不同，比如石蜡切片常用于进行免疫组化实验，冰冻切片常用于免疫荧光实验。而两个实验都是应用免疫学基本原理——即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内蛋白质，对其进行定位、定性及相对定量的研究。下面远慕生物为小伙伴们详细介绍下两种方法的异同点。一．石蜡切片石蜡切片组织学常规制片技术中蕞为广泛应用的方法。常用于观察正常细胞组织的形态结构。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，是一种永jiu性显微玻片标本。1、固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。原理：固定时间则根据材料块的大小及松密程度而定。固定可以凝固组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。同时能使组织硬化，有利于切片的进行。2、脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。原理：固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。原因在于透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不能脱尽，苯类无法浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混。3、透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。此步蕞好在通风厨进行。原理：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。材料块在透明剂浸渍过程称透明。4、浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。原理：使石蜡浸入组织而起支持作用。5、包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。6、切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。通常切片厚度为5微米，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。7、贴片与烤片：将水浴中展片捞至玻片上铺正，然后将载玻片放入37℃温箱中干燥。8、切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。原理：切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。9、染色：染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。实验操作简单。免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。二.冰冻切片冰冻切片， 优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。 缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而 多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片相比较于石蜡切片简单易行，一般进行固定脱水后，固定于包埋剂就可以在冰冻切片机进行切片。有些新鲜标本可以直接取材后，冷冻托涂包埋剂后置于冷冻托上速冻，冻好后立即切片。冰冻切片蕞重要的是防止样品中冰晶的出现，一般可以通过速冻的方法使组织温度骤降，减少样品内冰晶的形成。也可以将组织置于20％～30％蔗糖溶液l～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

细胞培养过程中，由于实验环境、操作者鼻腔口腔、实验器材等很多地方都有支原体的存在。因此，细胞发生支原体污染的频率很高。据美国数据统计，细胞发生支原体污染的几率在70%以上。同时，由于支原体直径很小，仅在180nm~350nm之间，只有通过电镜才能看到。因此，支原体污染不易被实验者肉眼发觉。而支原体污染是个循序的过程，普通抗生素对其无效。因此，被支原体污染的细胞会持续受到影响，导致实验数据不准确。支原体污染不仅是细胞培养中需要克服的现象，而且是制药、生物制品生产中需要加以避免的。支原体污染的影响是什么？●抑制细胞增殖达50%●影响免疫反应●影响病毒增殖和感染率●引起染色体畸变和易位●干扰杂交瘤技术使被污染细胞在HAT培养基更敏感●在细胞壁上附着支原体会改变细胞壁完整性。●降低电穿孔转染率达5%总之，支原体污染影响细胞所有的代谢功能。细胞被支原体污染，解决方案方法一：确认细胞已被支原体污染，终止试验，丢弃所有被污染的细胞和耗材。重新复苏细胞，注意选用未被污染的细胞株、血清和培养基，并规范操作。方法二：对于珍贵的，样品不可再得的细胞，或价格昂贵的种子细胞，不但无法丢弃，而且作为种子细胞，还需要彻底根除支原体污染。此时，需选用特异性的支原体杀除剂，清除污染，保护细胞。方法三：对于已耗费很多时间，大量扩增起来的细胞，或经过基因转染、体外刺激等大量工作处理过的细胞，如果发现细胞被支原体污染了，怎么办？此时由于前期工作量巨大，使操作人员无法丢弃已有细胞。但由于价格原因，又无法使用方法二提到的昂贵试剂杀除细胞上的支原体，同时，实验人员还需要清除细胞上的支原体污染，让实验得以往下推进，以最终获得准确的实验数据。此时，实验者可选用对支原体特效的抑制剂，通过对细胞的前期处理，中期加药，逐步通过4代左右的培养，得以将支原体污染彻底清除，确保试验顺利推进，结果准确。工作环境中支原体污染，解决方案如果实验室的细胞经常发生支原体污染，则需考虑的污染源可能来以下几个方面：1、细胞种子被污染，解决方法参见以上“方法二”和“方法三”；2、细胞培养中，使用未经严格过滤祛除支原体的牛血清。某些血清生产厂，为低价占领市场同时还能获得充足利润，他们需要降低生产成本，所以会将生产中，成本最高的100nm过滤三次的步骤缩减，导致血清成为支原体的污染源。(全球标准的血清生产规范为：粗血清需经七次过滤，最后三次为100nm加压过滤，可以清除支原体)；此情况需详细考察血清供货商的专业程度，通过索要《检测报告》等书面文件为血清获得更多质量保证。同时，对专业水平不高的血清供货商，适当延长血清试用期。3、洁净台、细胞培养箱内部、培养箱水槽、液氮罐，培养间内部的水浴锅等环境被支原体污染，可对工作区域进行消毒。总之，细胞培养中，支原体污染发生频繁。有时带来的危害会造成实验的巨大损失。应经常检测和及时排除支原体污染，让细胞在健康安全的环境下生长，为获得准确的实验结果，打下良好的基础。

支原体是一大群微生物，有150多个物种，它们共同特点是大小介于细菌和病毒之间，无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形。因而它们也被归为柔膜体。支原体直径仅有0.1～0.3μm，并且变形能力大，故能通过滤菌器。支原体与其他细菌不同之处还在于其胞膜中含有胆固醇或其他甾醇，这种特性使支原体膜更具柔顺性， 对于物理因素， 如压力、渗透压、脱水的抵抗力很大。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。自Robinson1956年shou次报道细胞培养中存在支原体污染以来，国内外关于支原体污染细胞和疫苗等生物制品的报道屡见不鲜。其中95％以上的污染支原体为口腔支原体(M．orale)、精氨酸支原体(M．arginini)、发酵支原体(M．fermentans)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)和猪鼻支原体(M．hyorhinitiS)五种。支原体倍增时间是1至9小时。在体外培养基中生长缓慢。大部分支原体能吸附在细胞表面，有个别支原体物种能进入到细胞内，如发酵支原体、生殖支原体和肺炎支原体，不仅是可被吞噬到单核细胞中，而且可存在于上皮细胞。并且在1992年发现存在有渗透支原体M. penetrans。支原体污染细胞培养物后，使细胞发生病变，这主要是因为支原体消耗了营养和细胞代谢的基础成分，包括核酸前体、氨基酸、维生素、脂质、胆固醇。由于支原体的低代谢能力和高数量，这些化合物会非常快地被消耗掉。由于这些成分的非氧化性降解和产酸的积累，培养基的pH会发生下降。还有些支原体（如精氨酸支原体、猪鼻支原体）能水解精氨酸，产氨导致pH值升高。支原体中由于存在精氨酸脱氨酶活性，会使细胞生长变慢甚至发生凋亡。由于细胞的精氨酸被支原体剥夺，细胞的染色体会发生畸变，因为精氨酸是组蛋白的组成成分。同时，真核细胞的DNA和RNA会被支原体产生的核酸外切酶和内切酶降解，这在支原体污染的淋巴细胞和肿瘤上皮细胞中被观察到。支原体还会干扰病毒的产生和复制。支原体还会破坏细胞膜的完整性，影响细胞信号传递，干扰膜受体的功能，改变信号传递。在单克隆抗体制备中，骨髓瘤或杂交瘤细胞因支原体的污染而导致融合失败或抗体分泌能力下降以至丧失。细胞培养物被支原体污染后生长减慢，产生细胞病变，表现为细胞体积增大，碎片增多，在细胞质中产生一些颗粒；细胞内病毒繁殖受阻，使细胞形成空斑。光镜下形成不正常密度生长的单层，贴壁细胞形成“流沙样”脱落、裂解。某些支原体可在侵入细胞８ｈ使线粒体膨胀，继而被破坏，细胞核wei缩呈空泡化，细胞微管解聚。以上可见，无论是细胞科研，生物药生产，还是细胞工业，支原体检查都是重要一环。其中，支原体PCR检测试剂盒和支原体qPCR检测试剂盒是常用方法，灵敏度高，覆盖支原体物种广泛，操作简便，节省时间，在确保细胞无污染和产品质控方面，具有无可ti代的意义。

工业包括生物药生产、CAR-T、干细胞治疗、疫苗生产等，需要对主细胞库、病毒收获液、体外扩增的细胞等进行支原体检查。该检查的方法依据中国药典。科研检支原体则需要保证细胞中没有支原体污染，没有详细的方法规定。那么，工业和科研检支原体还有哪些区别呢？1. 方法上：工业可使用培养法、指示细胞培养法和NAT法（核酸扩增技术）。NAT法最常见的就是PCR和荧光定量PCR。只限定了这三种。NAT在方法验证后，可以替代前面两种方法。它尤其适合CAR-T等的放行检测。科研则可采用各种方法，但一般不采用培养法，因为太慢。科研检支原体常见方法有PCR法、qPCR法、酶荧光法、恒温扩增法、DNA染色法、细胞感应法等。2. 用途上：工业检支原体用于过程控制、放行检测。生产前和生产后的成品都需要检。科研检支原体是避免支原体污染细胞，干扰实验，一般是一周就要监测一次。3. 支原体污染程度：工业上支原体污染风险主要是存在于细胞和成品中。但环境也需注意，需要定期清洁。科研上支原体污染风险主要是存在于细胞中，但环境也需注意，需要定期清洁。工业上，支原体在细胞和成品中如果发生污染，也是含量较低，因而需要方法的灵敏度高，通常要求检测限达到10CFU/ml。科研上，支原体如果污染细胞上清，则因为培养液中含有血清，因而繁殖较快，支原体的污染程度较高，通常每ml能达到10的3次方。因而对方法的灵敏度要求不高，而更看重方便。目前，市面上大量存在各种品牌的支原体检测产品，以NAT（PCR或qPCR）方法而论，科研和工业领域可考虑德国Minerva Biolabs产品，因其产品大多为冻干粉型，稳定性好，4度即可保存。而且操作较为方便，例如对于科研来说，PCR有预分装型，不用自己再分液，扩增后直接上胶。更重要的是试剂盒灵敏度高，覆盖支原体物种广（100多种）。对于工业来说，qEP和Classic试剂盒还经过全面的方法验证，适合放行检测。

    低免疫人群的增长、超广谱抗生素的广泛应用使真菌感染迅速增加，侵袭性念珠菌及曲霉感染使重症监护病房（ICU）的病死率明显上升，50-75%的病例不能在生前获得细菌学的阳性结果，因此加强真菌检测的规范化操作，提高检测阳性率及药敏试验的正确率十分必要。    （一） 真菌涂片的规范化    真菌涂片是真菌鉴定最重要的方法，真菌检验人员应熟悉真菌的形态特点；无菌体液标本涂片应离心浓缩以增加阳性率，并一定要检测菌丝；对痰及口腔标本要进行定量（菌落计数）或半定量（用加号表示，在分区划线的3个区都丰富生长报告为+++、依次类推2个区生长为++、1个区生长为+）；组织标本涂片要研磨后涂片但要保护菌丝体的形态；在标本量许可的前题下涂片不应少于3张。    （二） 真菌鉴定的规范化    对酵母样真菌如念珠菌或隐球菌在常规临床细菌室已有较成熟的方法学，可用显色培养基或自动化系统鉴定真菌；常规鉴定丝状真菌主要依赖于其生长过程中形态变化和特点，所以要求从事丝状真菌检测的检验人员应作专业短期培训；任何实验室都应建立规范的涂片鉴定方法，要正确区分酵母样真菌或丝状真菌、毛霉菌和曲霉（有顶囊），对不常见的真菌不要轻易作为污染菌报告，    （三） 真菌药敏的质量保证    建立稀释法药敏试验，报告MIC值的报告对临床更有参考价值；必须正确掌握终点判断标准，氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧定等药物终点允许有20%真菌生长而两性霉素B应无真菌生长作为终点；对无折点的抗真菌药物药敏试验报告可只报告MIC，不能报告敏感度。鉴定真菌到种水平是临床用药的重要的参考。    （四）　要重视组织标本的培养    首先要无菌采集组织标本，接种前要无菌作适当粉碎将组织内的菌丝体暴露。每一份组织标本必须同时做涂片和培养。    （五）开展非培养方法的真菌检查试验，如-D葡聚糖和或诊断曲霉菌的GM试验，用于区别真菌、曲霉菌或细菌感染。

    食品工业的防霉措施    1、药剂的控制    在食品工厂内必须使用不会对食品产生不利影响的药剂。酒精喷雾消毒是制造食品时防止霉菌与细菌污染常用的方法 , 而对手指的消毒则常使用季胺盐。对于制造环境的天花板、壁面与地板等 , 为防止霉菌污染 , 应采用防腐蚀、抗霉菌与防止结露的施工及材料。因使用期间受清扫作业、湿气和药品等长时间作用 , 依使用状况和环境状态 , 数年后应再度施以防霉、防蚀处理。    食品工厂由于经济的原因 , 现多以含抗菌、防霉剂的涂料对建筑物进行涂装来控制微生物的污染。对于涂膜性能的优劣应加以选择 , 在一些利用漂白水对设备杀菌的场合 , 使用的防霉涂料应无针孔; 在确保清扫性方面 , 表面应平滑易清理且具耐久性; 在地板方面 , 食品工厂、厨房等 , 水、油与药品等使用的地方 , 涂料必须具耐久性与防滑性 ,若使用台车 , 则须考虑耐压性。    2、温湿度控制    我国 GMP通则中规定 , 制造、包装及贮藏等场所应保持通风良好 , 必要时应装设有效的换气设施 , 以防止室内温度过高、蒸汽凝结或异味等发生。Klausner 和 Donnelly (1991)在调查佛蒙特州(Vermont)乳品工厂环境来源的李斯特氏菌及耶尔森氏菌时发现 , 工厂湿的区域比干的区域有较多污染发生。故良好的温湿度控制程度 , 不仅可防止工厂产生凝结水或霉菌污染产品 , 也是食品厂控制病原菌和腐败菌的重要控制机制。    3、紫外线照射    紫外线 (254nm) 杀菌 , 广泛被应用于食品工厂制造环境和水等的杀菌。紫外线对细菌、酵母与霉菌的杀灭效果不同。即使是同一微生物 , 因菌种、菌株的不同 , 其效果也有异。但一般可以说革兰氏阴性细菌的敏感性最强 , 霉菌的抗性最强 , 而革兰氏阳性菌、酵母、细菌芽孢居于其间。例如枯草芽孢杆菌 , 其营养细胞以 11000uw·sec/cm2 即死亡 , 而芽孢则需要 22000uw·sec/cm2 的剂量。因此 , 可知紫外线很难使霉菌的孢子死亡 , 必须配合酒精喷雾等方法并用。紫外线杀菌装置 , 可用来作为环境空气和包装材料等的杀菌装置 , 但紫外灯设置必须注意以下几点: （1）必须达到微生物杀菌的照射量。 （2）紫外灯的表面和器具、装置的污物应去除。 （3）材料和环境 , 应受到紫外灯充分的照射。 （4）最好每 4m设置一盏 （15w） 紫外灯。 （5）生产操作中不要直接照射。 （6）紫外灯管的寿命约4000h （约半年） , 故应注意定期更换。    4、洁净室的设施    要减少食品工厂内的浮游菌和落菌的污染 , 需要建立洁净室。对洁净室设施的要求为: （1）防止污染侵入 , 设施内部 （特别是加热后再放冷至包装的部分） , 应有防止外部浮游菌侵入的设计。 （2）防止霉菌发生 , 建筑物内部 , 应无霉菌发生源。（3）防止霉菌扩散，若有霉菌时 , 此设施内的霉菌 ,不会向其它部分扩散。 （4）去除污染 , 当污染发生时 , 能够迅速排除。    由于霉菌会在厂房内外的空气中浮游 , 所以实际上很难完全防止其在食品上附着。因此在空气中有高的检出率的霉菌 , 也常常会在食品中被检出。所以在防止空气中霉菌污染方面 , 洁净室空气导入设施 , 不失为一可行之道。在食品工厂内的加热后放冷至包装阶段 , 为最需防止外部浮游菌侵入的阶段 , 故此阶段若能设置洁净室 , 将可达到空气洁净化 , 减少污染的目的。    5、管理者与操作人员的卫生意识    在食品工厂霉菌污染防止措施中 , 除了使用物理化学方法的控制外 , 管理者与操作人员对食品和制造环境的卫生的关心也很重要 , 即管理者与操作人员应具有卫生观念 , 随时注意操作的卫生与减少污染的可能性 , 必须从加强员工卫生教育着手。

    不同类型的培养基制备程序也不同，主要可分为：配料、溶化、矫正pH、澄清过滤、分装、灭菌及检定8个步骤。    1，配料：按培养基处方准确称取各种成分，先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入各种成分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。    2，溶化：将各种成分混匀于水中，最好以流通蒸气溶化半小时，如在电炉上溶化应随时搅拌，如有琼脂成分时更应注意防止外溢。溶化完毕，补足失去的水分。    3，矫正pH：pH测定，取与标准管同口径的试管（通常用华氏试管）3支，于第1、3管各加入欲测定pH的的培养基5ml，并于第一管中加入0.2g／L的酚红0.25ml作为测定管，混匀医学|教育网搜集整理；于第2管加入蒸馏水5ml，第4管为pH标准比色管。 pH的校正，若测定管过酸或过碱可用0.1mol／L氢氧-化钠或0.1mol／L盐酸溶液矫正，直至颜色与标准管相同为止，加碱或加酸时要精确缓慢，每加1滴后要充分混匀，比色后再加第2滴（有时仅加半滴）准确记录加入的量。 计算，设5ml培养基矫正pH至7.4时需0.1mol／L氢氧-化钠0.15ml，现有培养基4990ml，需加氢氧-化钠的量可按下列方法计算：5∶4990＝0.15∶X  X＝0.15×4990/5＝149.7（ml），如将此0.1mol／L的氢氧-化钠改用1mol／L的氢氧-化钠时，则需14.9ml即可。    4，过滤澄清：培养基配制后一般都有沉渣或混浊出现，需过滤成清晰透明后方可使用，常用的过滤方法如下：    液体培养基必须清晰，以便观察细菌的生长情况，常用滤纸过滤，亦可在加热前加入用水稀释的鸡蛋白（1000ml培养基用1个鸡蛋白）在100℃加热后保持60～70℃40～60分钟，使其不溶性物质附于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以滤纸过滤。固体培养基如系琼脂培养基，于加热融化后需趁热以绒布或两层纱布中夹脱脂棉过滤；亦可用    自然沉淀法，即将琼脂培养基盛人铝锅或广口搪瓷容器内，以高压（103.43kPa）蒸汽融化15分钟后，静置高压锅内过夜，次日将琼脂倾出，用刀将底部沉渣切去，再融化即可收清晰的琼脂培养基。    5，分装：根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管中。分装的量不宜超过容器的2／3以免灭菌时外溢。琼脂斜面分装量为试管容量的1／5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长约为试管长的2／3。半固体培养基分装量约为试管长的1／3，灭菌后直立凝固待用。高层琼脂分装量约为试管的1／3，灭菌后趁热直立，待冷后凝固待用。液体培养基分装于试管中，约是试管长度的1／3。琼脂平板：将灭菌（或加热融化）后的培养基冷至50℃左右，以无菌手续倾人灭菌平皿内，内径9cm的平皿倾注培养基约13～15ml，轻摇平皿底医学|教育网搜集整理，使培养基平铺于平皿底部，待凝固后即成，倾注时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。新制成的平板培养基（简称平板），表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒扣搁置于37℃培养箱内约30分钟待平板平面干燥后使用。    6，灭菌：不同成分、性质的培养基，可采用不同的灭菌方法。高压蒸汽灭菌法：高压灭菌的温度与时间随种类及数量的不同有所差别，一般少量分装时高压（103.43kPa）灭菌15分钟即可，分装量较大时，可高压（103.43kPa）灭菌30分钟，含糖的培养基高压（55.16kPa）灭菌15分钟。以免糖类被破坏。    7，检定：每批制成后须经检定方可使用，检定时将培养基放37℃温箱内培养24小时后，证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使用。    8，保存：制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤做为宜。每批应注明名称，分装量，制作日期等，放在4℃冰箱内备用。

维生素c对我们的身体来说是非常重要的，而且这种物质我们身体是没有办法合成的，是需要从外界摄入体内，大家都知道，如果想要摄入一些维生素c，可以选择在平时多吃一些水果和蔬菜，也有的人会选择几块钱一瓶的维生素c，经常吃，可能会给身体带来四个功效，下面就随小编一起来了解一下吧。 几块钱一瓶的维生素C，可能有这4大“功效”，你了解了吗？一、增强免疫力众所-周知，要想身体好不生病，那么就需要身体的免疫力，抵抗力比较强，如果你的免疫力比较弱的话，那么很容易会得上一些疾病给身体带来不利，平时适当的补充一些维生素c能够很好的提高人体的免疫力，随着社会的发展在生活中很多的人工作量比较大，需要加班加点，时间长了，身体就变虚弱了，如果吃一些富含维生素c的水果和蔬菜或者是吃一些维生素c的药片来补充一下维生素c，这能够增强人的免疫力，不容易生病。二、美容养颜这种女性朋友来说自己的皮肤是非常重要的，有哪个女性不希望自己的皮肤白皙有光泽，在平时适当的补充一些维生素c能够起到美容养颜的功效，进而达到延缓衰老的作用，尤其是对于脸上开始长斑的女性来说，可以适当的补充一些维生素c，也可以选择将维生素c涂在斑点处，能够淡化黑色素，起到美容养颜的功效。三、降低心血管疾病发生率经过相关研究表明，在日常生活中经常吃一些含维生素c比较丰富的水果或者蔬菜，能够降低心血管疾病的发生率，因为适当的补充维生素c可以有效的保护细胞和生物的抗氧化物质，这样可以防止细胞的损伤，还能够修复一定的结缔组织，对我们的身体是非常有利的，所以可以在平时选择吃一些维生素c来降低心血管疾病的发生率。四、促进伤口愈合在生活中难免会出现磕磕碰碰出现磕碰以后或许就会留下伤口，其实维生素c也可以有效的促进伤口的愈合，因为维生素c能够促进胶原蛋白的合成，这样就可以在一定程度上促进伤口的愈合，平时如果你要是有牙龈出血或者关节痛的问题的话，也是可以适当的补充一些维生素c，对身体是有一定的好处的。

实验室的化学品保存在阴雨天气下将面临很大的困难，当然了小编及时为大家整理了试剂的干燥方法。有机物干燥的方法大致有物理方法（不加干燥剂）和化学方法（加入干燥剂）两种。物理方法如吸收、分馏等，近年来应用分子筛来脱水，在实验室中常用化学干燥法，其特点是在有机液体中加入干燥剂，干燥剂与水起化学反应（例如Na＋H2O→NaOH+H2↑）或同水结合生成水化物，从而除去有机液体所含的水分，达到干燥的目的。用这种方法干燥时，有机液体中所含的水分不能太多（一般在百分之几以下）。否则，必须使用大量的干燥剂，同时有机液体因被干燥剂带走而造成的损失也较大。液体干燥1.常用干燥剂选择常用干燥剂的种类很多，选用时必须注意下列几点：①干燥剂与有机物应不发生任何化学变化，对有机物亦无催化作用；②干燥剂应不溶于有机液体中；③干燥剂的干燥速度快，吸水量大，价格便宜。2.常用干燥剂种类（1）无水氯化钙价廉、吸水能力大，是蕞常用的干燥剂之一，与水化合可生成一、二、四或六水化合物（在30℃以下）。它只适于烃类、卤代烃、醚类等有机物的干燥，不适于醇、胺和某些醛、酮、酯等有机物的干燥，因为能与它们形成络合物。也不宜用作酸（或酸性液体）的干燥剂。（2）无水硫酸镁它是中性盐，不与有机物和酸性物质起作用。可作为各类有机物的干燥剂，它与水生成MgSO4·7H2O（48℃以下）。价较廉，吸水量大，故可用于不能用无水氯化钙来干燥的许多化合物。（3）无水硫酸钠，它的用途和无水硫酸镁相似，价廉，但吸水能力和吸水速度都差一些。与水结合生成NaSO4·10H2O（37℃以下）。当有机物水分较多时，常先用本品处理后再用其它干燥剂处理。（4）无水碳酸钾、吸水能力一般，与水生成K2CO3·2H2O，作用慢，可用干燥醇、酯、酮、腈类等中性有机物和生物碱等一般的有机碱性物质。但不适用于干燥酸、酚、或其它酸性物质。（5）金属钠、醚、烷烃等有机物用无水氯化钙或硫酸镁等处理后，若仍含有微量的水分时，可加入金属钠（切成薄片或压成丝）除去。不宜用作醇、酯、酸、卤烃、醛、酮及某些胺等能与碱起反应或易被还原的有机物的干燥剂。3.液态有机化合物干燥的操作液态有机化合物的干燥操作一般在干燥的三角烧瓶内进行。把按照条件选定的干燥剂投入液体里，塞紧（用金属钠作干燥剂时则例外，此时塞中应插入一个无水氯化钙管，使氢气放空而水气不致进入），振荡片刻，静置，使所有的水分全被吸去。如果水分太多，或干燥剂用量太少，致使部分干燥剂溶解于水时，可将干燥剂滤出，用吸管吸出水层，再加入新的干燥剂，放置一定时间，将液体与干燥剂分离，进行蒸馏精制。固体的干燥从重结晶得到的固体常带水分或有机溶剂，应根据化合物的性质选择适当的方法进行干燥。1.自然晾干这是蕞简便，蕞经济的干燥方法。把要干燥的化合物先在滤纸上面压平，然后在一张滤纸上面薄薄地摊开，用另一张滤纸复盖起来，在空气中慢慢地凉干。2.加热干燥对于热稳定的固体可以放在烘箱内烘干，加热的温度切忌超过该固体的熔点，以免固体变色和分解，如属需要可在真空恒温干燥箱中干燥。3.红外线干燥特点是穿透性强，干燥快。4.干燥器干燥对易吸湿或在较高温度干燥时，会分解或变色的可用干燥器干燥，干燥器有普通干燥器和真空干燥器两种。

当你老是称不准时，你有好好分析是什么原因造成的吗？总的来说，实验室分析样品称量不准确的原因有很多种，大体可分为分析天平没校准、环境及样品物理因素影响和操作不当等3个方面的原因。所以，称不准就从这几方面来找原因吧。分析天平在使用前没有经过校准一台分析天平在使用之前，首先要确认它的正确性是否合格，否则该天平所称量的正确性得不到保证。分析天平从首次使用起，应对其定期校准。连续使用的天平，大约每星期校准一次。校准时应按规定程序进行，必须使用标准砝码进行校准，否则将起不到校准的作用。分析天平安装不正确在安装分析天平时首先要选择选防尘、防潮、防震、防风、防晒、恒温的房间作为天平室。其次，天平应安放在牢固可靠的工作台上，并选择适当的位置安放。天平安装前，应按装箱清单进行清点，看各部件是否齐全、完好，并对天平的所有部件进行仔细清洁。安装时，应参照天平的说明书正确装配天平。安装完毕后，应再次检查各部分安装是否正常，然后检查电源电压是否符合天平的要求，打开天平检查是否正常。环境及样品的物理因素影响在使用分析天平进行称量的过程中，环境和物理因素会对称量结果产生干扰，如温度、样品挥发、吸湿、磁力、静电等的干扰。1、温度的变化对分析天平的影响如果在称量过程中发现显示值单方向漂移，就有可能是温度变化所产生的影响。若样品与周围环境之间的温度存在差异，则这个温度差异就会导致沿称重容器流动的气流。空气沿着容器外侧流动产生一个向上的作用力，这个力就导致称重结果产生错误：样品在动态浮力作用下，称得的重量比实际要轻。这个作用直到温度平衡形成以后才会终止。当把样品从干燥炉或冰箱中取出以后，要等到样品温度与实验室或称量室温度一致时才可以称量。样品要放在表面积尽可能小的去皮容器中，取放称量容器要使用镊子夹取，而不能将手放入称量室中。2、样品吸湿或挥发对称量结果的影响如果在称量的过程中显示值单方向持续漂移，则可能测量的是挥发性或吸湿性样品。若样品吸湿性较强，则重量会增大；若被测量样品属易挥发物质，则重量会减小。对于吸湿性或挥发性样品可使用细颈容器，给容器加盖或上塞，使用清洁干燥的称重容器并保持称盘上不粘有灰尘、污染物及水滴。3、样品或容器带静电对称量结果的影响如果每次称量都显示不同的称量结果或显示值不稳定，或称量结果的重复性差，则可考虑是称量容器或者样品带有静电。静电现象的影响将使每次称量时称重容器均显示不同的重量，结果的重复性很差。具有高绝缘度的材料如玻璃、塑料制的称重容器等容易带静电。这种带电现象主要是由于样品或容器在搬运过程中搅拌或摩擦产生的，而且一旦带电则排除电荷会非常缓慢，在相对湿度低于40%的干燥空气中出现样品或容器带静电的几率会增加。通常可采用打开加湿器或适当调节空调系统来增加空气湿度，把称重容器放在金属容器内再进行称量，设法给分析天平接地等措施，来去除或屏蔽称重样品上的静电。使用者操作不当造成称量不准确称量前没有检查，盲目称量。称量前应检查天平是否正常，天平是否水平，称盘是否洁净，显示是否归零等等。解决这一问题，要严格按天平使用要求进行操作。说到称量，不得不提增量法、减量法什么时候使用增量法？增量法也叫直接称量法，主要用于待测样品给出一称量范围的非吸湿等不一变质试样或试剂的称量。本方法类似于指定质量称量法，即用药勺取试样放在已去皮重的清洁而干燥的表面皿或硫酸纸等容器上，一次称取一定量的试样，所得读数即为试样质量，转移试样时必须全部转至容器中，不得在称量容器上遗留。直接称样法还需要注意以下事项：  A当待测样是含油脂或水分较高的试样时，不得使用电光纸和硫酸纸做为容器称取样品。B灼烧产物都有吸湿性，应在带盖的坩埚中快速的称量完毕。  C待称物温度较高的，称量结果一般小于真实值，故烘干或灼烧的器皿必须在干燥器内冷至室温后再称量。要注意在干燥器中不是绝对不吸附水分，只是湿度较小而已，应掌握相同的冷却时间，如都为45分钟或1小时，而它们暴露在空气中会吸附一层水分，使重量增加。空间湿度不同，所吸附水分的量也不同，故要求称量速度要快。什么时候使用减量法？在分析过程中，许多试剂或待测样易被空气中的O2、NO2、H2S、SO2等氧化或还原，有些待称物质易与空气中的CO2、NH3等起作用，有些易受空气中水蒸气的影响或试样本身的挥发性等，引起质量变化，而试剂和样品的变质是化学分析中产生误差的重要原因之一。例如，大多数无机试剂中的“亚”化合物以及有机试剂中的盐酸羟胺、抗坏血酸等具有强还原性的化合物，易为空气中的氧所氧化，而KOH、丁二胶等强碱、砷酸纳等强碱盐易吸空气中的CO2后变质。此外，胍、水合阱等有机试剂也能吸收一部分CO2上述各类型待称物质及同一试样连称几份的情况易采用减量法称量法。称量方法如下：  在称量瓶中装入一定量的固体试样，例如，要求称2份0.4000-0.6000克试样。取约1.2000克左右试样装入瓶中，盖好瓶盖，将称量瓶放在天平盘上，称出其重量。取出称量瓶在容器（一般为烧杯或锥形瓶）上方，使称量瓶倾斜，打开瓶盖，用夹盖轻敲瓶中上缘，渐渐倾出样品，估计已够0.4000克时，在一面轻轻敲击的情况下，慢慢竖起称量瓶，使瓶口不留一点试样，轻轻盖好瓶盖（这一切都要在容器上方进行，防止试样丢失），放回天平盘上，读数记录差减值。如一次减掉不够0.4000克，应再倒一次，但次数不能太多，如倒出试样超过要求值，不可借助药勺入回，只能弃去重称。按上法称取下份试样。液体试样可以装在小滴瓶中用减量法称量。增量法、减量法优缺点增量法的优点是可以一次到位，且指定称量重量的时候只能用增量法，因为减量法无法判断一次倒出多少，但是增量法的的缺点是必须有洁净的容器，因为有水没有干燥的容器是不能放上分析天平的，水在挥发的过程中天平的最后一位都会发生变化。减量法相对来说平行测量的几组可能加入的质量差别较大,但并不影响实验精度,减量法相对较常用一些。

shou先我们应该了解我们的无菌室应该处于什么状态，有什么要求。一般情况下，我们的无菌室达到空间洁净度10000级就可以了，但操作区域例如超净工作台、生物安全柜里需要达到洁净度100级，也就是我们常说的“整体万级，局部百级”。万级洁净度对空间落菌的要求是：静态检测，自然沉降菌≤3CFU/皿，百级洁净度对空间落菌的要求是：静态检测，自然沉降菌≤1CFU/皿。也就是说平时我们做的空间验证，只要不超过这个标准，就是符合要求的，因此也不必太过担忧。那么，怎样能够保证我们的无菌室符合要求？当我们的无菌室出现异常应该如何处理？我们得先从无菌室的灭菌方式开始讲。一般无菌室的灭菌方式分为：紫外线照射、臭氧灭菌、化学熏蒸这几种。这几种灭菌方式各自有各自的特点，大家可以根据自己的实际情况来选择合适的灭菌方式，遇到异常难以解决时，也可以考虑增加一种灭菌方式来解决。紫外线照射：紫外线灭菌是利用适当波长的紫外线破坏微生物机体细胞中的DNA或RNA结构，造成生长性细胞死亡来达到灭菌效果，属于一种物理方式的灭菌，也是我们微生物检测无菌室蕞常用的灭菌方式。该方法操作简单，使用方便，也比较经济，可以杀灭各种微生物，包括细菌、病毒、真菌、立克次体以及支原体等，因此在实验室里，是蕞常见的灭菌方式。但紫外线灭菌也有一定的缺点，紫外线只能对直接照射到的微生物起到杀灭作用，因此只能对空间中照射到的地方起作用，一些照射不到的死角或者物品的内部是无法达到效果的，因此使用紫外线灭菌的无菌室，也会辅助以一些化学试剂，例如洁尔灭、酒精等消毒剂对死角进行清理。使用紫外线灭菌，应当定期检测紫外线的强度，若是无法达到要求的强度，就应该考虑更换紫外灯。根据2002年国家卫生部发布的《消毒技术规范》，紫外灯的要求是紫外线强度不得低于70μW/cm2（紫外灯1m处），而空间内的紫外灯的布局也是有要求的，要求平均每m3不少于 1.5W。也就是说，假如你无菌室是5m2，实验室高度是3米，那么你的空间体积就是15m3，你空间中使用的紫外灯的功率就不得低于22.5w。按照这个方式就可以算一下你的无菌室需要多少紫外灯了。当紫外线的强度达不到要求时，就需要更换紫外灯了。臭氧灭菌：臭氧是一种强氧化剂，灭菌过程属生物化学氧化反应。O3灭菌原理一般有以下三种：1.臭氧通过氧化分解细菌内部葡萄糖所需的酶，使细菌灭活死亡。2.直接与细菌、病毒作用，破坏它们的细胞器和DNA、RNA，使细菌的新陈代谢受到破坏，导致细菌死亡。3.透过细胞膜组织，侵入细胞内，作用于膜内的脂蛋白和内部的脂多糖，改变细胞的通透性，导致细胞溶解死亡。使用臭氧灭菌，杀菌彻底，无残留，杀菌广谱，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等，并可破坏肉毒杆菌毒素。另外，O3对霉菌也有极强的杀灭作用。O3为气体，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角。所以，臭氧灭菌也是目前被广泛使用的灭菌方式。用臭氧消毒空气，必须是在封闭空间，且室内无人条件下进行，消毒后至少过 30min 才能进入。另外臭氧的密度比空气大，在空气中会迅速下降到空间的底层，因此臭氧发生器也应当安装在无菌室的顶部。一般灭菌时间选择30min即可，要求空间中臭氧浓度不低于20mg/m3 。化学熏蒸：化学熏蒸是一种十分传统的空间灭菌方式，一般是采用易挥发气化的化学物质的蒸汽对空间微生物进行杀灭的目的，一般常用甲醛、戊2醛、过氧化氢、过氧-乙酸等。这里以常用的甲醛熏蒸为例。一般甲醛熏蒸又称甲醛高锰-酸钾熏蒸，将40%的甲醛-溶液加入到高锰-酸钾溶液中，二者发生反应，放出大量的热使甲醛蒸发到空间中，从而对无菌室进行灭菌。一般甲醛熏蒸的灭菌效果比较理想，对霉菌等较难清除的污染菌也有较好的杀灭效果，因此在无菌室被霉菌污染时，通常都是使用甲醛进行熏蒸来彻底消灭污染源。但是甲醛熏蒸的缺点也是很明显的，因为甲醛是一种强致癌性的化学品，对人体的伤害较大，在使用过程中需要特别注意，并且残留量也要进行严格的控制。每次熏蒸后，至少需要通风24h才可以使用。目前对熏蒸后甲醛的残留量并没有明确要求，还是要通过经验来判断，目前国家对居民住房要求甲醛含量不大于0.1mg/m3，所以我们也可使用甲醛含量测定仪来对熏蒸后的空间进行检测。目前甲醛熏蒸灭菌的方法食品检测无菌室的灭菌中已经较少使用，主要也是因为操作比较繁琐，灭菌时间较长，进行一次甲醛熏蒸之后，会有几天无法使用无菌室进行检测，所以只有在其他灭菌方法无法达到理想的灭菌效果时，才会考虑进行甲醛熏蒸。而其实这种灭菌方式目前在很多药企的无菌室灭菌，还是会经常用到的，另外，有些生产区域如果长期被霉菌污染，也会考虑用甲醛熏蒸的方法来解决。了解了这几种常用的无菌室灭菌方式，在我们日常的工作中也可以根据自己实验室情况进行选择，尤其是长期使用一种灭菌方式若是灭菌效果达不到理想的效果时，可以根据实际情况更换灭菌方式，或者引进一种新的灭菌方式两者结合，以期达到预想的效果。

微生物长期受到外界的影响，遗传性状必然发生某些变异。正是由于变异的存在才使得生物向前进化。然而由于突变的存在，菌种在培养或保藏过程中，可能会出现某些优良生产性状的劣化、遗传标记丢失、典型特征改变等现象，称为菌种衰退。比如苏云金芽孢杆菌由于菌种衰退，导致其新生的菌体芽孢和伴孢晶体都比较小；保藏的沙门氏菌鞭毛抗原丢失，导致H多价血清不凝固等。01、菌种衰退原因菌种衰退的根本原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10-6~10-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，蕞终成为一株衰退了的菌株。此外，菌种衰退还有以下几种原因：1、表型延迟造成菌种衰退表型延迟现象也会造成菌种衰退。如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。2、质粒脱落导致菌种衰退质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响(如高温)，致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。3、连续传代连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变(尤其是负突变)的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。4、不适宜的培养和保藏条件不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。02、防止菌种衰退措施采用已衰退菌种进行生产会影响生产效率，而把已衰退菌种作为阳性菌株进行检验，则会影响检验正确率。既然变异是不可避免的，那么我们应该如果避免菌种衰退呢？1、控制传代次数尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代减少到蕞低的水平以减少突变几率。传代次数越多，产生突变的几率就越大，菌种发生衰退的机会就越高。在实验室检验或者是生产实际中，应严格控制传代次数。中国药典当中规定，培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代，以防止菌株因传代次数过多引起衰退影响检验。2、利用不同类型细胞进行接种传代放线菌，霉菌用菌丝进行移种比分生孢子容易衰退，因菌丝是对核且有异核存在，所以移种霉菌适宜采用孢子。3、良好的培养条件不良的培养条件会衰退细胞的出现，因此采用适宜的培养基进行菌种培养，以减少衰退几率4、采用有效的菌种保藏方法根据保存时间的长短，选择适宜的保存方法。·传代培养法：复苏后的第1代放于4℃冰箱或室温保存，定期传代培养。保藏时间依微生物种类而定。如，芽孢、霉菌、酵母菌保存6个月转一次，普通细菌1个月转一次，假单胞菌2周转一次·甘油冻存法：将复活后经过性能确认的菌株新鲜培养物（一般是第二代菌株），用0.85%的灭菌生理盐水（约1-2ml）洗斜面菌苔成菌悬液；将上述菌悬液吸取适量于灭菌管（冻存管）中（如，灭菌管容量为5ml，则取1.5ml菌液），加入等体积的40%灭菌甘油，混匀，密封。保藏温度为—20℃，一般可保存1-2年。·瓷珠保存管保存：菌株保藏管内含特制的小珠（20-25颗）和特殊溶液，只需将培养好的菌株接入溶液中，摇匀成菌悬液，细胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，将保藏管置-70℃可保存5年，置-20℃可保存2-3年。瓷珠保存管保存具体操作：第1步：对需要保存的菌株进行必要的纯化，挑取生长旺盛时期的菌落，接入菌株保藏管中，通常需要接入4-7环，对于苛养菌应多接一些；第二步：拧上盖子，充分剧烈震荡；第三步：用无菌吸管将溶液吸走，尽可能吸干；第四步：马上放入冰箱中，温度越低越有利于保存（推荐使用-70℃超低温冰箱）；第五步：复苏时，只需将小珠在平板上滚动或置肉汤中培养。 

菌种说明书详细说明了菌种本身特性、生长条件以及形态特征等，提供了完整的培养方法。菌株编号“株”是我们常用菌种具体化的最小单位，即编号是唯1的；与我们通常所说的“种”不同的是，“种”是指一类菌，例如大肠杆菌，有很多株编号，它们都具有各自的特性。拉丁名称代表了菌种的种属，通常是唯1的。即我们通常所说的菌种，用拉丁名称来表示较为准确，如 Escherichia coli 的中文名称为大肠杆菌，也叫大肠埃希氏菌。中文名称通常根据菌种本身特性或拉丁名称翻译而来，因此，部分菌种中文名称通常存在多种叫法，如“大肠杆菌”与“大肠埃希氏菌”或“枯草芽孢杆菌黑色变种”、“wei缩芽孢杆菌”、“深褐芽孢杆菌”等。安全级别根据对人体安全的潜在威胁按级别分为 4 级，可简单表述为：1 级：基本对人体不致病，一般超净台即可操作；2 级：对人体条件致病，并且可以有效治疗，不传染，需在二级生物安全柜操作；3 级：具有传染性，对人体致病，危害较大，可以有效治疗；4 级：ji具传染性，对人体严重致病，目前无法提供有效治疗。培养条件准备提前准备好适宜的培养基，置于超净台或生物安全柜中备用。根据菌种的好厌氧等要求，准备对应的气体培养环境，确保能够提供菌株适宜的生长环境。使用步骤安瓿管冻干粉1. 准备1支5-10mL 液体试管培养基和2个平板， 将安瓿管表面酒精消毒，转移至安全柜中；2. 用小砂轮或锉刀在管壁划圈，沿划痕处将安瓿管掰断；3. 吸取0.5mL液体培养基注入冻干管，充分溶解后全部吸取打回液体试管中，混匀；4. 分别吸取0.2mL菌悬液打入俩平板中，涂布均匀；5. 将液体试管和平板全部正置于zhi定培养条件下培养。冻存管1. 准备1支5-10mL 液体试管培养基和2个平板；2. 将冻存管置于水浴溶解，约1-2min全部溶解；3. 酒精棉擦拭冻存管外壁消毒，随后转移至安全柜操作；4. 旋开管盖，全部吸取注入液体培养基中，混匀；5. 分别吸取0.2mL 菌悬液打入俩平板中，涂布均匀；6. 将液体试管和平板全部正置于zhi定培养条件下培养。试管斜面/平板1.外壁消毒后，可直接使用；2.若需增菌：a.细菌用接种环划取接种至液体试管培养增殖；b.霉菌用接种铲和接种锄切块正置于平板上静置培养或三角瓶液体摇床培养。试管菌液1. 外壁消毒后，可直接使用；2. 若需增菌，可吸取200μL涂板，或细菌5%（霉菌10%）接种量液体培养基增殖。

端粒（telomere）是染色体末端的一段重复的核苷酸序列，它的主要作用是保护染色体重要的功能片段在复制时不会丢失，而端粒自身的长度会随着细胞分裂代数的增加不断变短。当端粒长度降低至一定水平后，细胞分裂会随即停止，这也是为何大部分细胞正常分裂的代数都存在一个极限（即“海夫利克极限”）。然而，部分细胞可以借助端粒酶（telomerase）不断延续端粒长度，继而实现无限分裂。端粒在控制细胞乃至个体寿命、影响肿瘤发生等方面都具有重要的功能。Elizabeth Blackburn, Carol Greider和Jack Szostak三位科学家因发现端粒和端粒酶而荣获了 2009 年诺贝尔生理与医学奖。端粒的结构端粒是存在于大多数真核生物细胞染色体末端的一段核苷酸重复序列。在脊椎动物中，这段序列是（TTAGGG）n。 在人类中，这段序列大约重复了 2500 次。大部分植物的端粒序列为（TTTAGGG）n，少数为（TTAGGG）n 或其他代替序列。端粒序列的末端有一段未成对的序列，这段序列反向插入前面的一段双链中，在其他蛋白质的协同下，在染色体的末端折叠成一个环状结构（T-loop）。端粒缩短的机理由于 DNA 复制是半保留-半不连续复制，后随链的合成是一个一个片段拼接起来的，这种片段被称为冈崎片段（Okazaki fragment）。冈崎片段的前面总需要一段 RNA 引物。在复制完成后，RNA 剪切酶、DNA 聚合酶和 DNA 连接酶可以将这些 RNA 引物去掉并填补冈崎片段之间的空隙，但后随链5'端第一个冈崎片段的 RNA 引物降解之后的空隙却无法得到填补，故而每次 DNA 复制都会造成末端的一小部分 DNA 丢失，留下一段未成对的单链 DNA。如果这段 DNA 包含重要的遗传信息，那么随着复制次数的增加，重要的遗传信息就会不断丢失，导致细胞无法完成正常的生命活动。端粒的作用，相当于给染色体的末端加了一个帽子，以自身长度的不断减少，来“牺牲性”保护染色体内部重要遗传信息在复制时免于丢失。端粒与细胞分裂极限当端粒长度缩短到一定长度以下后，端粒将无法再折叠成较为稳定的环状结构。开环的末端会被当做 DNA 损伤被细胞识别，并引发一连串的反应，包括停止分裂和增殖（细胞衰老）和程序性凋亡。开环的染色体末端还会导致染色体融合，由于细胞无法修复这样的错误，这也会导致细胞凋亡。故而，对于大部分细胞而言，都存在一个分裂代数的极限，即“海夫利克极限”。然而，在少部分正常细胞，例如精细胞、一些干细胞和白细胞中，一种叫做“端粒酶”的酶可以不断延续端粒的长度，使细胞分裂的代数超过海夫利克极限，以行使特殊的生理功能。而在大部分癌细胞中，端粒酶的活性普遍很高，使得癌细胞拥有无限增殖的能力。最典型的例子，是提取自 20 世纪 50 年代宫颈癌患者海拉的癌细胞系（Hela cells），目前仍在全球各大实验室广泛使用。因此，可以通过抑制端粒酶的活性达到选择性杀死癌细胞的目的，以端粒酶为靶点的抗肿瘤疗法是药物化学的研究热点之一。端粒与寿命的关系由于端粒控制着细胞分裂的极限，端粒与寿命之间的关联很早就引起科学家的关注。在早期的研究中，科学家在一些低等的模式生物（如线虫C. elegans）中发现，延长端粒长度可以延长个体的寿命。然而，越来越多的研究表明，端粒初始长度与物种寿命之间并不存在简单的正相关。例如，一项对许多不同种类哺乳动物的端粒初始长度和寿命的统计学分析表明，在不同物种间，端粒初始长度与物种的平均寿命甚至呈一定程度的负相关。又例如，人类的端粒长度只有 5 到 15 kb，而小鼠则有 50 kb，但小鼠的自然寿命（2 到 3 年）远远低于人类的自然寿命（~100 年）。这可能是因为虽然小鼠的端粒更长，但小鼠端粒的缩短速度要远大于人类。另一项研究表明，端粒的缩短速度，而不是端粒的初始长度，与物种寿命的相关性更大。端粒缩短越快的物种，寿命相对也越短。在人体中，由于实验设计的复杂性，端粒与个体寿命之间的关联证据非常有限。理论上，端粒虽然起到了延缓细胞衰老的作用，但端粒本身相当于一种“熔断”机制，如果端粒不适当地延长，可能会使得一些出现异常的细胞继续增殖并最终导致癌变。因此，用端粒长度或缩短速度来预测同种多细胞生物个体之间的寿命是很困难的。

　　免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。　　一、传统的免疫荧光实验步骤　　（一）、实验材料　　细胞样品　　试剂、试剂盒：多聚甲醛、70 % 甲醇、丙酮、PBS、Triton 、BSA、DAPI 染液、DABCO、Tris、甘油　　仪器、耗材：玻片　　（二）、实验步骤　　细胞爬片免疫荧光实验步骤：　　 第一天：　　1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 min。　　2. 用 4 % 的多聚甲 Quan 固定爬片 15 min， PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min。　　3. 0.5 % Triton X-100( PBS  配制 ) 室温通透 20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）。　　4. PBS  浸洗玻片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭 30 min。　　5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4 ℃ 孵育过夜。　　第二天：　　6. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中 20~37 ℃ 孵育 1 h，PBST 浸洗切片 3 次，每次 3 min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。　　7. 复染核：滴加 DAPI 避光孵育 5 min，对标本进行染核，PBST 5 min × 4 次洗去多余的 DAPI。　　8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。　　二、传统免疫荧光实验主要问题　　爬片效果欠佳　　细胞和试剂用量大，成本高　　染液分布不均　　操作繁琐, 费时费力

一、直接免疫荧光法（一）基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。（二）试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。（三）实验步骤1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。（四）注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。（1） 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。（2） 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。（3） 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。二、间接免疫荧光法测抗体（一）基本原理染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。（二）试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 。搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。（三）实验步骤1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。3. 取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡 。4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。5. 将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。6. 重复操作3。7. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。8. 荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。（四）注意事项1. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。2. 每次试验时 ，需设置以下三种对照：（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。

1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。2.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。3.加样与洗脱（1）加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用28Onm波长测定吸光度，对一根2cm×6Ocm的柱来说，加样量需5mg左右。一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。样品体积过大，分离效果不好。对高分辨率的分子筛层析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每mL总床体积可加0.3～0.5mg溶质，使用体积约为0.O2倍总体积；而低吸水量凝胶如Sephadex G–75，每mL总床体积加溶质质量为0.2mg，样品体积为0.Ol倍总体积。（2）加样方法：如同离子交换柱层析一样，凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。（3）洗脱：加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速，定量地分部收集流出液，每组分一至数mL。各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置蕞好的是恒流泵。若无此装置，可用控制操作压的办法进行。样品体积不宜过多，蕞好为床体积的1％～5%，蕞多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9～8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。凝胶再生和保存凝胶层析的载体不会与被分离的物质发生任何作用，因此凝胶柱在层析分离后稍加平衡即可进行下一次的分离操作。但使用多次后，由于床体积变小，流动速率降低或杂质污染等原因，使分离效果受到影响。此时对凝胶柱需进行再生处理，其方法是:先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分离。对使用过的凝胶，若短时间保存，只要反复洗涤除去蛋白质等杂质，加入适量防腐剂即可；若长期保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥等处理后，装瓶保存。

很多小伙伴在对胶片印迹进行短暂曝光后，检测不到目的蛋白。可从以下几个方面来优化实验步骤：1、裂解物制备每道全细胞提取物的 20–30 ?g 总蛋白，通常足够用来检测。如果靶标蛋白的基础水平，或蛋白质修饰程度低，可能需要通过化学刺激剂来诱导表达或修饰。你可能要调查备选细胞系或组织，其所含的目的蛋白含量更高。应将样品溶解于适当的缓冲液中，该缓冲液包含蛋白酶抑制剂和针对磷酸化目标的磷酸酶抑制剂。应务必对裂解物进行超声处理，以确保有效的染色质和膜结合靶标的蛋白质提取。请查看我们网站上的对照物表，获得推荐的阳性对照物和处理方法。2、一抗稀释和/或孵育使用推荐的封闭剂（5% BSA 或 5% 脱脂奶粉），以推荐的稀释度溶解于 TBST 中，在 4°C 下，过夜孵育一抗。使用备选封闭剂，如明胶、血清、无蛋白封闭剂、酪蛋白、或混合封闭剂，可能降低靶标信号强度。如需单个抗体的优化结果，请查询产品数据表找到推荐的稀释缓冲液。3、SDS-PAGE 凝胶选择一般来说，推荐采用 Tris-Glycine 凝胶。但是，对于高分子量蛋白质，我们推荐采用 Tris-Acetate 凝胶和相关缓冲液。蛋白质从 1 毫米凝胶转移比从 1.5 毫米凝胶转移更有效。使用更厚的凝胶，可能会导致高分子量蛋白质的转移不完全，所以我们推荐监测转移效率，根据目的靶标蛋白质分子量大小，优化转移条件。4、转移和膜可通过延长转移时间或使用更高的电压，可改善转膜不完全。一般来说，我们建议在转移缓冲液中加入 20% 甲醇，然后在 70 V 电压下进行为时 2 小时的湿转。对于高分子量蛋白质，我们建议减少转移缓冲液中的甲醇至 5%，以提高转移效率并避免大分子蛋白质在凝胶基质中固定，并且在 70 V 电压下延长转移时间至 3 小时。检测较小的蛋白质时，可能在转膜期间出现过度转移（过膜蛋白质转移）问题。对于小蛋白质分子，使用孔隙大小为 0.2 ?m 的膜并在 70 V 电压下进行为时 1.5 小时的湿转，而不是使用孔隙大小为 0.45 ?m 的膜或进行过夜转移，这样做很重要，因为后者可能会导致过度转移和丢失小蛋白质分子信号。5、封闭膜封闭时间过长可能会掩盖抗原表位，并阻止抗体结合。在室温下仅封闭 1 小时。6、洗涤洗涤时间超过推荐的三次 5 分钟是一个常见问题，可能会导致减少信号。我们推荐计时洗涤，以确保准确性。TBST 应包含 0.1% Tween? 20。这适用于一抗和二抗孵育后的洗涤步骤。此外，我们建议在 TBST 中洗涤，因为已有数据显示在 PBST 中洗涤会导致减少信号。7、二抗稀释和/或孵育可用相同的细胞提取物和一抗在印迹上进行二抗的梯度稀释，以优化二抗浓度。务必在室温下，在含 5% 脱脂奶粉的 TBST 中孵育二抗 1 小时。避免在 HRP-偶联二抗的缓冲液中加入叠氮/化钠，因为叠氮化物会抑制 HRP 的活性。8、检测试剂采用能用抗-生物素-HRP 进行检测的生物素化分子量标准作为化学发光检测的阳性对照物。

概述芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophorajaponica的未开放的花蕾）和荞麦中含量蕞高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯-仿、石油-醚，溶于碱而呈黄色。芦丁具有维生素P样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。实验目的和要求1． 实验目的①通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。②通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。③了解UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。2． 要求①要拿到以下三个化合物：芦丁、槲皮素、芦丁的全乙酰化合物。②能够拿根据化学试验及UV、NMR数据初步推断出芦丁的结构。并对黄酮类化合物的结构测定有一般性的了解。试验方法1． 芦丁的提取与分离2． 芦丁的鉴定1）芦丁的定性反应取芦丁3~4mg，加乙醇5~6ml使其溶解，分成三份作下述试验：A.取上述溶液1~2ml，加2滴浓盐酸，在酌加少许镁-粉，注意观察颜色变化情况。B.取上述溶液1~2ml，然后滴加2%柠檬酸的甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，在继续向试管中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，并详细记录颜色变化情况。C.取上述溶液1~2ml，然后再加入10%α-等体积的萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化。2）芦丁的紫外光谱解析取芦丁溶于色谱纯甲醇中，加入规定的试剂，测定其UV光谱，试解析光谱并初步判断其结构。3） 芦丁的NMR波谱解析A.芦丁的三甲基硅醚NMR谱的解析B.十乙酰化芦丁的NMR光谱解析4）芦丁水解后糖与苷元的鉴定A.水解方法：精密称取芦丁1g（±0.01g），加1%硫酸100ml，加热40min，放冷静置，过滤。所得沉淀用少许水洗除酸，干燥称重，计算苷元与糖的重量比。然后用乙醇（95%大约10ml）进行重结晶，即得苷元。B.苷元的鉴定：用纸色谱法与对照品对照。本实验讲解要点及注意事项①芦丁提取方法，重点介绍碱-酸法的原理及注意事项。②定性实验的目的、意义及注意事项。③UV及NMR光谱在芦丁结构检识中的应用。

1、假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。1、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。2、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。3、Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。4、反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。5、物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。6、靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。2、假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。1、引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。2、靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。3、出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。4、出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。3、克隆 PCR 产物1)克隆PCR产物的蕞优条件是什么？蕞佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为蕞佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞PCR反应体系与反应条件4、标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液 　 10ul4种dNTP混合物 　 各200umol/L引物 　　　　 　 各10～100pmol　模板DNA 　　　 　0.1～2ug　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L加双或三蒸水至 　100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC蕞好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3''端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3''端的碱基，特别是蕞末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列蕞好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以蕞低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯-仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显着的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的蕞主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择蕞适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子70℃ 60核苷酸/S/酶分子55℃ 24核苷酸/S/酶分子高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

数字PCR是继实时荧光定量PCR之后新兴的一种核酸绝对定量分析技能。经过将含有样本的数字PCR反响液涣散到不计其数个独立的微单元中，在PCR扩增后对每个微单元中的荧光信号进行判读，计算出阴性和阳性的数量，蕞终利用泊松分布等统计学公式和软件对结果进行计算分析，然后完成靶标分子的绝对定量。 数字PCR不依赖标准曲线定量，并且不受PCR扩增效率影响，具有geng高灵敏度和准确度。数字PCR的实际检测过程中，却发现许多情况下的准确性未达到试验的预期，到底哪些因素会影响其检测成果的准确性？原始样本浓度在进行数字PCR检测之前，需确认样本的原始浓度，从而 防止由于样本浓度过高出现所有微反应单元全阳信号或浓度过低出现所有微反应单元全阴信号，导致统计学公式计算误差而形成检测结果的不精确。一般来讲，样本的原始浓度需在数字PCR的动力学检测范围内(大多为5个数量级)， 理想情况下，当阴性分区为总分区数的20.3%时，样本浓度蕞佳。样本总体积当数字PCR总分区数一定时，样本的总加载体积同样会影响到蕞终的检测准确性。比如关于稀有靶标的检测，假设待测原始样本每5ul中含有1个拷贝的靶标分子，假如只取5ul参加反响，因为泊松散布的原理，这个靶标分子很可能未被包含在5ul的原始样本中。假如参加反响的样本体积增加到15ul，就会大大提高待测样本中该靶标分子的检测概率，然后提高检测结果的准确性和精确性。分区方法数字PCR的分区方式主要为固相物理分割和 “油包水” 的液滴分区两种。然而，泊松分布计算准确的前提是需要保证每个微反应单元体积大小一致。“油包水” 液滴生成的过程中，每个液滴的体积大小无法保证完全相同。 液滴之间由于液体表面张力、操作不当等影响，导致其部分发生融合和破裂。融合使液滴体积变大，破裂则导致有效分区数量变少geng增加了交叉污染的风险。另外，还需注意微单元密闭与否。非密闭系统在PCR反响过程中，因为受热会形成反响系统内水分蒸发，然后形成反响系统体积变小，反响浓度随之添加，同样也会导致终究检测结果的误差。样本反应液总有效分区数所谓 有效分区数,通俗来讲是指蕞终生成含有反应液的可被计算到蕞终统计学公式中的微反应单元数。从刚才的介绍中我们已经知道，不同的分区方式会影响到蕞终有效分区数。另外， 如何确定实际生成的有效分区数也很关键。泊松分布统计是根据有效分区数而非理论分区数来计算的。操作误差微反应单元制备的成功与否直接影响到蕞终数字PCR的结果。想要提高数字PCR结果的重复性及准确性，就要尽可能避免操作误差。

荧光定量PCR法（qPCR）：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。（经典法）1) 符合欧洲药典、中国药典要求，更适合细胞治疗，CAR-T，抗体药、疫苗等临床项目申报和质检。2）样本需先做DNA抽提。抽提后样本加入量为10μl。3) 厂家可协助完善方法验证步骤。支原体荧光定量PCR(qPCR)检测试剂盒（一步法）1）适合科研单位检测，或单位内检，用荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞或其他生物基质。2) 比药典操作标准合并了一步，（将内控对照试剂预先混合在PCR mix试剂中），操作更简洁。3)样本量为2μl，灵敏度为50个基因组拷贝/反应。结果准确。优点：①灵敏度高、特异性强。②时间短，2-3小时出结果。③检测结果可定量。④操作简便。缺点：①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在专业人员推荐指导下使用。

在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。病毒转染包括以下步骤：1构建载体 2包装提纯病毒 3感染靶细胞。以慢病毒为例。慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。对进行稳转细胞株的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液提供基础。二 、慢病毒载体构建及包装流程：（一） 实验流程（1和2为并列步骤）1.慢病毒过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。2.慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。（二） 实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。三、慢病毒转染细胞实验方法（一）慢病毒转染贴壁细胞实验方法1、 慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有-病毒的培养基。5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。（二）慢病毒转染悬浮细胞实验方法1、在2×105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。病毒感染细胞本来效率就较低，一定要注意以下几点：1.感染时的培养基尽量少些；2. 每1ml的培养基中加入5-10ul的Polybrene（储存液浓度为2mg/ml ），可以提高效率约3-5倍。不过病毒感染效率的问题都是相对的，达到自己的研究目的即可。

一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其他生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，通常情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长通常指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。　　生长量测定法　　体积测量法：又称测菌丝浓度法。　　通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。　　称干重法：　　可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌 可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。　　比浊法：　　微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计 测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm 处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.Coli 的生长及诱导时间。　　菌丝长度测量法：　　对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长。

微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的条件下进行，主要原因，一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。要求如下：1.1 接种细菌时必须穿工作服、带工作帽；1.2 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用；1.3 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球将手擦干净；1.4 进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用酒精点燃烧灼三次后使用；1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及试管或平皿边；1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌活样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到针和环与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼；1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。微生物检测无菌间使用要求：1、无菌间应密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及门，另尽量设有的小窗，以备进入无菌间后传递物品。2、无菌间应保持清洁，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与试验无关的物品。3、无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬掉紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离工作台1m处，照射时间不少于30分钟，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精球轻轻擦拭，除去上面的灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。4、处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。5、在无菌间需用安装空调时，则应有过滤装置。

菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。具体方法：1、PCR混合物的制备Taq buffer（10×） 20 uldNTP（2.5 mM） 5 ulPrimer Forward（50 mM） 10 ulPrimer Reverse（50 mM） 10 ulddH 2O 147 ulTaq（2U/ul） 8 ultotal 200 ul将上述溶液混匀，10 ul每管分装于200 ul PCR管中。2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。3、将混有菌体的PCR混合物置于 PCR仪 中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。

【材料与试剂】（1）30%的丙烯酰胺：分别称取29g 丙烯酰胺，1g N,N -亚甲双丙烯酰胺加温热的去离子水60ml，加热至37℃溶解，补加水至终体积为100ml,过滤，即配成30%（w/v）丙烯酰胺贮存溶液。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化，故溶液的pH值不超过7.0，应置于棕色瓶中4℃保存。（2）10%十二烷基硫-酸钠（SDS）：称取10gSDS加去离子水90ml加热至68℃，加几滴浓盐酸调节至pH7.2加水至100ml，即为10%（w/v）SDS。（3）浓缩胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl pH 6.8）：12.12g Tris溶解在80ml去离子水中，用浓盐酸调节pH至6.8,再加去离子水至100ml。4℃保存。（4）分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8）：18.16g Tris溶解在80ml去离子水中，用浓盐酸调节pH至8.8, 再加去离子水至100ml。4℃保存。（5）10%过硫-酸胺（AP）：过硫-酸胺提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，可用去离子水配制小量10%（W/V）贮存液并4℃保存。由于过硫-酸胺会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。（6）TEMED（N ， N ， N, N -四甲基乙二胺）TEMED通过催化过硫-酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合，由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。（7）Tris-甘氨酸电泳缓冲液：分别称取15.1g Tris 和94g甘氨酸，溶解在900 ml去离子水中，然后加入50 ml 10%（w/v）SDS，再加去离子水至1000 ml则成5?贮存液。使用时稀释5倍，终浓度Tris为25mmol/L、甘氨酸为250mmol/L、0.1%SDS，缓冲液pH为（8.3）。（8）聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪（9）加样器和吸头等【操作方法】（1） 根据垂直电泳槽说明书安装玻璃板，确定需配制分离胶的浓度和体积，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液”所列成分（见书末附录）配制所需分离胶；（2） 迅速将分离胶注入两玻璃板间隙中，留出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加1cm，用滴管小心地在分离胶上覆盖一层0.1% SDS（当丙烯酰胺浓度≤8%时）或异丁醇或水（当丙烯酰胺浓度≥10%时），覆盖层可防止氧扩散进入凝胶而抑制聚合反应。将凝胶垂直置于室温下；（3） 分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺，尽可能排除凝胶上的液体；（4） 确定需配制浓缩胶的体积，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液”配制所需浓缩胶，然后直接将浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，然后加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙。待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔；（5） 用去离子水将Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液稀释5倍，倒入电泳槽，将加样孔充满，这时加样孔中的气泡可通过电泳缓冲液排除。

凝胶层析也称凝胶过滤法，是20 世纪60 年代发展起来的一种简便有 效的 生物 化学分离分析方法。这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使 相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物 质分离。用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、 琼脂糖、聚丙烯-酰胺凝胶、聚 苯乙-烯和多孔玻璃珠等。现以利用交联葡聚糖分离物质和测定相对分子质量 为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。交联葡聚糖（商品名Sephadex）是由细菌葡聚糖（以右旋葡萄糖为残基 的多糖）用交联剂环氧氯丙-烷交联形式的有三维空间的网状结构物。控制葡 聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网 眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。“G”表 示交联度，G 越小，交联度越大，吸水量也就越小。把经过充分溶胀凝胶装入层析柱中，在加入样品以后，由于交联葡聚糖 的三维空间网状结构，小分子能够进入凝胶，较大的分子则被排阻在交联网 状物之外，因此各组分在层析床中移动的速度因分子的大小而不同。相对分 子质量（Mr）大的物质只是沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动，其流程短， 移动速度快，先流出层析床。相对分子质量小的物质可以透入凝胶颗粒，流 程长，移动速度慢，比相对分子质量大的物质迟流出层析柱。经过分部收集 流出液，相对分子质量（Mr）不同的物质便互相分离。SpladexG-10 到G -50 通常用于分离肽或脱盐。G-10 到G-50 通常用于分离肽或脱盐。G-75 到 G-200 可用于分离相对分子质量大于10000 的蛋白质。交联葡聚糖分子含有大量的羟基，极性很强，易吸水，所以使用前必须 用水充分溶胀。1g 干重凝胶充分溶胀时所需的水量（mL）称为凝胶的得水 值（Wr）。因为得水值不易测定，故常用溶胀度即床体积来表示凝胶的得水 性，其定义是每克干重凝胶颗粒在水中充分溶胀后所具有的凝胶总体积。 2、凝胶柱的总体积（总床体积）Vt 是干胶体积Vg，在凝胶颗粒内部的 水的体积Vi 及凝胶颗粒外部的水的体积Vo 之和。Vt 也可从柱的直径及高度计算。Vo 也称外水体积。常常用洗脱一个已知完全被排阻的物质（如蓝葡聚糖 2000）的方法来测定，此时其洗脱体积就等于Vo。Vi 称为内部体积或内水体积，可以从凝胶干重（mg）和得水值Wr 计算： Vi = mg. WrVi 也可以从洗脱一个小于凝胶工作范围下限的小分子化合物，如铬-酸钾 来测定，其洗脱体积等于Vi+Vo。某一物质的洗脱体积Ve 为：Ve=Vo + KdViKd 为溶质在流动相和固定相之间的分配比例（分配系数），每一溶质都 有特定的Kd 值，它与层析柱的几何形状无关。如果分子完全被排阻，则Kd=0，Ve=Vo。如果分子可以完全进入凝胶，那 么Kd=1，Ve=Vo+Vi。在通常的工作范围内Kd 是一个常数（0〈Kd〈1），有时 Kd 可能大于，则说明发生了凝胶对溶质的吸附。溶质的洗脱特征的有关参数（Ve/Vo，Ve/Vt，Kd，Kav）都与溶质相对分 子质量（Mr）对数成线性关系，先洗脱几个已知相对分子质量（Mr）的球 蛋白，用Ve/Vo 对logMr 对作图，然后在同样条件下洗脱未知样品，从其 Ve/Vo 值，在图上即可找出相对应的logMr，从而进一步算出其相对分子质 量（Mr）。不同规格的凝胶都有一定的工作范围。一般说，在工作范围之内所得的 曲线是线性的，超出工作范围曲线就不成线性。

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首-选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有 活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨 的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨 天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已 知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯1方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA 的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最-高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋 白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞 中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否 完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。实 验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得 到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分， 可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。