自2005年03月18日CFDA发布《化学药物杂质研究的技术指导原则》以来，杂质谱及相关理念逐渐成熟，杂质研究已经成为了药物CMC研发的重点与热点。近期有不少客户反馈，CDE的发补意见中，额外关注购买与使用国产杂质标准品（对照品、化合物）等相关问题。比如，在质量研究与标准的发补意见就中多次提到“如果杂质采用加校正因子的主成分自身对照法或者含量测定外标法，请对杂质对照品的含量进行标定。注意基于修订后的有关物质方法对杂质矫正因子或者含量进行测定，明确检测条件（如流动性组成，梯度程序、柱温、检测波长等）的波动对杂质分离度以及实测值的影响”。杂质标准品作为质量研究与质控核心因素，其重要意义不言而喻。于是就有很多客户出于规避风险的考虑，尽可能采购进口对照品。很多人就会想为什么要这么崇洋媚外呢？除了品牌效应，国产货与进口货有什么不一样?其实呢，国产货与进口货的差别就在于两点：基础有机合成水平和品控质控（质量意识）。所谓“人无我有，人有我优”，有机合成水平不行就做不出特定结构的化合物；品控不行则意味着产品质量不稳定，不堪大用。那么今天我们先来简述一下国内有机合成水平与国际先-进的差距：1.试剂质量。国外的试剂质量是真好，纯度、含量、品控（比如批间差异小）与国内试剂公司真是云泥之别。这个差别非常关键。且不说曾经红火一时的“铁催化”蕞终被证实是由于试剂中存在的微量铜离子起到催化作用这种乌龙事件，仅仅是由于石油-醚等溶剂中存在高沸点杂质以至于旋蒸富集与终产品混在一起导致NMR谱图有杂峰就已经令很多客户头疼不已，如此种种足见有机化学研究中试剂、原料的重要。而且有机化学这种实验性学科，合格可用的原料才是根本，但国内的试剂质量真的很差，装量差异（标签写50g却只有40g）、货不对板（标签与内容物不符）、吸水吸潮结块、含量偏低、杂质超标、溶剂含水量大甚至有颜色，不一而足。曾有人做过比较，国外工业级的溶剂质量都好过国内分析纯的，可见一斑。所以很多刚回国建立实验室的老师整天疑心实验无法重现是不是因为试剂原料不过关。2.工艺控制。国内平均水平落后。这部分涉及实验操作技术和反应器，主要是指反应过程中的温度控制、无水无氧等条件控制。举个例子，国产加热磁力搅拌器的控温很差，虽然设定在60度，实际却是在±5~10 ℃的波动。而进口设备比如 ika、海道夫相比来说要好很多，而且梅特勒等公司有能精确控温至 0.1 ℃的产品。而无水无氧操作，简单的用双排管、复杂的需要手套箱，在国外基本算是标配，国内则还不那么普遍。而说到反应器，大多数化学家都还是使用烧瓶烧杯，少数人在用商品化的特殊反应器，还有一部分人在搞流动化学和微反应器。其他的设备，比如微波、超声、光化学等专用反应器，国外一般都有成熟的商业化产品，而国内也开始有公司开始做这方面的产品。3.测试分析。在国内中低级需求基本满足，高端领域落后很多。常规仪器，比如 HPLC、GC、GC-MS、HPLC-MS、NMR、XRD 等等，与国外配置差异不大，但往往操作员水平不足以至于难以发挥蕞佳性能，而且测试慢不及时。高端仪器，比如：同步辐射源 XRD、原位分析技术，国外领-先无可厚非。在国内几乎别想，只有少数垄断者或与国外有合作关系的老师或许能用上。自搭仪器，国内几乎空白，即便在国外，能自己搭仪器的也都是领域顶-尖。4.合作交流。国内学术交流氛围差，组与组、学校与学校、高校与企业间的合作交流一直比较差，虽然说近几年有所改观，但同行间依然讳莫如深。蕞直接的结果就是，工业界的需求无法反馈给学术圈、学术界的技术成果无法转化。很多人故步自封、偏安一隅，只在自己的小领域中活动，缺少创新，往往是同寝室研究生彼此之间不知道对方在研究什么东西。而反观国外，跨领域、跨学科合作搞研究发表论文都是常态，人员流动和信息交流没有明显障碍。5.自动化程度。这个问题呈现两极分化，国外人力成本较高，基本趋势是能用机器的尽量减少人工。而国内呢，劳动力便宜、学生多、而仪器设备成本高，于是可以人工操作解决的尽 量不买仪器。比如中压制备色谱在国外已经普及，但国内普遍还都是手工加压柱层析。其他方面比如 LIMS（实验室信息管理系统）、文献管理软件、协同写作、信息共享，国内课题组普遍的做法就是人工解决，而国外偏向于使用自动化软件。不得不提的一个话题是“高通量筛选”，国内虽然也有人做，但自动化程度落后国外一大截。大多数人都是有心无力，完全无从下手。而国外的情况也好不了多少， 究其根本，不过是因为大多数做化学的人玩不转自动化和编程而已。以至于有人用 乐高积木搭一个自动进样装置都能发论文。6.基础理论。国内基础差、重视程度低、研究手段落后。国内的有机化学研究普遍还停留在“找反应、做合成”这种程度，轻视机理研究。而更高层次的战略性前瞻性的理论研究，比如曾经的“逆合成分析”、Baran 的“Two-phase synthesis”这种有一定思想性的有机合成理论研究，国内基本没有。而有机化学和信息科学结合产生的“计算机辅助有机合成”、化学专家系统、化学反应与物性数据库、化学信息挖掘与处理等方面，国内的水平依然比较原始，有一些雏形却看不到发展壮大的希望。而国外已经有非常成熟的产品，比如 Scifinder、reaxys、pubchem、NIST、chematica、ICSYNTH 。当然这部分勉强可以归结为计算化学和化学信息学的滞后。

一、前言1. 杂质的定义 ：任何影响药物纯度的物质统称为杂质，但需要注意的是原料药中不属于活性成分的任何成分，制剂中不属于活性成分或辅料的任何成分。2. 杂质的来源原料药中杂质的来源：合成工艺（试剂、溶剂、催化剂、中间体、副产物、副反应产物等） ；生产器具、生产设备（生产器具、生产设备中的成分及其降解产物等） ；生产环境（通过GMP控制） ；包装材料或包装容器（浸出物等） ；运输及储存（降解产物等）制剂中杂质的来源 ： 处方（原料药引入的杂质、辅料引入的杂质、主辅料相互作用产生的加合物等） ； 制剂工艺（制粒、压片工艺，过滤、灭菌工艺，熔融挤出等） ；生产器具、生产设备（生产器具、生产设备中的成分及其降解产物等） ；生产环境（通过GMP控制） ；包装材料和包装容器（浸出物、浸出物与处方成分的反应物等） ；运输及储存（降解产物等）3. 杂质的分类有机杂质 ：非挥发性（合成物料、中间体、副产物、副反应产物、聚合物、异构体，有机包 装材料的寡聚物、添加剂等） ；挥发性：（溶剂、试剂、有机包装材料的单体等）无机杂质 ：元素杂质（催化剂，生产器具、生产设备、无机包装材料的组成成分或有机包装 材料中的添加剂成分等） 无机盐：无机试剂等。有关物质 ；残留溶剂 ；元素杂质 ； 基因毒性杂质。工艺杂质 ；异构体 ；降解产物 ； 加合物 ；浸出物；析出物；迁移物。4. 杂质研究的重要性杂质是药物（原料药和制剂）的关键质量属性，是药物研究（质量、安全性） 的重要内容，也是药物评价重点关注的内容。杂质研究分布在药物研发的各个环节（所用物料、中间体、原料药、处方前 研究-原辅料质量评估和处方设计及其优化、制剂工艺、稳定性、相容性、包 装完整性等）。杂质研究贯穿于药品的整个生命周期（开发优化工艺、设计优化处方、安全 性、原辅料质量控制、生产过程控制、生产质量检验、上市后稳定性、产品质 量回顾性分析，以及变更管理等）。5. 杂质研究的目的杂质研究的目的就是通过对所用物料及终产品（API、制剂）中杂质的研究， 以及对生产过程中杂质的产生、转化或清除过程研究，了解药品质量风险的 过程，为优化、确认处方、工艺、包装、贮藏条件提供支持性信息，并据此 建立药品质量全过程管理计划及杂质的控制策略 ——揭示产品的质量，了解产品的质量风险，实现对杂质全过程风险管理。二、杂质研究的思路1. 杂质分析及毒性评估杂质分析 ：现实存在的杂质、可能出现的杂质、潜在的杂质 ；各杂质的来源、转化、消除的路径，并做简要说明杂质毒性评估 ：根据各杂质的结构评估其毒性，特别是要评估其是否具有警示性结构或 可能具有致癌性、致突变性、生殖毒性等，并简要说明依据 杂质分析及毒性评估建议列表论述 （不同类别的杂质可以分别列表）杂质分析 ：杂质的来源——工艺路线（起始物料、试剂、溶剂、催化剂、中间体、副产物、副反应产物等）， 结构特征（反应性、稳定性等），所用辅料（辅料引入的杂质、主辅料形成的加合物等），设 备（可能引入的成分）、包装材料或容器（浸出物、浸出物与处方成分的反应物等），实际检 出的、有可能出现的、潜在的 。杂质的转化——根据结构特征、工艺路线，论述现实存在的和可能的转化产物（持续存在的杂质 也要说明）杂质的清除——根据杂质的性质（溶解性、反应性、挥发性及稳定性等），论述杂质的清除路径 及清除效率杂质毒性评估 ：结构特征（警示性结构-M7、1类和2类溶剂、1类和2类元素等）2. 根据杂质的性质选择适宜的分析方法非挥发性有机杂质（HPLC、UPLC、IC等及联机技术）； 挥发性有机杂质（GC等，及联机技术）；元素杂质（ICP、AAS等，及联机技术）。注意：根据杂质的毒性及限度要求选择灵敏度符合要求的分析方法3. 针对不同的方法进行方法学验证专属性、灵敏度（检测限、定量限）、准确度、线性及范围、精密度、耐用性等4. 制定合理的杂质限度安全性（工艺路线的安全性及工艺对杂质的清除能力，杂质的水平应经过安全性确认）；工艺的稳定性及批分析结果的统计分析 ；稳定性数据 ；分析方法的误差。5. 建立杂质的控制策略何时控制？物料控制 ，中间过程控制（工艺参数、IPC、中间体），终产品控制（原料药、制剂）如何控制（控制的指标及控制的水平）？ 原辅料的选择及质量控制 ，包装材料或容器的选择及质量控制，生产器具的选择和设备的确认 ，中间体的质量控制 ，终产品的质量控制，上市后产品质量回顾性分析和安全性监测。杂质研究及控制的逻辑基于对原料药合成物料的理化特性、合成工艺、降解途径，以及原料药 的理化特性、合成工艺、所用设备、降解途径、包装材料等的研究和理解；基于对制剂所用辅料的性质、制剂的处方工艺、所用设备、包装材料等 的研究和理解 ---通过分析评估、设计试验获得工艺各步骤杂质的产生、转化及/或清除 的数据 ；制定杂质的控制计划（每步工序需控制的物料的杂质种类及水平，质控 前移，全过程风险管理）

[原理]由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质溶液在280nm处具有紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在此波长处的吸光度与其浓度呈正比关系，因此利用这一性质可进行蛋白质定量测定。该法迅速、简便、不消耗样品、低浓度盐类不干扰测定，可测定0.1～1.0mg/mL的蛋白质溶液。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH变化而改变，故应用此法时要注意溶液的pH。最好样品的pH与标准曲线制定时的pH一致。本法对于测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质误差较大，故适用于测定与标准蛋白质酪氨酸、色氨酸这类氨基酸含量相仿的样品；若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。例如混有核酸，核酸可吸收波长为280nm的紫外光，但它对260nm紫外光吸收更强。而蛋白质恰恰相反，280nm的紫外吸收值大于260nm紫外吸收值。运用280/260吸收差法则可以适当校正核酸对蛋白质浓度测定的干扰作用。[方法与步骤]1、标准曲线的制作取7支试管，编号后按下表依次加入标准蛋白溶液和氢氧化钠溶液。管号试剂0123456标准蛋白溶液/mL00.51.01.52.02.53.00.1mol/L NaOH/mL4.03.53.02.52.01.51.0加毕，搅匀，选用石英比色皿，用紫外 分光光度计    测A280。以每管标准蛋白毫克数为横坐标，对应的A280值为纵坐标，作标准曲线图。2、蛋白样品测定（1）标准曲线法实验中样品可用牛奶中自制的酪蛋白溶液加0.1mol/L NaOH稀释而成。把样品蛋白溶液装入石英 比色皿 中，测A280，对照标准曲线求得蛋白质浓度。式中 n——从标准曲线上查出的酪蛋白毫克数。（2）280nm与260nm吸收差法：分别测定蛋白质样品在280nm、260nm处的吸收值，按下列公式计算蛋白质质量浓度。蛋白质质量浓度（mg/ mL）=1.45 A280 - 0.74 A260式中 A280——蛋白质溶液在280nm出测得的吸光度；A260——蛋白质溶液在260nm出测得的吸光度。不同蛋白质及核酸的光吸收率不完全相同，按此式计算仍可能产生误差。

噬菌体是一类侵害细菌的病毒，又称为细菌病毒(bacterialvirus)。英文名称为bacteriaophage，简称phage，来源于希腊文“phagos”，意为“吞噬”。1.噬菌体特征噬菌体具有一般病毒所有的特征：为非细胞生物，其结构主要由蛋白质和核酸（DNA或RNA）组成；它们只能在活细胞内营专性寄生，靠其宿主代谢补充，协助来复制核酸合成蛋白质等组分，然后再进行装配增殖。在离体条件下，能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性；非常专一的寄生性，在自然环境条件下，它们只能侵染细菌和一些原生生物，而不能侵染高等生物和植物；对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感；个体小，可通过除菌滤器噬菌体没有个体的生长过程，只有基本成分的合成和装配，所以一般将噬菌体的繁殖称作复制。烈性噬菌体在宿主菌体内复制增殖，产生许多子代噬菌体，达到一定数量时，由于噬菌体合成酶类的溶解，导致宿主细胞裂解，释放出的噬菌体再感染其他敏感细菌。温和噬菌体感染宿主菌后并不增殖，而是将其基因整合于细菌染色体上，形成前噬菌体。在前噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。噬菌体的危害噬菌现象：液体培养基溶氧急剧上升，产生大量气泡，在较短时间内菌体大量自溶，发酵液蕞终变清。固体培养基出现噬菌斑。利用细菌或放线菌进行的发酵容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大的威胁。一旦发生噬菌体污染，会导致发酵异常、倒罐,使工业生产遭到严重损失。噬菌体的防治措施1.外来可疑菌种一律不做增殖。2.多菌种交替使用，采用抗噬菌体的感受态。3.划分大肠杆菌的操作区域，接种区，发酵区，收菌区，菌种保藏区要严格分开。4.严禁活菌排放，废菌高压灭菌后方可倾倒。5.规范操作，避免污染。6.保证洁净，干燥的工作环境。噬菌体的杀灭方法高温大多数病毒耐冷不耐热，高压蒸汽或者干热180°C可彻底灭活。pH多数病毒在pH6~9范围内比较稳定，在pH5.0以下或PH9.0以上迅速灭活。射线γ射线、x射线及紫外线都能灭活病毒。酚类和醛类及其衍生物蛋白变性剂，能破坏病毒衣壳蛋白。氧化剂，卤素及其化合物70%甲醇，乙醇均可使多数病毒灭活。虽然甲醛熏蒸的效果显着，但对于大多数实验室来说并不具备该条件，且对人体有害。实验室适用的方法表面消毒对于物品表面的消毒，可用84或新结尔灭。紫外照射选用254nm光谱紫外过夜照射。臭氧杀菌臭氧过夜杀菌，早上通风1小时，无残留。臭氧作为-神绿色消毒剂，对大肠杆菌、乙肝病毒、黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等具有极-强的灭活效果，其灭菌速度是紫外线的3000倍。臭氧的半衰期为20-50分钟，且蕞终的分解物为氧气，所以对人员及物品不会有残留污染。

　　一、准备工作　　准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。　　二、取材　　在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的shou次培养称为原代培养。　　理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。　　由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。　　三、培养　　将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。　　正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。　　一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。　　培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。　　四、冻存及复苏　　为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。　　复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。　　冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

外植体灭菌是植物细胞组织培养重要的工作之一。接种用的材料表面，常常附有多种多样的微生物，这些微生物一旦带进培养基，就会迅速滋生，使实验前功尽弃。因此，材料在接种前必须进行灭菌。灭菌时，既要将材料上附着的微生物杀死，同时又不能伤及材料。因此，灭菌采用何种药剂，什么浓度，处理多长时间，均应根据材料对药剂的敏感情况来确定。与灭菌相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫作无菌操作。一般来说，外植体接种的过程都是在无菌的环境里进行的，因此，外植体接种前都必须彻底灭菌。用于植物外植体灭菌的灭菌剂有升gong、甲醛、过氧化氢、高锰-酸钾、来苏儿、漂bai粉、次氯-酸钠、抗生素、酒精等。使用这些灭菌剂，都能起到表面杀菌的作用。现将主要灭菌剂常用浓度和灭菌效果列出，其中70％～75％的酒精有较强的杀菌力、穿透力和湿润作用，可排出材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入，常与其他消毒剂配合使用。酒精穿透力强，易损伤材料，所以一般处理时间要短。上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化gong可短期内贮用。次氯-酸钠和次氯-酸钙都是利用分解产生氯-气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升gong是用重金属汞离子来灭菌的；过氧化氢是分解释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水漂洗3～4次即可；由于用升gong液灭菌的材料，难以对升gong残毒有效去除，所以应当用无菌水漂洗8～10次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入灭菌溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在快到时间之前1～2min，开始把灭菌液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较灭菌效果，以便改正。灭菌液要充分浸没-材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。在灭菌溶液中加吐温80效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭两的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的0．5％，即在100mL加入15滴。最后一步是用无菌水漂洗，漂洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，漂洗3～l0次。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。外植体的灭菌工作应在接种室或接种箱内无菌的条件下进行，各种不同类型的材料灭菌方法如下，(1)花药的灭菌用于组织培养的花药，按小孢子发育时期要求，实际上大多没有成熟，花药外而有萼片、花瓣或颖片、稃片保护着，通常处于无菌状态。所以一般只对整个花蕾或幼穗进行体表灭菌即可。如茄(solanumrnelongennaL)的花药，灭菌时先去掉花蕾的萼片，用70％酒精擦洗花瓣，然后将整个花蕾浸泡在饱和漂bai粉上清液中10min，再经无菌水清洗2～3次，即可接种。这一灭菌程序，也适用于其他植物花药的灭菌。(2)果实和种子的灭菌根据果实和种子清洁程度，用自来水冲洗10～20min甚至更长时间，然后进行消毒。荚果的灭菌；绿色荚果可以采用火焰杀菌法。将绿色荚果稍加洗涤，转入95％酒精中，然后取出荚果放入灭菌的培养皿中，点燃灼烧，并不断翻转荚果，待表面酒精燃尽，即可获得无菌荚果。再在无菌条件下取出幼胚或种子用于接种。火焰灭菌具有简便、快速、经济、彻底之优点。该程序也适用于块根类外植体的灭菌。种子灭菌：通常首先用热水浸种，然后再用次氯-酸钠或氧化gong等杀菌剂灭菌。热水浸种除具有增加种皮透性、打破种子的休眠、促进种子萌发的作用外，高水温也有一定的杀菌作用。浸种的水温和时间与种子的大小、干燥程度以及种皮厚度有关。具体步骤是用自来水冲洗10～20min，再用75％酒精消毒1～2min，再用2％次氯-酸钠溶液浸泡5min，后用无菌水冲洗3～5次，就可以去除种子的病菌，进行组织培养。果内种子则先要用10％次氯-酸钙浸泡20～30min，甚至几小时，依种皮硬度而定。对难以消毒的还可以用0．1%升gong或1％～2%溴水消毒5min。对用胚或胚乳培养的种子，如种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4％～8％的次氯-酸钠溶液浸泡8～l0min，经过无菌水冲洗后。在无菌条件下取出外植体即可用于接种，这类外植体一般都不带污染微生物。(3)茎尖、茎段及叶片的灭菌灭菌方法与花药的灭菌方法相同。对于茎叶，因为暴露在空中，且生有毛或刺等附属物，所以灭菌前应该用自来水冲洗干净，用吸水纸将水吸干，再用70％酒精漂洗一下。然后，根据材料的老、嫩和枝条的坚硬程度，用2％～10％次氯-酸钠溶液浸泡6～15min，用无菌水冲洗3次，用无菌纸吸干后进行接种。(4)根和贮藏器官的灭菌这类材料大多埋于土中，材料上常有损伤及带有泥土。灭菌比较困难。灭菌前，要用自来水清洗，并用毛刷或毛笔轻轻刷洗掉污物，必要时用刀片切去损伤和污染严重部分，吸于多余水分后用70％酒精漂洗一下，再用0．1％～0．2％的氯化gong灭菌5～10min，或用6％～8％次氯-酸钠溶液浸5～15min，接着用无菌水清洗及用无菌纸吸干，然后进行接种。

　　1.固体培养基　　标本或液体培养物划线接种到固体培养基表面后，单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的细菌集团，称为菌落(colony)。　　(1)菌落的形态特征：　　大小、形状(露滴状、圆形、菜花样、不规则等)、突起或扁平、凹陷、边缘(光滑、波形、锯齿状、卷发状等)、颜色(红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等)、表面(光滑、粗糙等)、透明度(不透明、半透明、透明等)和粘度等。据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型：　　①光滑型菌落(S型菌落)：菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。　　②粗糙型菌落(R型菌落)：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。　　③粘液型菌落(M型菌落)：菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。　　(2)菌落溶血特征：　　菌落溶血有下列3种情况：　　①α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致;　　②β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致;　　③γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。　　(3)色素：有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。　　(4)气味：某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌(生姜气味)、变形杆菌(巧克力烧焦的臭味)、厌氧梭菌(腐败的恶臭味)、白色假丝酵母菌(酵母味)和放线菌(泥土味)等。　　2.液体培养基　　细菌在液体培养基中有3种生长现象：大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊;少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等则呈沉淀生长;枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。　　3.半固体培养基　　半固体培养基主要用于细菌动力试验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培养基仍然澄清透明，为动力试验阴性。

我们都知道，细胞如果要长期保存，需要冻存起来放液氮保存。那怎么样冻存细胞才能保证细胞能正常复苏，不至于冻存死亡呢？下面我们就来讲讲细胞冻存应该注意的一些地方。1. 保持冻存前细胞状态良好冻存前一定要保证细胞状态良好，细胞处于对数生长期，否则不管后面怎么处理，冻存后的细胞状态必然有影响。若细胞密度偏高，培养基已经略微变黄，细胞状态正常，需要换液培养2h以上再冻存细胞；若已完全变黄，细胞死亡超过20%，需要传代后再重新培养至状态正常后再冻存细胞。2. 消化、吹打细胞按尽量轻柔如何正确消化、吹打细胞在前面已经讲过了，有兴趣的话可以到以往文章里看看，这里就不再赘述了。冻存后细胞培养瓶和培养皿肯定还是会残留一点细胞，这些残留的细胞加新的培养基继续培养，如果培养正常就可以看出冻存时消化、吹打操作是没有问题的，如果直接死了或者状态不好，那冻存的细胞自然也好不到哪里去，问题出在哪就很明显了。3. 冻存液配方要给合适的冻存液配方这个其实不同实验室都有自己的习惯，有FBS+10%DMSO的，也有完全培养基+10%DMSO的，还有基础培养基+血清+DMSO=7:2:1 6:3:1 5:4:1，可以说是五花八门，但总体来说，DMSO一般是不超过12%的，血清浓度越高冻存效果也越好，因此需要多冻几次对比合适的配方。4. 冻存液要提前配置冻存液使用时要提前配好，不能直接在细胞悬液中加DMSO冻存细胞，否则DMSO溶解时浓度不均加上溶解放热会损伤细胞活性。可以现配先用，也可以多配一点，4度最多可以保存3个月，-20度可以保存一年。细胞用冻存液重悬后应尽快放到4度或者程序性冻存盒开始冻存，避免长时间室温状态，因为室温条件下DMSO对细胞是有害的。5. 冻存细胞数量选择通常来说，冻存细胞都会有一部分细胞死亡，所以冻存剩下的活细胞数量才是决定细胞复苏后能否正常养起来的关键。一般冻存不容易死的细胞数量每管在100-200万就够了，一些冻存很容易死的细胞，比如NK92、THP-1、SF9等细胞数量要稍微高点，300-400万左右为宜。冻存液一般1ml左右每管，这个基本每个实验室都差不多。6. 冻存程序选择冻存的时候可以选择用程序性冻存盒直接放到-80度冻存细胞，但要记得异丙醇要及时更换，一般用4-5次异丙醇含水量就超标了，不再适合冻存细胞使用。也可以将冻存管依次在4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。-80度不适合细胞长期保存，只能短期保存，最好不要超过一周，否则有部分细胞系活性可能会下降很厉害，长期保存的细胞最好放液氮罐保存。7. 注意冻存检查冻存细胞后应在同一批次内随机选一只细胞复苏检测冻存效果， 如果复苏效果不佳的话需要找到问题所在摸索合适条件重新冻存细胞，如果复苏良好的就可以放到液氮里长期保存了。这个也是前面推荐将冻存剩下的细胞继续培养的原因，可以有效避免细胞冻存失败导致绝种。

试剂耗材种类繁杂，数量多，尤其以化学试剂为最。化学试剂是实验室中品种最多、消耗量最频繁、危险性也最大的一类试剂。比如易燃易爆类、剧毒类、强腐蚀、强氧化性等化学试剂领取后要存放在专用的危险性试剂柜里。所以，对这些化学试剂的使用也要特别注意，要做好针对性的安全防范措施，一定要避免使用不当对实验人员及实验设备造成人员和财物伤害。下面古朵生物来给大家简单说下化学试剂的试剂和保管一些注意事项，希望能给大家提供一些参考建议。一、化学试剂怎么领取1、对于化学试剂的领取，一定要有实验通知单，实验室管理员根据通知单备好需要的化学试剂。一般化学试剂，由相关管理员办理好登记手续，方可领取。危化品、贵金属等化学试剂，要以满足试验和教学为原则，由相关试验人员申请、经过相关管理员及分管领导的批准，才能领取。2、对于每次领取的化学试剂数量，相关实验室管理员要称量，及时记录在容器上的毛重标签上，以作记账凭证用，方便后期查看。3、在领取化学试剂或者药品时，首先要确认容器上标示名称是否为需要的试验用药品。尤其要注意药品危害标示和图样，是否为有危害。为了安全和试验的顺利进行，一定要查看药品报告单)和试剂、药品的安全数据单。4、领用易燃易爆、剧毒pin、强腐蚀、强氧化性等危险性试剂时必须提前申请和上报，做到用多少领多少，并一次配制成使用试剂。对剧毒pin发放要依据先入先出的原则，发放时要准确登记好试剂的计量、发放的时间以及相关经手人。凡是剧毒pin必须是双人领取，双人送还，否则剧毒pin仓库保管员有权不发放。二、化学试剂怎么保管1、化学试剂保管要根据性质来一般的试剂可以保存在普通玻璃瓶内；而对玻璃有强烈腐蚀作用的试剂，如氢-氟酸、氢氧化na要保存在聚乙-烯塑料瓶内；易被空气氧化、分化、潮解的试剂要密封保存；易感光分解的试剂应用有色玻璃瓶贮存并藏于暗处；易受热分解及低沸点溶剂，要存于冷处；剧毒试剂要存于保险箱；有放射性的试剂要存于铅罐中。2、做好化学试剂保养工作如果化学试剂保管不当，就会失效变质，不但会影响试验效果，还会造成物质浪费，甚至有可能会发生事故。因此，科学保管试剂对于保证试验顺利进行，获得可靠试验数据具有非常重要的意义。化学试剂的变质，大多数情况是因为受外界条件的影响，如空气中的氧气、二氧化碳、水蒸气、空气中的酸碱性物质以及环境温度、光照等，都能使化学试剂发生氧化、还原、潮解、析晶、稀释、锈蚀、分解、挥发、发霉、变色以及燃爆等变化。经常检查储存中化学试剂的存放状况，如发现试剂过了储存期或变质应及时报告，并按规定妥善处理，如降级使用或报废、销帐等。在正常储存条件下，一般化学试剂储存不宜超过2年，基准试剂不超1年。

实验过程：我们可以将所有实验过程归纳为下面8个过程1：抽样过程2：样品制备过程3：有证标准物质对测试系统的影响4：仪器的校准过程5：分析（数据采集）过程6：数据处理过程7：结果的表达8：结果的解释8个实验过程具体原因分析1抽样过程：－均匀性－具体的抽样策略的影响（例如，随机抽样、分层随机抽样、比例抽样等）－媒介移动的影响（尤其是密度选择）－媒介的物理状态（固体、液体、气体）－温度和压力影响－抽样过程是否影响组成？例如，在抽样系统中的差色吸附。2样品制备过程－均匀性和/或二级抽样的影响－干燥－碾磨－溶解－萃取－污染－衍生（化学或者物理的影响）－稀释误差－（预）浓缩－物种形成影响的控制3有证标准物质对测量系统的影响－有证标准物质的不确定度－有证标准物质是否与样品匹配4 仪器的校准过程－使用有证标准物质的仪器校准误差－标准物质及其不确定度－校准用的物质是否与样品匹配－仪器的精-密度5分析过程－自动分析仪的进位－操作者的影响，例如色盲、视差、其他系统误差－基体、试剂或其他被分析物的干扰－试剂的纯度－仪器参数的设置，例如积分参数－重复性实验的精-密度6数据处理过程－平均－修约的控制－统计－运算法则（模型拟合，例如线性蕞小二乘法）7结果的表达－蕞终结果－不确定度的估计－置信水平8结果解释－对照限值/范围－法规的符合性－目的的适用性

1、自行配制的标准溶液必须具备8个基本要求1.1应采用具有高纯度的溶质或基准物质(如金属、金属氧化物或金属化合物;酸、碱、金属有机化合物、适宜的盐类、有机溶剂等)。1.2为确保配制标准溶液的可靠性、准确性,实验室的设备、环境设施均应满足其要求,(应有监测、控制和记录环境条件。特别对灰尘、电磁干扰、放射、温度、湿度、供电等)。1.3具有符合称量要求器具、应有正确称量的电子分析天平,并通过周期性的检定,有质检部门检定的证书。1.4要有配制标准溶液的纯度高的溶剂(采用双重蒸馏去离子水、高纯浓度的酸、碱或有机溶液)。1.5配制所用的器皿用具,必须根据所测项目要求,分类对器皿进行洁净的处理,且符合特定洁净的要求,保证所配的标准溶液无污染,对检测不产生不良影响。1.6应采用洁净的优质硬玻璃容量瓶作最终体积的容器。1.7根据所配标准溶液对盛放容器的要求,必须选用适当质料的洁净器皿存放标准溶液,并按规定要求(如避光、通风、阴凉、冷藏等条件)放置配制好的标准溶液。1.8必须作好配制标准溶液的原始记录的登记,标准溶液标签填写完整(如标准溶液名称、浓度mg/ml或mol/ml,配制人,配制日期、有效期等),并将标签贴在试剂瓶上。2、金属标准溶液的配制和标定2.1水溶性金属标准溶液的配制直接用经酸清洗或打光的高纯金属丝、棒、片,或高纯金属氧化物,或优级纯的(光谱级、基准纯度的)金属盐类,溶解于高纯度的酸中,加双重蒸馏去离子水配制成酸性水溶金属标准溶液。2.2非水金属标准溶液将高纯或优级纯以上的金属有机化合物溶解于合适的高纯有机溶液中;(以C或C脂肪族酯或酮、C烷烃为佳)配制成非水金属标准溶液,或将金属离子转变为可萃络合物,用合适的高纯有机溶液萃取,有机相中的金属离子的含量通过它在测定水相中的含量,间接地加以标定。2.3标准贮备液配制成的标准溶液,贮备液浓度一般为1.00mg/1.0m1,或100μg/1.0ml,含酸量为10%。如,用高压聚乙烯瓶盛装并且密封好,常温下可保证2a,4℃冰箱中冷藏4a,其含量可保持基本不变。2.4标准工作液用贮备液稀释成工作液溶液的酸度为5%,选用适合存放溶液的酸度为5%的硬质玻璃瓶,常温下可保存2～3个月其含量不变。2.5标准工作液稀释成使用工作液溶液的酸度为1%酸度时,玻璃瓶装1周内不变;溶液的酸度为0.2%酸度,用玻璃瓶装的只能当天配当天使用,如用高压聚乙烯瓶盛装可保存1周,用四氟乙烯瓶装则保存的时间可为2个月左右。2.6酸化的金属标准液金属标准溶液用盐酸酸化至pH=2.0时,用聚乙烯容器瓶盛装,可保证金属元素不受损失其结果令人满意;贮备液浓度应于1.0mg/ml以上;硬质玻璃瓶和塑料瓶中元素的数值,其未经盐酸酸化的比经过盐酸酸化的损失要少;浓度3常用标准溶液(水溶液)的配制和标定3.1标准溶液的标定用优级纯以上的酸、碱或强溶解性的相应盐类等基准物质,用双重蒸馏去离子水溶解于容量瓶中,并定容至所需的贮备溶液,浓度为(mol/L),并按要求选取洁净容器盛装,贴好标签,按规范要求贮存。3.2标定物质应选用基准物质的纯试剂作为标定物质,标定前应干燥至恒重,并准确称取。3.3标定过程标准溶液在标定过程中,严格执行2人双平行标定,用精确的标定物,对标准溶液进行标定、计算,在误差很小,数据又相当接近的情况下,则取平均值为该标准溶液的浓度。3.4标定时间常温下1.000mol/L及以上浓度贮备液,应每2a标定1次;0.5000mol/L浓度贮备液,应每1a标定1次;0.1000mol/L浓度贮备液,应每6个月标定1次;低于0.1000mol/L浓度的应用液,应每3个月标定1次。注意事项：自配制的标准溶液作为工作标准溶液的,一般用于日常检验分析,不用于其他具有法律效应的检测结果。除非能够证明其作为测量参考标准的性质不会失效。有机溶液的标准物质在贮存过程中,应避免标准溶液与塑料胶木瓶盖直接接触。对使用量较大的自配的标准贮备原液,必要时与有证的、并在有效期内的标准物质进行比对,避免发生化学变化,以确保自配标准溶液量值的准确性。

 一些小伙伴在日常使用微生物培养基的时候，难免会遇到过期或使用过废弃的时候，因为是做微生物细菌检测的，所以要处理这些没用的生物试剂就成了问题。很多人会想：是否可作为垃圾扔掉？挖个坑深埋？因为其中含有营养成分，是否可以浇花？是不是要交给专业污水处理的公司来解决？为保险起见，要不要自己再次灭菌处理？国家有没有相关的规定？……所以，作为使用者和医疗器械和生物培养基试剂的经销商遇到这样的问题，总会摸不着头脑？下面，小编来说一下这个问题。培养基在使用前通过高压或过滤灭菌。防止污染应该注意以下事项：确认工作细胞库是否被污染，确认毒种工作种子批是否被污染，确认所用培养基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染，均可用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。实际生产中，可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱内培养，48小时即可观察有无污染。高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证，确保灭菌和除菌效果;前者应在投产前及其后的每6个月进行验证，后者应在每次除菌前、后进行验证工作(至少应在除菌后进行一次)。应将有毒区与无-毒区严格分开，并有各自独-立的空气净化系统及孵室，有毒区对无-毒区应保持相对负压，防止病毒对培养细胞(尤其是细胞库)的污染。对于微生物实验室废弃物的控制：染菌培养物及菌悬液在丢弃前应在阳性室内完成销毁工作，合适的方法是121℃、30分钟高压蒸汽灭菌处理。接种环在使用后立即在火焰上烧灼处理。接触菌液的塑料吸嘴使用后应立即泡入中效消毒剂溶液内，40分钟以上。未长菌的培养基或过期的培养基在丢弃前应进行去营养处理，可以选用121℃、30分钟高压蒸汽灭菌。那么，过期的培养基是否还能用呢？（干粉培养基储存）如果过期了，培养基里的化学成分就会发生变化，可能会产生毒素等不利于细胞生长的物质,而且过期培养基一般都会染菌，细胞培养对无菌条件要求比较苛刻，建议不要用过期的培养基，现用现配比较好。 当然，粉末培养基和生化鉴定管虽然过期，如果用相应的标准菌株验证后符合特征性要求的，可以尝试测试，不过要做阳性对照。一次性的平板培养基保质期本来就短，如果通过验证合格的就要尽快使用，不然只能作废处理。保质期，先了解一下，对每月的用量做个预评，按量采购，因为过期也是一种浪费。zui后，组织培养基自生产分装后即在瓶签上标明批号、出厂年月及有效期(或失效期)、一般有效期为一年。但一年过后培养基(如无受潮变质、液体无混浊沉淀)还不致于立即失效，不过效价可能开始降低，遇有这种情况不要随便把培养基弃掉。我们目前用已过期2年多的164。培养基在适当增加其用量(由1.05克/100毫升增到1.2克/100毫升)的情况下作培养，仍能获得满意的分裂相。可见1640培养基的实际有效期并不限于一年。

1、应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之蕞hao方法。2、 如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？直接灭菌后丢弃之。3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。4、支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

支原体又称霉形体，是很小的原核细胞，完全没有细胞壁．菌体形态多变，具高度多形性，球形、梨形、分枝的或螺旋的丝状等。营养要求苛刻，在高血清量的复杂培养基上生长，在固体培养基上菌落呈油煎荷包蛋样特征性外观。培养基：牛心汤复合培养基等。分离培养：无菌采取肺、肝、脾、肾组织，直接剪成小块放在固体培养基上划一直线，再用无菌铂耳环在与其垂直方向划线，或者将组织块剪碎磨成匀桨，经液体培养基连续系列稀释后培养．若当液体材料为牛乳、排泄物、胎液等，可直接取0.2ML接种于液体培养基或取0.1ML接种于固体培养基。固体琼脂平板置37摄氏度潮湿需氧条件或在５％二氧化碳下培养48-96h,用斜射光或放大25-40倍的立体显微镜检查,若有特异菌落出现,应选取散在的单个菌落用无菌解剖刀切下小琼脂块,用巴氏吸管小心地将菌落和周围琼脂吸入,再将其移入盛有2-3ML的液体肉汤培养管培养48h,将其培养物通过0.45微升孔径大小的滤膜过滤后作1:10和1:100稀释,每一个稀释液取0.05ML涂布于几个琼脂平板,即可得到纯的支原体培养物。牛心汤复合培养基：牛心汤1000ml蛋白胨10g氯化钠5ml酵母提取液10ml无菌马血清200ml青霉素200IU/ml实验之MP肺炎支原体培养实验方法：一、标本采集支原体常侵及人和动物的粘膜表面，一般可用棉花拭子涂抹取样后放入2~3ml支原体液体培养基的小管中，或取其分泌液，若标本是组织块，可在灭菌乳钵或玻璃匀浆后接种，取样后应尽快接种培养。二、分离培养1、支原体固体培养基接种法转动拭子将标本液体尽量挤出，用无菌滴管吸1~2滴接种在平皿上盖好，用L棒涂抹或倾斜转动平皿使标本均匀分布，置37℃孵育。2、支原体半固体培养基接种法混种法：在制备半固体培养基时，培养基加热溶化，温度降至50℃时，添加动物血清、酵母浸液及青霉素后混匀，待冷却至37~40℃时，用无菌滴管吸取标本0.5~1ml加入培养基中，充分混匀，凝固后置37℃孵育。3、穿刺接种法：方法同细菌接种法。三、结果观察绝大多数支原体为兼性厌氧，少数在含10%CO2和相对湿度80~90%的大气环境中生长良好。支原体生长缓慢，多数于3~4d长出菌落，少数于1~2w方长出典型菌落，在平皿固体培养基上生长的菌落呈"油煎蛋"状，边缘不整齐。四、附录糖酵解培养基（肺炎支原体培养基）基础培养基70ml马（或牛血清）20ml25%酵母浸液10ml0.4%酚红0.5ml青霉素10000IU/ml5.0ml调pH7.8肺炎支原体培养很简单的，特别是液体培养，不需要防护！配方上面的有点复杂而模糊，简单：PPLO21g（商品化买）酵母粉6g马血清200ml（没有的话用小牛血清代替）L－半胱氨酸0.3g葡萄糖10g1%酚红4mlAMP若干（0.1－0.2g，多加点不影响）有时还加SMZ和TMP！ph要调的，大概在7.5－7.6之间吧！酚红可以高压的！

一、 细胞核的形态、大小和位置1.形态： 核的形态一般为圆球形或椭圆形，但也有其他形状，如粒性白细胞的核为多叶形，蚕的丝腺细胞核为分枝形。2.位置： 正在生长的细胞中，核位于细胞中央，在分化成熟的细胞中（如，有大液泡的植物细胞），常因细胞内含物或特殊结构的存在，核被挤到边缘。3.大小： 细胞核的大小在不同生物细胞中是有差异的，高等动物细胞核的直径一般为5～10 μ m，高等植物细胞核的直径一般为5～20 μ m，低等植物细胞核的直径一般为1～4 μ m。细胞衰老时细胞核体积增大 。二、细胞核的数量（一）哪些细胞没有细胞核原核细胞就不用讲了，这里讨论的是真核细胞。1.哺乳动物成熟红细胞， 红细胞 的主要功能是运输O2，同时也运输部分二氧化碳。（参考：二氧化碳的运输是不是你想象的那样）哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。红细胞里特有的血红蛋白在氧气含量高的地方容易与氧结合，在氧含量低的地方容易与氧分离，血红蛋白的种特性使红细胞具有运输氧气的功能。血液中的红细胞数量过少，或者血红蛋白含量过少，叫做贫血。2.高等植物成熟的筛管细胞，运输有机物。3.血小板 ，形状不规则，比红细胞和白细胞小得多，无细胞核。血小板的主要功能是凝血和止血。 第一章第一节：从生物圈到细胞4.皮肤表皮的角质层、透明层、颗粒层细胞 也都没有细胞核。认识皮肤：皮肤的组织结构以及皮肤的附属器失去核的细胞存活时间通常是不长久的。（二）一个细胞只有一个核吗？一般来说，大多数细胞是单核的，但也有些细胞具有多个核。肝细胞和心肌细胞可有双核。人的骨胳肌中的细胞核可达数百个。三、细胞核的功能细胞核是遗传信息库，是细胞代谢和遗传的控制中心。注意：细胞核是细胞代谢的控制中心，细胞代谢的中心在细胞质。四、细胞核的结构细胞核主要由核膜、染色质、核仁及核基质组成。1.核膜（双层膜，把核内物质与细胞质分开，核膜上有核孔）核被膜上分布有许多孔，它们选择性地将有关分子在胞核与胞质之间进行转运。在双层核膜中，面向胞质的一层膜为外膜，其表面附有大量的核糖体颗粒，有些部位与内质网相连，核周隙与内质网腔相通，由此可将核外膜看做内质网膜的一个特化区域。内膜面向核质，其表面光滑没有核糖体颗粒。核的内外膜在一些位点上融合形成环状开口，称为核孔。2.染色质 （ 主要由 DNA和蛋白质组成， DNA是遗传信息的载体。）细胞核中有DNA , DNA和蛋白质紧密结合成染色质。染色质是极细的丝状物，因容易被碱性染料染成深色而得名。染色质和染色体是同样的物质在细胞不同时期的两种存在状态。染色质主要由 DNA和蛋白质组成，另外也有少量的RNA。（染色质由 DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成。）3.核仁 （ 与某种 RNA 的合成以及核糖体 的形成有关）这里的某种RNA指的就是rRNA（由位于核仁的DNA，即核糖体DNA（rDNA）指导合成）。 核仁的功能主要是rRNA的合成、加工与成熟以及核糖体亚单位的组装。一般蛋白质合成旺盛和分裂增殖较快的细胞有较大和数目较多的核仁，反之核仁很小。 核仁在分裂前期消失，分裂末期又重新出现。分泌蛋白质的腺细胞、肿瘤细胞、胚胎干细胞、卵母细胞核仁大。4.核孔（实现核质之间频繁的物质交换和信息交流）实现核质之间频繁的物质交换的信息交流。一方面核蛋白在细胞质中合成后通过核孔定向输入细胞核，另一方面细胞核中合成的各类RNA、核糖体亚单位需要通过核孔运到细胞质。小分子物质能够以自由扩散的方式通过核孔进入细胞核。细胞核活动旺盛的细胞中核孔数目较多，反之较少。核孔是沟通核质与胞质物质交流的渠道，可以选择性地转运核内外的物质，因而对细胞的活动起重要的调控作用。核孔的直径为80～120 nm，每个核孔不是一个简单的通道，它包含有一个复杂而精细的结构体系，即核孔复合体。大量的研究结果表明，所有真核细胞的核膜上都普遍有核孔复合体，但随着细胞类型的不同和细胞生长阶段的不同，其核孔数目有较大的差异。核孔是由许多蛋白构成的复杂结构，对进出核孔的物质具有严格的调控作用。目前认为核孔复合体由100多种蛋白质组成。五、细胞是一个有机的统一整体细胞作为基本的生命系统，其结构复杂而精巧；各组分之间分工合作成为一个整体，使生命活动能够在变化的环境中自我调控、高度有序地进行。这是几十亿年进化的产物。细胞既是生物体结构的基本单位，也是生物体代谢和遗传的基本单位。

一、自噬体介绍自噬（Autophagy），或称自体吞噬，是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制而被分解的过程，该过程是一个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持一个平衡状态。细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为“自噬体（autophagosome）”。自噬体形成后，可与溶酶体融合，自噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。自噬信号通路：  二、自噬研究策略和方法正常细胞基础水平自噬活性比较低，对自噬研究通常需要进行人工调节和干预，常用药物有：1、自噬诱导剂a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激；b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）；c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿；d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂；e) Rapamycin：mTOR抑制剂；f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂。2、自噬抑制剂a) 自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）：(Class III PI3K) hVps34 抑制剂；b) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂；c) 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine（羟氯喹）。3、自噬检测1) 透射电镜；电镜作为自噬检测的金指标。由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下观察不到自噬体的形成，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。2) WB检测标志物LC3/Atg8、p62/SQSTM1、Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1；a）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。b）利用Western Blot检测p62蛋白来评价自噬以及自噬流的强弱：p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系。3) 组织蛋白酶Cathepsin活力检测；4) IF检测自噬潮autophagic flux。三、自噬研究常规思路通常情况下，除了研究自噬现象本身，大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来，把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激，如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等，通常的研究模式：1）证明自噬参与了相关研究表型（电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等）2）证明自噬在表型中起到关键作用（通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究）3）找到表型与自噬桥梁分子（检测pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成员）4）在基因层面通过gain of/lost of function研究桥梁分子在自噬中的作用。远慕生物可以为客户提供从自噬领域的课题设计到实验操作包括后续实验结果的整理等服务。四、自噬相关研究领域1）自噬起始和终止的分子机制2）细胞自噬与肿瘤3）细胞自噬与免疫4）自噬参与炎症信号通路的调节5）细胞自噬与神经退行性疾病6）激活自噬促进免疫化疗和放疗7）表观遗传学与细胞自噬的关系8）药物治疗自噬

重组蛋白表达技术可以用来分析基因调控以及研究蛋白质结构和功能。无论是体内功能研究还是用于结构研究的大规模生产，以及生物治疗领域的药物开发都需要用到蛋白表达技术。1、蛋白质通用合成路径dna —>mrna—> 蛋白实际操作流程为：1. 克隆或合成目的基因2. 载体构建3. 蛋白表达与纯化4. 蛋白的大量表达与纯化（或无）2、克隆或合成目的基因典型的表达载体包括至少4个主要元件：目的基因表达框（包括启动子和基因终止或 poly (a) 信号）细菌的复制起始点（ori）特定宿主的抗生素选择框（如潮霉素 b、霉酚酸、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素 s 等）大肠杆菌的抗生素选择框（如氨苄青霉素、杀稻瘟菌素 s、羧苄青霉素、zeocin 选择性抗生素抗性等）其他元件还包括：多克隆位点（mcs）（即多酶切接头）表位标签分泌信号蛋白酶识别位点内部核糖体插入位点（ires）3、不同蛋白表达系统选择 蛋白表达是许多小伙伴的实验课题中的主要内容。由于涉及不同的研究领域，表达载体多种多样，每个人要表达的蛋白特性更是千差万别，特别是一些小伙伴是第一次做课题，关于怎样表达蛋白，怎样安排实验步骤更是一头雾水。这里按照不同表达载体，列举最常用的重组蛋白表达方案。对每一种蛋白表达案例从实验步骤、大只需用时间以及每个步骤需要完成的目标进行比较，大家可以对照自己的实验内容，希望能有所帮助。4、常用的蛋白表达（含细胞株的制备）：cho 稳定细胞株开发hek293 稳定细胞株开发原核蛋白表达哺乳动物细胞瞬时表达酵母蛋白表达杆状病毒与昆虫细胞蛋白表达5、重组蛋白技术方案1. cho 稳定细胞株开发 2. hek293 稳定细胞株开发 3. 原核蛋白表达流程 4. 哺乳动物细胞瞬时表达流程 5. 酵母蛋白表达流程 6. 杆状病毒 - 昆虫细胞蛋白表达流程 6、不同蛋白表达之比较以上实验方案的完成时间是较为成熟的实验室的工作流程用时，小伙伴可以根据自己的实验安排灵活掌握。完成目标也应该根据自己的课题要求进行适当增减。

核酸检测技术有诸多优点，但由于其超高的灵敏度，一旦实验室出现核酸污染，很容易导致假阳性结果，从而影响检测的准确性。样本处理环节抽提核酸和检测环节扩增产物泄露均会导致核酸污染，飞溅的扩增产物会形成气溶胶漂浮在空气中，粘附到物体表面及检测人员身体 上，随着人员及物料流动而污染整个实验室。实验室一旦发生核酸污染极难清除，会造成实验室短期内无法开展工作，因此防范和清除核酸污染是分子检测实验室的工作重点。目前的核酸检测均采用闭管检测以防止开盖形成气溶胶，同时采取严格的物理隔绝法，检测依次分为试剂准备区-样本准备区-扩增区-产物检测区，且逐级压，这些策略都最da程度地防止了气溶胶污染，但核酸污染事故依然时有发生。由于核酸检测步骤较多，且多个环节样本直接暴露于空气中，任何一个环节出现一点小纰漏就容易导致整个实验室的污染。即使严格按照规程操作，核酸污染依然无法彻底避免。核酸污染主要体现在样本核酸或扩增产物在台面、设备、检测人员表面的核酸残留，以及扩增产物形成的气溶胶。气溶胶由于颗粒较小，若不做处理可长期漂浮在空气中持续影响实验室的检测。核酸实验室污染的主要原因有：①标本污染； ②试剂污染；③ 产物污染；④ 设备污染；⑤ 其他污染。其解决措施 为：①标本污染：重新采样进行检测，评估标本前处理环节；②试剂污染：更换新的试剂重新检测评估；③设备污染：设备整体消毒清洁、维护；④产物污染：全面清洁消毒实验室、仪器设备所有实验有关用品。发现污染，检测工作应立即停止，直到确认消除污染后才能重新开始检测。首先，要查找污染源和明确污染范围。然后，根据污染源和污染范围采取有效的去污染措施，结合各种不同方法以达到最佳效果。实验室污染的处理：1.标本污染生物安全柜的操作台造成局限污染时：立即用吸水纸覆盖，并使用0.55%含氯消毒剂进行喷洒消毒。消毒液需要现用现配，24小时内使用。2.标本倾覆造成实验室污染时：保持实验室空间密闭，避免污染物扩散。立即使用润湿有0.55%含氯消毒剂的毛巾覆盖污染区。必要时（如大量溢撒时）可用过氧化氢加热熏蒸实验室，剂量为2g/m?，熏蒸过夜；或20g/L过氧/乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾，用量8ml/m?，作用1-2小时；3.清理污染物时：严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。

一、无菌操作要求1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。3.接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。二、无菌间使用要求1、无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7平方米的小窗，以备进入无菌间后传递物品。2、无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。3、无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，也可以用雾化过氧化氢设备，法国欧菲姆设备实用，便捷。4、处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。5、在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法1、灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。2、装放（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。（2）大型高压蒸气锅：：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。3、设备检查（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：①手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）。②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。③盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。④关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。⑤达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。（3）卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：①关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。②夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。③待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至④自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。⑤使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。4、灭菌温度与时间（1）干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。（2）压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间（二）间歇灭菌方法1、灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。（1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。（2）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。（3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。2、血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。（1）在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。（2）将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。3、煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15min，也可在水中加入2%石-炭酸煮沸5min，加入0.02%甲醛，80℃煮60min均可达到灭菌目的，但选用煮沸消毒的增消剂时，应注意对物品的腐蚀性。4、灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度污染。（1）物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。（2）取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。（3）培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。（4）启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭。（5）取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。（6）取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。（7）凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。（8）每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。四、有毒有菌污物处理要求微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。1、经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在zhi定地点，待统一进行高压灭菌。2、经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石-炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30min高压灭菌。4、涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。5、打碎的培养物，立即用5%煤酚皂溶液或石-炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、kou罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。五、培养基制备要求培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：1、根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。2、PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。3、培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。4、盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。5、培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。6、每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。7、目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。8、每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。六、样品采集及处理要求1、所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。2、根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。3、采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消du药物灭菌，更不能含有此类消du药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。4、样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。5、检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。（1）样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。（2）瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎完整者，即失去原食品形状者（食物中毒样品除外）。（3）按规定采样数量不足者。对送检符合要求的样品，检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。6、样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。（1）液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。（2）固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。（3）瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。七、记录和报告的要求1、检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。2、样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

　对照品（标准品）是执行药品质量标准的实物对照，是量值传递的重要载体，是用来检查药品质量的一种特殊的专用量具、测量药品质量的基准、确定药品真伪优劣的物质对照，也是作为校正测试仪器与方法的物质标准。对国家药品标准而言，它是国家颁发的一种药品计量、定性的标准物质。药品标准物质必须具备材料均匀、性能稳定、量值准确等条件，才能发挥其统一量值的作用。在药物研发当中，对照品（标准品）涉及量值溯源、产品定性、杂质控制等重要环节，其制备和标定情况与药品的质量研究、稳定性研究乃至药理毒理学研究中剂量的确定等临床前基础研究间存在密切关系，因此，药品对照品（标准品）的制备与标定是药品技术审评的一项重要内容。一般来讲，药品研发中标准物质的使用一般可参照如下原则：　　1、所用对照品（标准品）中检院已有发放提供（可参阅中国药典2010年版二部附录ⅩⅤ　G），且使用方法相同时，应使用中检院提供的现行批号对照品（标准品），并提供其标签和使用说明书，说明其批号，不应使用其他来源的标准物质；使用方法与说明书使用方法不同时，如定性对照品用作定量用、效价测定用标准品用作理化测定法定量、UV法或容量法对照品用作色谱法定量等，应采用适当并经验证的方法重新标定，并提供标定方法和数据；若色谱法含量测定用对照品用作UV法或容量法，定量用对照品用作定性等，则可直接应用，不必重新标定。　　2. 中检院尚无对照品（标准品）供应时，可使用如下标准物质进行标准制订和其他前期基础性研究工作：　　（1）国外药品管理当局或药典委员会发放的对照品（标准品）或国外制药企业的工作对照品（标准品），但应提供其包装标签的彩色照片及使用说明的复印件，说明批号、有效期、使用方法等信息，能保证其量值溯源性；　　（2）申请人自行标定或委托省所完成对照品（标准品）的标定，申报时提供标准物质的研究资料及相关信息，一般包括如下内容：　　①主成分对照品--制备工艺、结构及含量方面的研究资料以及通用名、化学名、结构式、分子式、分子量、各种杂质含量（水分、残留溶剂、无机盐等）、主成分含量测定数据（不同分析技术）、用途、贮藏条件等信息。　　②杂质对照品--制备工艺、结构（UV，IR，NMR，MS，X射线衍射的解析或提供对照图谱）及含量（不同分析技术）方面的研究资料以及化学名称、结构式、分子式、分子量、用途、贮藏条件等信息。　　③混合对照品（定位）--各组分制备工艺、结构（UV，IR，NMR，MS，X射线衍射的解析或提供对照图谱）及纯度方面的研究资料以及化学名称、结构式、分子式、分子量、含量（如必要）、定性具体方法与限度要求。　　同时，申请人应及时与中检院接洽对照品（标准品）的标定事宜，以便产品上市后可以及时获得法定标准物质。　　3、质量标准中用到的对照品如中检院在目前情况下尚不能正常提供，建议申请人在申报资料中明确产品上市后，标准物质的可获得性及相应措施。　　4、质量标准中涉及到的各已知杂质，应在质量标准中明确其通用名称（或化学名称）、化学结构式、分子式、分子量等相关信息，以准确指称、控制各特定已知杂质。　　5、一般情况下，为确保标准物质的准确使用和控制，尚需提供对照品（标准品）的质量标准，并规定专属性控制项目，如非对映异构体杂质的比旋度等。

亲和素一生物素复合物法（ABC法）(1）冰冻切片用0.0lmol/L PBST（或PBS）漂洗或冲洗3次，每次5min。(2) 3 % H2O2孵育l0min（耗竭内源性过氧化氢酶），再用0. 0l mol/L PBS冲洗3次，每次5min,(3) 5％-8％的正常动物血清（山羊或马血清）孵育30-60min,封闭组织片的非特异性结合。(4）洗掉血清，滴加合适浓度的一抗，如1 :500 (0. 01 mol/L PBS配制），4℃过夜。(5) 吸出一抗，0. 0 1 mol/L PBS冲洗3次，每次5min，加入同一源性的二抗（0. 0l mol/L PBS配制），室温2h（最好在摇床上进行）。(6）吸出二抗，0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次5min，加入三抗(0. 0lmol/L PBS配制），室温2h（在摇床上进行）。(7) DAB显色。显色结束后，0. 1 mol/L PB洗2次，每次5min,终止显色。(8) 切片（漂染还需要裱片）脱水、透明：70%、80%、90%、100％酒精各5min，二甲苯（1)、 (2）各10min，中性树胶封片。典型的实验结果见图20. 2A。注意事项：(1) 准备：免疫组织化学要求实验器具绝对无污染，因此，所使用的玻璃器皿、载玻片、盖玻片均需在浓酸中处理至少24小时，取出后自来水冲洗干净，用蒸馏水浸泡，再取出晾干备用。实验中尽量避免交叉使用吸管和移液器枪头等。(2) 切片注意事项：切片开始前，要先将组织冷冻，可置入液氮中停留数秒钟（用锡纸包裹）迅速冷冻。使用冷冻式切片机前，刀片及接触冰冻切片的物体需要预冷。如使用一次性刀片需及时更换，非一次性刀片要注意保养，微小的缺口也可能造成组织切片出现划痕，影响实验结果。(3）根据蛋白所在的位置，选用PBST或PBS，如果蛋白在细胞膜上，则不推荐加入Triton X-100；如果是核内的蛋白，可适当增加Triton X-100的浓度。(4) H2O2的作用是用来耗竭内源性的过氧化物酶，组织内的过氧化物酶可催化显色的底物，从而造成假阳性或增加背景。如果组织冲洗不够充分或染色背景较高，可适当延长其孵育的时间或提高H2O2的浓度。(5）封闭用的血清应与产生二抗的动物同源，从而达到消除非特异性染色的目的。(6) 一抗的选择至关重要，多克隆和单克隆抗体各有优点，抗体的选用应根据具体的目的，详细阅读抗体的说明书，并寻找可能的文献作参考。一抗的浓度及时间，要在预实验时进行梯度的筛选，以推荐浓度作为中间浓度，上下调整一抗的浓度。理想的染色结果应是无背景而只有抗原显色。二抗的浓度也应进行适当的摸索。抗体的保存和使用，应参照说明书。(7) DAB一定要现用现配，尽量避光保存。显色的时间应在镜下控制。(8) 免疫组化的对照实验必不可少，对照可分为阴性对照和阳性对照，阴性对照指用缓冲液代替一抗，而其他步骤不变。阳性对照一般用常见的蛋白如细胞骨架蛋白（actin)或者用不同的组织（如说明书上所用的）进行同一抗体的染色。

免疫荧光染色：(1）冰冻切片用0. 01 moUL PBST（或PBS）漂洗或冲洗3次，每次5min。(2) 3% H2O2孵育10min，再用0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min。(3) 5％一8％的正常动物血清（山羊或马血清）孵育30-60min。(4）洗掉血清，滴加一抗（0. 01 mol/L PBS配制），4℃过夜。(5）吸出一抗，0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min，加入荧光标记的二抗（0. 01 mol/L PBS配制），4℃过夜。(6）吸出二抗，0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次 10min。(7）封片剂封片，荧光显微镜观察照相。注意事项：(1) 由于荧光容易淬灭，一般仅能维持几个小时，因此，荧光二抗应避光保存，即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。封片后应尽早照相，目前有市售的荧光增强剂，可使荧光在4℃保存1-2周仍不淬灭。(2) 常用的荧光素有以下几种，绿色荧光：FITC、 Alexa Fluor 488和GFP；红色荧光：TRITC、Cy3、Alexa Fluor 568&594和MitoTrackerRed；蓝色荧光：Hoechst、DAPI；黄色荧光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。(3）不同的荧光素激发的波长不同，因此，选用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm，蓝光的激发波长为435-490nm，绿光的激发波长为546nm左右。(4) 荧光显微镜应提前至少15 min打开汞灯预热。关闭30min后方可再开启。(5）免疫荧光的组织要求很高，载玻片及盖玻片要干净无杂质。进行荧光染色时，需注意染液的pH、浓度和染色温度，还要避免对荧光有熄灭作用的物质的接触。组织和细胞也有自发荧光，如红细胞中的血红蛋白呈红色荧光，维生素A呈绿色自发性荧光等。

当您选择抗体时，一些有用的建议如下:通过查阅文献，查找使用过类似抗体的实验室进行咨询；询问其他实验室成员是否已经用过了适合您实验的抗体；检查抗体的克隆性、应用适应性、宿主物种和种属反应性等各种数据。查看供应商提供的图片和数据——数据是否可信、实验结果优劣鉴定？参考引用该抗体的任何论文和论文中数据的表现选择适合自己的抗体。一抗选择01 确认研究用途研究主题是什么？抗体的克隆性质？02 抗体的种属？样本的种属来源需要和抗体的种属来源不同。像western blot这样的实验应用，样本是没有内源性免疫球蛋白(IgG)的细胞裂解液，或者使用直标一抗的实验应用，都不用担心这个问题。如果不得不需要使用和样本种属来源相同的抗体 (如鼠抗鼠的抗体)，建议进行抗体定制服务。03 非模式生物如果研究对象为非模式生物，并且不得不要用一种在该物种中没有被测试过的抗体。当然很可能无法得到理想的结果，但是大部分的保守序列蛋白质是可以被一个未经验证的抗体识别的。因此，如果没有很好地选择，一般建议选择对目标生物的该蛋白进行序列比对，并且得出该蛋白序列是否足够保守的结果。（Swiss-Prot蛋白数据库链接中可以找到所需的序列，还有一些网站提供计算相似度的工具，例如多序列比对工具CLUSTALW.）将抗体的免疫原序列与您想检测的物种的蛋白序列进行比对，如果重合比对结果重复度大于85%，那么两者可能会发生交叉反应效应（即使是比对得分大于85%，也无法完全保证抗体一定会识别）需要使用多个对照来确定该抗体是按您预期与靶标特异地结合。关于二抗选取的几个建议：选择蕞亮的荧光素来标记表达量蕞低的蛋白质当您使用多色标记时，所有二抗应该保持物种来源一致如果您在实验前用来自和二抗同一宿主物种的血清来封闭样本，这将显着降低背景预吸附二抗 对于多色分析很有用，可确保较低的物种间交叉反应性片段抗体 更小且可高效得渗入组织（对IHC很有用）生物素偶联物可检测低丰度蛋白

细胞培养这个生物学研究蕞基础的技术之一，已经渗透进了科研工作的方方面面。本文将与大家分享细胞培养经验的总结，涵盖了昆虫细胞蛋白表达常用到的sf9细胞与哺乳动物细胞蛋白表达系统的CHO细胞与HEK293细胞，主要介绍了细胞复苏、细胞传代、细胞冻存的具体操作方法。细胞复苏：1、细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。（3）提前做好复苏准备，预热培养基。（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数： （5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8 ml时间大概1分30秒，1 ml大概1 min左右，需计时，期间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。（6） 贴壁细胞需离心， 1000 rpm，5 min；悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入到T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。细胞传代培养1． 悬浮细胞传代流程：（1） 先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台；（2） 打开摇瓶瓶盖，用200 ul移液器取100~200 ul细胞放入1.5 mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床；（3）将200 ul细胞混匀，取10 ul细胞加入10 ul台盼蓝，显微镜下计数。根据细胞数决定下游实验；（4）细胞需计数两次求平均值；（5）悬浮细胞生长参数 （6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代；以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4 x10^6个/ml,24 h密度1x10^6个/ml,48 h密度2.4x10^6个/ml,72 h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞；要求留样100 ml0.4 x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入到摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2. 贴壁细胞传代流程：（1） 显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代；（2） T25方瓶中加入0.5 ml~1 ml 0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。放入37度培养箱进行消化；（3） 不同细胞消化时间不一样，初次培养贴壁细胞消化时间可以定在1min,显微镜下观察消化结果，消化不完全可以再适度加长消化时间；（4）对于有经验的细胞消化可以定个准确的时间，消化结束后将培养皿放入显微镜下观察细胞，随着时间变长，原先贴壁细胞逐渐变圆，慢慢脱落，在还未飘起时弃掉胰酶，加入含有10%FBS的新鲜培养基终止消化；（5） 用1 ml移液器轻轻吹打细胞，将细胞全部吹下后，可进行传代，一般是1：3传代；（6） 贴壁不牢的细胞可以用0.1%的凝胶包被4℃ 30min,用PBS清洗5次。细胞冻存1、细胞冻存参数2、贴壁细胞冻存流程：（1）将胰酶、培养基提前37度预热；冻存液提前配好放到4度冰箱预冷；（2）先将装有细胞的方瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台；（3） 打开方瓶瓶盖，将方瓶中的培养基倒干净；（4） 根据细胞消化难易程度添加适量的胰酶；T25方瓶加1 ml胰酶,T75方瓶加2ml胰酶；（5） 根据细胞消化难易程度放入37度培养箱消化1-5 min，知道看见大片的细胞开始脱落，要及时终止消化；（6） 终止培养基需要含有至少10%血清，通常终止比例为1:10（1ml胰酶需要加入10 ml终止培养基），对胰酶比较敏感的细胞需要终止后离心后换新鲜的培养基；（7） 终止后将细胞轻轻吹打混匀，避免结团，细胞收集到15 ml或者50 ml离心管中，将离心管配平，放入离心机中1000 rmp5分钟；（8） 将离心管从离心机中取出，用酒精喷洒后拿进超净台；（9） 弃掉离心管中上清，加入预冷的冻存液，吹打混匀；（10） 将混匀的细胞加入冻存管中；（11）将冻存管放入冻存盒中，蕞后放入-80°冰箱；（12） 第二天把细胞转移至液氮；3、悬浮细胞冻存流程：（1） 先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台；（2） 打开摇瓶瓶盖，取适量细胞放入50 ml离心管或15 ml离心管中；（3） 将离心管配平，放入离心机中1000 rmp5分钟；（4） 将离心管从离心机中取出，用酒精喷洒后拿进超净台；（5） 弃掉离心管中上清，加入提前预冷的冻存液，吹打混匀；（6） 将混匀的细胞加入冻存管中；（7） 将冻存管放入冻存盒中，蕞后放入-80°冰箱；（8） 第二天把细胞转移至液氮；

　　很多客户在订购我司试剂盒的时候，不知道取样到底是血清检测好还是血浆检测好，今天远慕生物就为大家答疑解惑！　　血清和血浆有以下三点区别：　　1、 血清中没有纤维蛋白原　　2、 血清中无参与凝血中的血浆蛋白　　3、血浆无一些凝血过程中血小板释放的物质。　　在药代研究中两者各有优缺点：　　1、血浆中含有抗凝物质（肝素或EDTA），可能会干扰化合物的检测（结合等），血清则无　　2、血浆中蛋白稍多，可能会在SPE中产生诸如堵柱子等情况，干扰样本制备过程（这一点其实差别不明显）　　3、血浆制备快速，直接低温或常温离心后即可分离，血清制备耗时较长。这一点对药代试验影响较大，因为给药后4小时内一般取血点都较为密集　　4、血清的凝血过程可能会因为与药产生吸附作用，从而减少血清的含量，并且有可能造成不平行。　　血清血浆的收集方法：　　1. 血清：　　室温血液自然凝固 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保 存过程中如有沉淀形成，应再次离心。　　2. 血浆：　　应根据标本的要求选择 EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分 钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。　　综上，我们在判定指标检测可以选择适用血清或者血浆，比如，检测凝血功能一般选择血浆，免疫类指标适用于血清。对于其他类型指标包含细胞因子的变化，都可以选择。血清和血浆都有各自的优点和缺点。

　　血清血浆和全血的差别，色调不一样，全血是鲜红色的，血细胞是浅黄色全透明液体。比例不一样，全血比例高，血细胞比例低。血细胞与全血带有的成份不一样，全血中带有血细胞，白细胞计数和血小板，还带有各种各样凝血因子。而血细胞中没有各种各样红细胞，没有各种各样凝血因子，其他成份血细胞和全血是同样的。　　全血是将身体血液收集到取血袋内所产生的化合物，包括红细胞和血液的全部成份。　　血细胞就是指血液凝结之后，在血液中去除纤维蛋白原及一些凝血因子之后分离出来出的浅黄色全透明液体，或是就是指纤维蛋白原早已被除去的血液，它的关键功效是出示基本的营养元素，出示生长激素及其各种各样细胞生长因子，融合蛋白质，对塑造中的体细胞具有一些维护功效，还可以说血细胞包括有多种多样物质。　　血细胞是全血的一部分，全血中包括有血细胞，它是他们最压根的差别，此外他们在临床医学上的主要用途也不一样。　　血浆和血清中间的差别　　血细胞　　在凝血功能后外渗的淡黄色全透明液体，血液快速凝结产生的胶凝状固态，其周边显示信息的浅黄色液体称之为血细胞。在血液凝结全过程中，纤维蛋白原被转换为游离脂肪酸块，因而血细胞中没有纤维蛋白原，这与血液有挺大差别。在血液凝结反映中，很多物质从血小板中释放出，而且每一个凝血因子也产生变化。　　这种成份留到血细胞中并再次转变，比如凝血酶原变成凝血酶，并伴随着血细胞存储时间慢慢消退或消退，这种也与血液不一样。殊不知，很多不参加血液凝结反映的物质与血液基本同样。以便防止抗凝血剂的影响，血液中很多成分的剖析应用血细胞做为试品。　　血液　　它等于结缔组织的细胞间质。它是血液的关键成份，是浅黄色液体(因为它带有总胆红素)。在血液的成分中，水占90%至92%，物质的量浓度主要是血浆蛋白。血浆蛋白是多种多样蛋白的统称，能够根据蛋白质变性将其分成三类人体白蛋白、血蛋白和纤维蛋白原。　　血浆蛋白的作用是：保持血液血浆渗透压;构成血液缓存系统参加保持血液酸碱;在运送营养元素和类化合物时，血液蛋白是吸水性胶体溶液，很多不可溶物质与他们融合变成可溶的。水里的物质;营养成分作用，血浆蛋白溶解造成的碳水化合物，可用以生成组织蛋白质或氧化分解出示动能;参加凝血功能和免疫力。　　血清和血浆好像表面层没有差别，但关键差别取决于血细胞没有纤维蛋白原，它是在没有抗凝医治的血液凝结后得到 的。在一些需要血细胞测量的检测中常常会碰到血液检测，基本上是根据血液精确测量的。血细胞关键用以测量血液生化指标的免疫能力;血液关键用以血液凝结的测量。

首先，你得知道什么是病毒血清学检测，按照百du百科的解释，病毒血清学检测是利用抗原与抗体的特异性反应检测病毒及其抗体的血清学技术。包括中和实验、红细胞凝集实验、补体结合实验、蛋白检测以及发光物质和荧光素标记的酶联免疫吸附试验( ELISA)等方法。近年来，免疫组化、免疫共沉淀、免疫转印等技术在临床也有了更多的运用，为病毒感染的实验室检测提供了基础。没错，大家可能会想到打乱市场经济，及牺牲很多人性命的—新guan病毒。2019年冠状病毒病（COVID-19）正在影响整个全球市场，除了人的生命成本外，病毒传播对全球经济产生了巨大的影响，同时也对世界ji术供应链产生深远的影响。由于目前COVID-19的诊断主要依靠血清学检测和核酸检测，而血清学检测由于其简便快捷的检测方法，能够很好的满足如此大批量的检测需求。一、血清样本采集在病程早期采集急性期血清，间隔2～3周后采集恢复期血清，有的病毒抗体出现早，应间隔1周左右采集第2份血清，以便早期诊断。采血前建议患者清淡饮食，尽量空腹。二、进行血清学检测的必要性与聚合酶链反应（PCR）或病原菌培养检测方法相比，血清学检测结果对疾病的感染过程提供了不同的见解。血清学检测可以确定人群中已被感染并产生相应抗体的“无症状感染者”以及感染后通过自身免疫系统产生相应抗体达到自愈的人群，基于检测样本中抗体的血清学检测可以快速，经济，高效，直观地提供结果。三、病毒血清学检测的实验方法1.病毒中和实验是指病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。可用来检查患病后或人工免疫后机体血清中抗体的增长情况，也可用来鉴定病毒或研究其抗原结构。病毒中和实验可以在细胞培养、鸡胚或动物上进行，一般将抗体做稀释，与一定量的病毒混合，然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物上的感染性。终点是以抑制细胞病变（细胞培养）或病毒复制（鸡胚或动物）的抗体最高稀释度来表示。中和抗体特异性高，维持时间较长，流行病学研究常用此法。2.红细胞凝集实验部分病毒如流感等表面有血凝素（糖蛋白），在一定条件下，能与鸡、豚鼠红细胞表面的糖蛋白受体结合而发生凝集现象。滴定病毒的血凝效价，便可大致估计病毒颗粒的数量（1个血凝单位=106病毒颗粒）。若血清中出现特异性抗体与相应病毒结合后，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象的出现，则称为血凝抑制现象。利用血凝抑制实验可以检测和鉴定具有血凝特性的病毒，如流感病毒、乙脑病毒的辅助诊断和流行病学调查。该方法敏感、简单、费用低，而且操作简便。同时，也可用于抗体效价检测。3.补体结合实验用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验，可以用于检测动物血清中的病毒抗体，病毒抗原与抗体的相互反应可以引起补体结合，最终可导致膜溶解。在补体结合试验中，如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。4.沉淀实验可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织渗出液等）与相应抗体结合，在适当量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀。目前临床运用较少。5.凝集实验颗粒性抗原与相应抗体结合后发生凝集的血清学试验。抗原与抗体复合物在电解质作用下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块。临床常用于鉴定菌种和梅毒感染的确认。6.病毒蛋白检测病毒侵入宿主细胞后可合成自身结构蛋白与非结构蛋白，也可与宿主细胞发生相互作用而上调或下调宿主蛋白的表达，除直接检测病毒外，也可检测与病毒发生作用的蛋白。在检测分类上可根据检测对象分为抗原检测和抗体检测，也可根据检测方法分为定性检测和定量检测，根据标记物结合于抗体还是抗原分为直接检测和间接检测。临床常用病毒蛋白的检测方法包括ELISA技术、免疫印迹技术等，均可用标记有酶、发光底物或荧光素的抗体或抗原检测病毒抗原或针对病毒产生的抗体。免疫酶染色技术包含直接免疫染色和间接免疫染色方法，直接免疫染色法利用荧光素或酶标记，可识别病毒抗原的特异性抗体与感染细胞或组织样本作用，而间接免疫染色法是利用荧光素或酶标记抗抗体，用病毒特异性抗体与感染细胞或组织样本作用后，再加入荧光素或酶标记的抵抗抗体作用。间接法较直接法敏感，而且使用方便，可用于多种病毒抗原的检测，不需要提纯病毒的特异性抗体和繁琐的标记过程。

想要得到纯度、浓度和均一性都比较满意的目的蛋白，蛋白纯化技术是关键。蛋白纯化方法有很多种，想要快速的掌握这些方法，看这篇文章蛋白质各种纯化方法的原理。能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因，是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学和生物学性质有着极大的不同，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种转角）、三级结构和四级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其他蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离。1、分子大小不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，可用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到分离。1.1、透析和超滤透析在纯化中极为常用，可去除盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色。1.2、离心分离置换缓冲液许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得到某一亚细胞成分，使酶富集10-20倍，再对特定的酶进行纯化。 差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。等密度梯度离心常用的介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等。1.3、凝胶过滤这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要分离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。2、形状蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到形状的影响。对两种相同质量的蛋白质而言，球状蛋白质具有较小的有效半径（斯托克半径），通过溶液沉降时遇到的摩擦力小，沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大；反之，在体积排阻色谱时，斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部，较迟洗脱出来，因而显得比其它形状的蛋白质要小。3、溶解度利用蛋白质的溶解度的差别分离各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度，但在同一的特定外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件，控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度。3.1、pH控制和等电点沉淀蛋白质在其等电点一般较不易溶解。3.2、有机溶剂分离法蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（＜10ug/ml）直至极易溶解（＞300mg/ml）不等。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀。3.3、温度不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温下比较稳定，故分离操作一般在0℃或更低温度下进行。4、电荷蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和，如中性溶液中带净负电荷则称为酸性蛋白质。4.1、电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，而且也是研究蛋白质性质很有用的方法。等电聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差异就能分开。2D-PAGE分离蛋白质分辨率已经发展到100000个蛋白点。4.2、离子交换层析改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和（阴、阳）离子交换填料，不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同，蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离。洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分为分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果较好，分辨率高，特别是交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。控制洗脱剂的体积（与柱床体积相比）、盐浓度和pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。5、疏水性多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/L盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。6、亲和能力结合效率高，分离速度快的特点。配基可以是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体。吸附后可改变缓冲液的离子强度和pH的方法，洗脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱。按配基的不同可分为：6.1、金属螯合介质过渡金属离子Cu2+、Zn2+和Ni2+等以亚胺络合物的形式键合到固定相上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属-蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。6.2、小配体亲和介质配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。6.3、抗体亲和介质即免疫亲和层析，配体有重组蛋白质A和重组蛋白G，但蛋白A比蛋白G专一，蛋白G能结合更多不同源的IgG。6.4、颜料亲和介质染料层析的效果主要取决于染料配基与酶的亲和力大小外，还与洗脱缓冲液的种类、离子强度、pH值及待分离样品的纯度有关。配体有Cibacron Blue和Procion Red两种。在一定的条件下，固定化的染料能起阳离子交换剂的作用，为了避免此现象的发生，最好要离子强度小于0.1和pH大于7时操作。6.5、外源凝集素亲和介质配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素，固相外源凝集素能和数种糖类残基发生可逆反应，适合纯化多糖、糖蛋白。7、稳定性7.1、热稳定性大多数蛋白质加热到95℃时会解折叠或沉淀，利用这一性质，可容易地将一种经这样加热后仍保持其可溶性活性的蛋白质从大部分其他细胞蛋白质中分离开。7.2、蛋白酶解稳定性用蛋白酶处理上清液，消化杂蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白质。

在细胞培养过程中，广大科研工作者一直饱受微生物污染的困扰，几乎所有科研单位的细胞房都曾经遭受过细菌、真菌、支原体、黑胶虫的污染，尤其是一些珍贵的细胞种子，一 旦招惹上这几个家伙，甚至面临“绝种”的危险。针对细胞培养当中面临的最普遍的问题，作为科研工作者的我们必须清楚认识这些微生物，并通过技术手段判断细胞遭受了哪种污染， 准确的对症下药，才能为我们的细胞保驾护航。1 细菌污染1.1 细菌污染的鉴别细菌污染是细胞培养当中最常出现的污染类型，枪头不小心碰到瓶壁、手不小心从培养瓶口处穿过、培养基倒入培养瓶等等，不经意的一个小动作，都可能会造成细菌污染，以致于实验前功尽弃。 细菌污染在没有爆发或培养体系中含有双抗时，细菌污染较容易被科研工作者忽视，黑点在显微镜下一穿而过，小黑点因为数量少且移动迅速而不易发现。随着细菌在培养体系中的增多或者体系中撤掉双抗以后，细菌可以从镜下明显识别，会呈现黑色条状、棒状、球状， 培养基的外观也会发生明显的变化，培养基变浑浊，有细沙状沉淀，有时会伴有臭味。1.2 细菌污染的解决方式一般的细胞培养体系中，普遍采用双抗或者三抗进行细菌的预防，但这两者存在一定的局限性，比如只能预防，而不能拯救已经细菌污染的细胞。另外，很多科研工作者从事原代的细胞分离和培养工作，在从动物身上取材并分离培养的过程中，极易造成细菌污染，如果只是加入双抗或三抗进行冲洗组织，细菌污染无法避免，造成了珍贵动物组织的浪费。使用细胞污染高效清除剂iCell 细胞污染高效清除剂，不仅兼具双抗或三抗预防细菌的功效，还可以清除支原体污染，有效消除真菌和细菌的污染，只需 1-3 天就可显着抑制支原体、真菌、细菌的增殖， 本产品经过了上百种细胞的测试和长期的实验验证，完美兼具高效和广谱清除细胞污染物的能力，对细胞生长几乎无影响，大程度上挽救您的细胞。2.真菌污染2.1 真菌污染的鉴别实验室污染的真菌一般为三类：念珠菌、酵母菌、霉菌，细胞污染真菌通常不易察觉，只有霉菌会逐渐出现细丝团状漂浮物，较容易从外观发觉污染，其他真菌污染不像细菌污染培养基会浑浊，污染后培养液清澈透亮，与未污染的细胞从外观上看无明显变化。在显微镜下比较容易判断污染类型，念珠菌呈卵圆状，在细胞周边生长，酵母菌出芽生殖时有明显的一大一小连体结构，霉菌可观察到菌体，菌丝呈丝状、管状、树枝状。2.2 真菌污染的解决方式真菌污染由于不容易通过培养基的变化来判断，一般发现时就是已经爆发了，镜下会出现明显团状或黑色丝状污染物，细胞状态明显变差，很难救活。传统的预防真菌污染的方式为培养体系中加入三抗，但是一旦发生真菌污染，三抗对于明显的真菌污染就显得心有余而力不足，此时建议如果是还留存种子的细胞就立刻扔掉，彻底消毒灭菌细胞房和 CO2 培养箱，扔掉可能被污染的培养基，对用过的实验器材进行灭菌。使用真菌清除剂真菌清除剂用于防止细胞培养过程中的真菌（包括酵母）污染，还可用于消除细胞培养物中的真菌（含酵母）污染。疗效远超真菌抗生素两性霉素 B，对细胞培养过程中的真菌污染，如白色念珠菌、曲霉、酵母有很好的疗效。真菌清除试剂经过了上百种细胞的测试和长期的实验验证，只需 1-3 天就可以抑制真菌增长。对细胞基本无害，具有高效、特异性杀灭的特点，大程度上挽救珍贵的细胞，减少真菌污染带来的损失。3 黑胶虫污染3.1 黑胶虫污染的鉴别“黑胶虫”是一种常见的细胞污染物，与细胞共生，随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，对细胞生长不利，严重时导致细胞死亡。目前很多细胞存在被“黑胶虫”污染的现象，对细胞培养及其后续实验造成了极大地影响。“黑胶虫”污染的细胞常见的特性有以下几点：（1）培养基不浑浊，但在显微镜下观察细胞时，细胞周围和培养液中有很多“小黑点”， 且随着培养时间的延长“小黑点”逐渐增多，更换培养液或洗涤细胞不能将其去除；（2）“黑胶虫”污染的细胞，营养消耗快，需要频繁更换培养液；（3）“黑胶虫”污染的细胞生长缓慢，细胞状态差，空泡化严重，甚至还可能导致细胞形态的改变。3.2 黑胶虫污染的解决方式对于黑胶虫污染的细胞，最为快速有效的处理方式就是采用黑胶虫清除剂对黑胶虫进行清除，同时确保培养体系中的血清必须为无黑胶虫和原虫污染的优质血清。使用黑胶虫清除剂黑胶虫清除试剂用于清除细胞培养过程中产生的“黑点”，只需 1-3 天就可以显着抑制“黑点”生长，一周左右即可清除“黑点”。本产品经过了上百种细胞的测试和长期的实验验证，对细胞生长无明显影响，具有高效、特异性杀灭的特点，可显着清除黑胶虫污染，大程度上挽救珍贵的细胞。4 支原体污染4.1 支原体污染的鉴别支原体直径约为 0.1-0.3 μm，具有变形能力，可透过常见过滤膜（0.22-0.45 μm），因此常规的无菌过滤方法不能将其去除，常用的抗生素也对支原体无效。支原体污染是细胞培养领域的一个世界性问题，世界各国细胞系支原体污染的平均比例为 30-60%。支原体可通过细胞之间交叉污染，操作人员的口腔、皮肤造成污染，或者血清等添加物而带入污染。支原体在光学显微镜下不可见，一般不会引起培养物混浊，因此细胞被支原体污染一般难以察觉。支原体会消耗必须氨基酸，影响细胞生长速率，促进代谢物积累，改变细胞形态，影响 DNA、RNA 以及蛋白质的合成，抑制细胞因子表达，改变被污染细胞的基因表达谱，诱导染色体畸变。

在科技高速发展的今天，细胞培养技术被广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究，成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。细胞培养需要特定的生长环境，想要养好细胞，选择合适的细胞耗材是关键。常见的细胞耗材包括细胞培养板、细胞培养瓶、细胞工厂等，每种耗材根据培养面积、培养方式、培养孔数的不同又分为不同的规格，一般都会经过表面改性处理，以更加适应细胞贴壁的生长。其中大面积的耗材多用于大规模细胞培养（如单克隆细胞培养），中等面积的耗材多用于一般性细胞实验或保存细胞，小面积用来复苏细胞或细胞较少时的培养。具体选择哪种形式和规格的细胞耗材要根据细胞培养面积及具体需求来定。从材料方面来看，细胞耗材分玻璃和塑料之分。不同的细胞对胰酶的敏感度不一样，所以在实验中我们常常会遇到一些细胞消化半天也没有起色，导致细胞状态不断下滑，直至死亡导致实验进展不顺利。细胞不同对玻璃和塑料制品的粘附能力也不同，如RAW264.7，平滑肌细胞等，需要在日常的细胞培养中多多积累经验。综上所述，细胞耗材的选择要考虑到细胞培养面积、培养方式、对材料的粘附性等各种因素，在满足以上因素的基础上确定具体的细胞耗材。