在培养细胞时，人们常常关注细菌和真菌的污染，认为它们是细胞培养的主要干扰因素。但其实，更严重的是支原体 的感染，它的发生率非常高，而且不易被发现。远慕生物为您分析污染细胞的支原体从哪里来。不仅普通光镜下无法发现支原体，而且培养基也不容易变色。但支原体对细胞的各种干扰却是不容忽视的。它不仅导致细胞状态不佳，生长速度慢，而且会使细胞内DNA、RNA及蛋白表达发生改变，严重影响实验结果。因此，在预防和治疗支原体污染之前，有必要去了解细胞被支原体污染的可能途径。支原体可以通过顶部的细胞器特异性和宿主细胞结合。这些顶部的细胞器含有高浓度的粘附蛋白，可粘附到真核细胞并穿入到细胞内部。支原体缺乏细胞壁，它们的胞膜可和宿主的细胞膜融合并交换其胞膜和胞浆成分。支原体污染的频率和污染来源细胞培养中有几种支原体污染与人、牛和猪有关。实验室的工作人员是口腔支原体、发酵支原体和人型支原体的主要来源。这三种支原体占细胞培养中支原体污染的一半以上，它们主要存在于人的口咽部。精氨酸支原体和无胆甾原体是另两类细胞培养中的支原体，它们来自胎牛血清和新生牛血清。胰酶如果是猪来源的，那么也可能存在猪鼻支原体。支原体在实验室内的扩散来源McGarrity设计了一个模型，来发现支原体是如何在超净台里的细胞传代过程中发生传播的。他先故意用支原体感染细胞。在超净台中，用胰蛋白酶消化该污染的细胞后发现，活的支原体可从细胞培养瓶外的细胞计数板、移液器、废弃盘中被技术员分离出来。即使过了四至六天，活的支原体仍然可以存在于超净台表面，可被成功恢复。在超净台里，传代完被支原体污染的细胞后，再传代干净的不含支原体的细胞，结果仍然在6周后被检测出支原体阳性。这些结果表明，支原体的传播是多么的快速和容易！它也警告我们，要zui大限度的避免支原体的污染，因为一瓶细胞发生污染，就会带来支原体传播的可能。未真正消毒的耗材、培养基和溶液不恰当的消毒导致污染的另一个原因。高压锅或干热烤箱中堆积太多的物品造成加热不均，使一小部分耗材未得到消毒。灭菌循环时间过短是另一个消毒上犯的错误，特别是对于超过500ml的液体，或者是包含固体成分的溶液，或胶体物质如琼脂、淀粉等。为了实现无菌，灭菌材料的尺寸、质量、性质和体积必须始终考虑。在无菌和无昆虫区域存放消毒好的物品，使防止再次污染的前提。良好的无菌操作也是至关重要的。实验室人员在因人导致的细胞支原体污染中，口腔支原体发生率zui高，它主要存在人的口咽部。发酵支原体和唾液支原体也在污染的细胞培养液中被检测出来，不过发生率更低。被支原体污染的细胞实验室内细胞支原体的相互传染，有必要对于从外源获得的新的细胞系进行支原体检测。一瓶细胞中的单个支原体的存在足以威胁到其他培养的细胞。支原体的污染能通过细胞操作产生的气溶胶或液滴传播。所以，应一次只操作一种细胞，为每种细胞系配置单独的培养基和试剂，这能避免支原体的污染。细胞培养的正确操作和对新培养的细胞定期检查，可以减少支原体污染的机会。

1、大肠菌群大肠菌群，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。一般食品中大肠菌群超标，表示食品受动温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。人吃了大肠菌群超标的食物可能会导致：肠道传染病、食物中毒等。2、霉菌霉菌，是丝状真菌的俗称，意即"发霉的真菌"，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不像蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。霉菌在我们的生活中无处不在，它比较青睐于温暖潮湿的环境，一有合适的环境就会大量的繁殖，必须采取措施来阻止霉菌的繁殖或切断其传播途径，就可以摆脱霉菌的污染。霉菌对食物的污染，降低食品的食用品质外，还会产生霉菌毒素。霉菌毒素对人主要毒性表现在神经和内分泌紊乱、免疫抑制、致癌致畸、肝肾损伤、繁殖障碍等。3、酵母酵母是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称，一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌，有的对食品加工有益，如发酵粉、酿酒酵母，有的为致病菌。空气中、人体中都存在一定数量的酵母菌，只要在合适的环境就会快速繁殖。吃了致病性酵母菌污染的食品易造成食物中毒，有些免疫力低的人群亦可能发生酵母菌感染。4、金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受到污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。5、沙门氏菌沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生qin兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜shou。沙门氏菌主要污染肉类食品，鱼、禽、奶、蛋类食品也可受此菌污染。沙门氏菌食物中毒全年都可发生，吃了未煮透的病、死牲畜肉或在屠宰后其他环节污染的牲畜肉是引起沙门氏菌食物中毒的最主要原因。由沙门氏菌引起的食品中毒症状主要有e心、呕吐、腹痛、头痛、畏寒和腹泻等，还伴有乏力、肌肉酸痛、视觉模糊、中等程度发热、躁动不安和嗜睡，延续时问2～3d，平均致死率为4.1%。6、志贺氏菌志贺氏菌即通称的痢疾杆菌。痢疾贺志贺氏菌是导致典型细菌痢疾的病原菌，在敏感人群中很少数量的个体就可以致病。志贺氏菌食物中毒是指由志贺氏菌引起的细菌性食物中毒。引起食物中毒的志贺氏菌主要是宋内氏志贺菌。主要发生在夏秋季，引起中毒的食品主要是热肉制品等。志贺氏菌侵入肠粘膜组织并释放内毒素引起症状。潜伏期一般10-14h。症状为剧烈腹痛、腹泻（水样便，可带血和粘液）、发热、里急后重显着。严重者出现痉挛和休克。7、溶血性链球菌溶血性链球菌又称沙培林,对热和化学清毒剂均敏感，常引起扁桃体、咽部、中耳等感染。亦为肾盂肾炎、产褥热、猩红热的病原体。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：①食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；②食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；③熟食制品因包装不善而使食品受到污染。溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变tai反应。8、李斯特菌李斯特菌，又名单核球增多性李斯特菌、李氏菌，是一种兼性厌氧细菌，为李斯特菌症的病原体。李斯特菌是革兰氏阳性菌，属厚壁菌门，取名自约瑟夫?李斯特。它主要以食物为传染媒介，是最致命的食源性病原体之一。李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌是嗜冷菌，在冰箱冷藏温度、沙拉中均能生长繁殖。李斯特菌感染后健康成人个体可出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。9、大肠埃希菌大肠埃希菌是人和动物肠道中的正常栖居菌。大肠埃希菌的致病物质之一是血浆凝固酶。根据致病性的不同，致泻性大肠埃希菌被分为产肠毒素性大肠埃希菌、肠道侵袭性大肠埃希菌、肠道致病性大肠埃希菌、肠集聚性黏附性大肠埃希菌和肠出血性大肠埃希菌5种。常见中毒食品为各类熟肉制品、冷荤、牛肉、生牛奶，其次为蛋及蛋制品、乳酪及蔬菜、水果、饮料等食品。中毒原因主要是受污染的食品食用前未经彻底加热。中毒多发生在3-9月。不同的致泻性大肠埃希菌引起的中毒，症状各不相同。10、副溶血性弧菌副溶血性弧菌，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无牙孢。进食含有该菌的食物可致食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。此菌对酸敏感，在普通食醋中5分钟即可杀死；对热的抵抗力较弱。11、肉毒杆菌肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境下的细菌，在罐头食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能力，是毒性最强的细菌之一。肉毒杆菌是一种致命病菌，在繁殖过程中分泌肉毒毒素，该种毒素是目前已知的最剧毒物，可抑制胆碱能神经末梢释放乙酰胆碱，导致肌肉松弛型麻痹。肉毒杆菌在自然界分布广泛，土壤中常可检出，偶亦存在于动物粪便中。人体的胃肠道是一个良好的缺氧环境，适于肉毒杆菌居住。肉毒杆菌属于厌氧菌，严格厌氧，在胃肠道内既能分解葡萄糖、麦芽糖及果糖，产酸产气，又能消化分解肉渣，使之变黑，fu败恶臭。在厌氧环境中，此菌能分泌强烈的肉毒毒素，能引起特殊的神经中毒症状，致残率、病死率极高。摄食肉毒杆菌的食品可引发食物中毒，如pH>4.6的低酸性罐头食品(含铁罐，玻璃罐)或香肠、火腿。人感染肉毒杆菌后会出现视觉模糊、呼吸困难、肌肉乏力等症状，如病情严重可能导致死亡。12、霍乱弧菌霍乱弧菌是人类霍乱的病原体,霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属于国际检疫传染病。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯1易感者，传播途径主要是通过污染的水源或未煮熟的食物如海产品、蔬菜经口摄入。居住拥挤，卫生状况差，特别是公用水源是造成暴发流行的重要因素。生产中的控制主要是严格审核原材料的来源，以及生产工序中的灭菌处理。13、变形杆菌变形杆菌是人和动物的寄生菌和病原菌。广泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、fu败有机物及人或动物的肠道内。可引起多种感染。中毒食品主要以动物性食品为主，其次为豆制品和凉拌菜，发病季节多在夏、秋，中毒原因为被污染食品在食用前未彻底加热，变形杆菌食物中毒是我国常见的食物中毒之一。进食后2~30小时出现上腹部刀绞样痛和急性腹泻，伴有e心、呕吐、头痛、发热。病程较短，一般1~3天可恢复，很少有死亡。14、空肠弯曲菌空肠弯曲菌菌体轻度弯曲似逗点状，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。最适温度为37～42℃。在正常大气或无氧环境中均不能生长。空肠弯曲菌是多种动物如牛、羊、狗及禽类的正常寄居菌。在它们的生殖道或肠道有大量细菌，故可通过分娩或排泄物污染食物和饮水。人群普遍易感，5岁以下儿童的发病率最高，夏秋季多见。苍蝇亦起重要的媒介作用。亦可经接触感染。感染的产妇可在分娩时传染给胎儿。空肠弯曲菌有内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒。该菌有时可通过肠粘膜入血流引起败血症和其他脏器感染，如脑膜炎、关节炎、肾盂肾炎等。孕妇感染本菌可导致流产，早产，而且可使新生儿受染。15、蜡样芽孢杆菌芽胞杆菌属中的一种。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，革兰氏阳性。蜡样芽胞杆菌与少数食物中毒有关(约2–5%)，包括一些严重的e心、呕吐以及腹痛。大概来说，杆菌性食物中毒是由于错误地烹调方法造成细菌孢子残留在食物上，更糟糕的是食物被不及时冷冻而让孢子发芽，细菌繁殖的结果是产生肠毒素，人食用含毒素的食物后会产生呕吐、腹泻等不良症状。16、平酸菌平酸菌是引起罐头食品酸败变质而又不胖听（即产酸不产气）的微生物，在罐头工业上称为平酸菌。它是兼性厌氧芽胞杆菌。其广泛分布于土壤，灰尘和各种变质食品中。误食平酸菌导致变质的罐头会造成食物中毒，有腹泻、呕吐等症状。17、耶尔森氏菌耶尔森菌属于肠杆菌科，包括鼠疫耶氏菌、小肠结肠炎耶氏菌与假结核耶氏菌等十余个菌种，这是一类革兰阴性小杆菌。其鼠疫耶氏菌、小肠结肠炎耶氏菌与假结核耶氏菌对人类的致病性已明确，其中鼠疫耶氏菌具有F1、V/W、Pgm、Pst1等重要的毒力因子，毒力很强，少量细菌即可使人致病。本属细菌通常先引起啮齿动物、家畜和鸟类等动物感染，人类通过接触已感染的动物、食入污染食物或节肢动物叮咬等途径而被感染。18、阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌是乳制品中近几年新发现的一种致病菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50%以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。19、蛔虫卵蛔虫卵是通过有虫卵的粪便污染水和食物，人吃喝了这种被污染而未经煮死的虫卵的饮水和食物就会得蛔虫病。控制措施一方面是严控生产工序，另一方面是生活中吃生鲜瓜果时一定要清洗干净。结语由上可见，食用了任何一种上述微生物污染的食品，轻则腹痛、腹泻，重则一命呜呼，可见食品安全无小事。因此，作为生产商，不管是严管原料来源，还是控制生产工序，都容不得我们有半点马虎。

实验室分析结果的可靠性和可信性是一个基本的期望和要求，以反映实验室的实际工作。实验记录要想变得可靠和信赖，必须符合以下条件：1、易读性除了记载宝藏地图的四十二章经和用来记载武功的圣火令上的蝌蚪文，实验记录不得采用人类失传或只有世外高人才能懂的语言书写。不能被读出或理解的记录没有价值并且可能被当废纸扔掉。所有实验记录应当遵循一致的语法规则。坚决避免采用俚语、暗号、吐火文等不易于理解的语言记录。这也是实验记录要引入第二个人进行见证的原因，见证人在这里要行使监督权。2、可归属性任何一份实验记录的创建都要能归属到具体的作者，对于纸质记录而言由个人签署并注明签署日期。你得明白你签署的是一份具有法律效力的文件，也许这份文件在法庭上作为呈堂证供，你应该清楚你的签名和含义。3、实时性所有记录必须在具体活动发生的时间进行撰写。延迟撰写将不可避免地影响到记录的准确性，有人会遗忘一些细节，而有人会产生错误的回忆。4、原始性所有记录必须是第一手的记录，而不能是二次记录。该规定的目的主要是避免在誊抄时引入错误。5、准确性实验室记录必须反映实际发生的事情。任何更改都不应该擦除原始信息，采用修正液进行涂改是绝不允许的。对记录进行修改必须有修改人员的签名和修改日期，及修改理由。6、完整性数据的完整性对于不同的实验类型来说具有不一样的内涵。数据的来源和数据的类型都会对完整性的保持提出不一样的挑战。通常，我们最易于在分析实验室遭遇数据完整性问题，对于样品分析来说，除了样品本身的分析结果，还需要系统适用性测试报告、进样序列、数据处理方法、样品制备过程等。如果样品存在重复进样或重复分析，这些数据也要保留，否则将大大降低样品分析结果的可信度。永远记住"没有记录就等于没有发生"。7、逻辑连贯性这里的逻辑连贯性是指实验室发生的一些列活动应该具有时间上的逻辑性，包括时间上的顺序，空间上顺序。具体到样品分析实验来说，必须有合乎逻辑的先后发生顺序。例如，HPLC的运行在时间上不可能发生在样品准备之前，样品的称量时间与色谱的进样时间应该有几个小时的时间差，以备充足的时间准备样品。因此，所有的日期/时间签署应该符合逻辑，这也是现场核查时专家经常检查的地方。8、不可删除性不可删除性有两方面的意思，一是在记录的生命周期内都要保持清晰可读，二是一旦创建就不能删除。手写记录输入应该用水笔书写，而不是铅笔。如果记录是在热敏纸上打印出来的，随着时间的推移记录会变暗，这时就需要及时地影印，并能确保与原件一致，将影印件附在原件后面。我们在实验室经常看到实验记录本里会粘贴很多打印件，那么在粘贴打印件时也要注意以下两点：使用无酸胶水或工业级的透明胶带签名和日期时应该采用骑缝的方式，即字迹跨越粘贴件和记录本页面。9、可用性所有记录应随时可供检查，审计。如果监管机构要求审核某个文件，我们应做到三十分钟内就能呈递。因此，实验室应当建立归档系统。记录应封存并以保持其完整性，如限制访问的安全设施、有效的防火措施、防止受潮等等。

 实验安全是实验当中永远的主题，实验的操作规则并不是教条，而是真正为了你实验安全设计的一些规定。只有很好的遵守规定，按照规则行事才不会有遗憾之处，整理一些小技巧给大家参考。一、有关实验的操作：固体需匙或纸槽，手贴标签再倾倒。读数要与切面平，仰视偏低俯视高。 试纸测液先剪小，玻棒沾液测蕞hao。试纸测气先湿润，粘在棒上向气靠。 酒灯加热用外燃，三分之二为界限。硫酸入水搅不停，慢慢注入防沸溅。 实验先查气密性，隔网加热杯和瓶。排水集气完毕后，先撤导管后移灯。解释：1、固体需匙或纸槽：意思是说在向试管里装固体时，为了避免药品沾在管口和试管壁上，可试试管倾斜，把盛有药品的药匙（或用小纸条折叠成的纸槽）小心地送入试管的底部，然后使试管直立起来，让药品全部滑落到底部。2、手贴标签再倾倒：意思是说取液体药品时应将瓶上的标签贴着手心后再倾倒（以免倒完药品后，残留在瓶口的药液流下来腐蚀标签）。3、读数要与切面平：仰视偏低俯视高：这句的意思是说取一定量的液体时，可用量筒或移液管（有时，也可以用滴定管），在读数时，应该使视线刻度与液体凹面蕞di点的切线处于同一平面上。否则，如果仰视则结果偏低，俯视则结果偏高。 4、试纸测液先剪小，玻棒沾液测蕞hao：“玻棒”指玻璃棒。意思是说在用试纸检验溶液的性质时，蕞hao先将试纸剪下一小块放在表面皿或玻璃片上，用沾有待测液的玻璃棒点试纸的中部，试纸就会被湿润，观察是否改变颜色，由此，就可以判断溶液的二、过滤操作实验：斗架烧杯玻璃棒，滤纸漏斗角一样。过滤之前要静置，三靠两低不要忘。解释1、斗架烧杯玻璃棒，滤纸漏斗角一样：“斗”指漏斗；“架”指漏斗架。这两句说明了过滤操作实验所需要的仪器：漏斗、漏斗架、烧杯、玻璃棒、滤纸、并且强调滤纸折叠的角度要与漏斗的角度一样（这样可以是滤纸紧贴在漏斗壁上）。2、过滤之前要静置：意思是说在过滤之前须将液体静置一会儿，使固体和液体充分分离。3、三靠两低不要忘：意思是说在过滤时不要忘记了三靠两低。“三靠”的意思是指漏斗颈的末端要靠在承接滤液的烧杯壁上，要使玻璃棒靠在滤纸上，盛过滤液的烧杯嘴要靠在玻璃棒上；“两低”的意思是说滤纸边缘应略低于漏斗的边缘，所倒入的滤液的液面应略低于滤纸的边缘。三、蒸馏操作实验：隔网加热冷管倾，上缘下缘两相平。需加碎瓷防暴沸，热气冷水逆向行。解释1、隔网加热冷管倾：“冷管即冷凝管。意思是说：加热蒸馏烧瓶时要隔石棉网（防止蒸馏烧瓶因受热不均匀而破裂），在安装冷凝管时要向下倾斜。2、上缘下缘两相平：意思是说温度计的水银球的上缘要恰好与蒸馏瓶支管接口的下缘在同一水平线上。四、萃取操作实验：萃剂原液互不溶，质溶程度不相同；充分振荡再静置，下放上倒切分明。解释1、萃剂原液互不溶，质溶程度不相同：“萃剂”指萃取剂；“质”指溶质。这两句的意思是说在萃取操作实验中，选萃取剂的原则是：萃取剂和溶液中的溶剂要互不相溶，溶质在萃取剂和原溶剂中的溶解度要不相同（在萃取剂中的溶解度要大于在原溶液中的溶解度）。2、充分振荡再静置：意思是说在萃取过程中要充分震荡，使萃取充分，然后静置使溶液分层。3、下放上倒切分明：这句的意思是说分液漏斗的下层液从漏斗脚放出，而上层液要从漏斗口倒出。五、中和滴定：水液洗器切分明，查漏赶气再调零。待测液中加试剂，左手控制右手动。瓶下垫纸眼观色，读数要与切面平，酚酞示剂常相识，强酸弱碱甲基橙。使用酸式滴定管，不盛碱液切记清。解释1、水液洗器切分明：“水”在此有两种含义，既表示自来水，又表示蒸馏水；“液”在此也有两种含义，既表示标准溶液，又表示待测液。这句的意思是说在做中和滴定实验时，必须先对各种仪器进行清洗，而何时用自来水，何时用蒸馏水，何时用标准液，何时用待测液一定要分清分明。联想：滴定管依次用自来水、蒸馏水、标准溶液洗涤；移液管依次用自来水、蒸馏水、待测液洗涤；锥形瓶先用自来水，然后用蒸馏水洗涤即可，切不可用待测液洗涤！2、查漏赶气再调零：意思是说滴定前应首先检查滴定管是否漏液，然后检查滴定管下端是否有气泡，若有应赶掉它，蕞后调节液面至“0”位。联想：①查漏的方法是在洗净的滴定管中加少量标准溶液。若漏液，对于酸式滴定管应在活塞上涂适量的凡士林，对于碱式滴定管应更换一下玻璃球；②必须赶掉气泡，是因为如果滴定管尖嘴部分有气泡没有赶掉，滴定后气泡消失，则使测定结果偏高；③每次滴定蕞hao都从零位开始，这样可以减少误差。3、待测液中加试剂：“示剂”指指示剂。意思是说在滴定之前要向盛待测液的锥形瓶中加2-3滴指示剂（其作用是借它的颜色的变化，来指示反应的终点）。 4、左手控制右手动：意思是说在滴定时，必须左手控制滴定管，右手持锥形瓶不断摇动。 5、瓶下垫纸眼观色：“瓶下垫纸”的意思是说为了清楚地观察颜色的变化，可以在锥形瓶底下垫一张白纸；“眼观色”的意思是说在滴定过程中要目不转睛地注视着溶液颜色的变化，不要看滴定管的刻度。 6、读数要与切面平：解释参见“化学实验基本操作”。 7、酚酞示剂常相识，强酸弱碱甲基橙：这句的意思是说中和滴定常用酚酞做指示剂，只有强酸滴定弱碱（如，盐酸滴定氨水）时，才能用甲基橙。 8、使用酸式滴定管，不盛碱液切记清：这句的意思是说不能用酸式滴定管盛放碱溶液（因为碱液和玻璃中的SiO2反应生成Na2SiO3而使活塞和滴定管粘在一起）。六、醛的氧化实验 氨水量宜试管净，水浴温热出银镜。液稀碱多升温慢，喜观液中沉淀红。解释 1、氨水量宜试管净，水浴温热出银镜：这句的意思是说明了关于银镜反应实验应注意的问题。“氨水量宜”的意思是说在配制银氨溶液的时候，氨水不能过量，以沉淀恰好溶解为宜；“试管净”的意思是说做银镜反应的试管一定要洁净，否则将不能产生银镜，仅出现黑色絮状沉淀，为此在实验前须用10%的氢氧化钠溶液煮沸处理试管，然后，依次用自来水和蒸馏水洗净；“水浴温热”的意思是说做银镜反应的试管必须放在水浴中温热，切不可直接放在酒精灯上加热。联想：去掉试管上的银镜可用硝酸，这样既可除掉银镜，又可回收银。 2、液稀碱多升温慢，喜观液中沉淀红：这两句说明了用新制的氢氧化铜氧化醛的实验应注意的问题。“液稀”的意思是说所用的硫酸铜溶液、氢氧化钠溶液、乙醛溶液一定要稀；“碱多”的意思是说该实验中碱（氢氧化钠）要过量，而所用的硫酸铜的量一定要少。否则，将得不到红色沉淀，而是得到暗褐色沉淀。这是因为硫酸铜过量，则生成大量的氢氧化铜，过量的氢氧化铜将受热分解生成黑色的氧化铜，而黑色的氧化铜和红色的氧化亚铜的混合色即是暗褐色。七、重要演示实验 氢在氯中苍白焰，磷在氯中烟雾漫；甲烷氢气氯相混，强光照射太危险； 二氧碳中镁条燃，两酸遇氨冒白烟；氯化铵热象升华，碘遇淀粉即变蓝； 硫氢甲烷一氧碳，五者燃烧火焰蓝；铜丝伸入硫气中，硫铁混热黑物生； 热铜热铁遇氯气，烟色相似皆为棕。解释1、氢在氯中苍白焰：意思是说氢气在氯气中燃烧火焰呈苍白色（瓶口产生大量的酸雾）。 2、磷在氯中烟雾漫：意思是说磷在氯气中燃烧产生白色烟雾，白色烟雾是生成的无色液体三氯hua磷和白色固体五氯hua磷的混合物。3、甲烷氢气氯相混，强光照射太危险：这两句的意思是说甲烷与氯气混合或氢气与氯气混合在强光的照射下会发生危险。 4、二氧碳中镁条燃：“二氧碳”指二氧化碳：意思是说镁条可以在二氧化碳中燃烧。将点燃的镁条放入盛有二氧化碳的集气瓶里，镁条剧烈燃烧，生成白色氧化镁粉末，同时析出炭黑附着在集气瓶内壁上，反应式是：2Mg+CO2=2MgO+C。 5、两酸遇氨冒白烟：“两酸”指浓盐酸和浓硝酸。意思是说浓盐酸和浓硝酸与氨相遇将产生白烟。这白烟是氨跟浓盐酸（浓硝酸）挥发出来的氯化氢（硝酸）化合生成的微小的氯化铵（硝酸an）晶体。反应式为：NH3+HCI=NH4CI，NH3+HNO3=NH4NO3。 6、氯化铵热象升华：意思是说在试管里加热氯化铵晶体，则氯化铵分解为氨和氯化氢气体，在管口冷却时又重新结合生成氯化铵固体，这个现象表面上象升华，但本质上不是升华。因为升华是物理变化，而氯化铵在分解结晶过程中发生的却是化学变化。 7、碘遇淀粉即变蓝：意思是说碘遇到淀粉就变成蓝色，常用此性质鉴别微量的碘或淀粉。 8、硫氢甲烷一氧碳，五者燃烧火焰蓝：“硫氢”在此有三种含义：指硫、氢气和硫化氢；“一氧碳”指一氧化碳。这句的意思是说硫、氢气、硫化氢、甲烷和一氧化碳这五种物质燃烧时都产生淡蓝色的火焰。联想：氢气、甲烷、一氧化碳的鉴别。虽然，它们都是无色气体，而且点燃火焰都是淡蓝色，但是可以根据不同的化学性质进行区别开来。方法是在火焰的上方罩一个烧杯，然后将烧杯倒转过来加入澄清的石灰水。只有水珠生成但不能使石灰水变混浊的是氢气；不仅有水珠生成，而且能使澄清的石灰水变混浊的是甲烷；没有水生成，能使石灰水变混浊的是一氧化碳；没有水珠生成不能使石灰水变混浊，而生成的气体有刺激性气味的则是硫化氢。9、铜丝伸入硫气中，硫铁混热黑物生：这句的意思是说将铜丝伸入热的硫蒸气中，硫粉和铁粉混合加热都发生反应生成黑色物质（Cu2S和FeS）。 10、热铜热铁遇氯气，烟色相似皆为棕：这两句的意思是说把一束灼热的铜丝和铁丝放进盛有氯气的集气瓶里，可以看到红热的铜丝或铁丝在氯气中燃烧起来，集气瓶里充满了棕色的烟，这是氯化铜或氯化铁晶体颗粒。联想：待集气瓶冷却后加入蒸馏水，产生绿色溶液的是氯化铜，产生棕色溶液的是氯化铁。八、卤族元素及其化合物 氯气有毒刺激性，闻氯用手轻扇动。热铜热铁遇氯气，烟色相似皆为棕。氢在氯中苍白焰，磷在氯中烟雾漫。甲烷氢气氯相混，强光照射太危险。氯水消毒又漂白，作用原理次氯酸。消石灰氯漂白粉，用时常通二氧碳，二氧化锰盐酸逢，隔网热瓶氯气生。盐水硫酸除杂质，吸收通入火碱中。 硫酸食盐瓶中热，漏斗吸收氯化氢。 工业电解食盐水，阴阳产物化合成。 烧瓶干燥气密好，气体充满切记牢。 挤压胶头要迅速，红色喷泉多妖娆。 氟氯溴碘四元素，颜色渐深气变固。 半径密度渐递增，溶点沸点亦上升。 固碘加热能升华，有机剂中溴碘溶。 四位皆求水和氢，条件程度各不同。 上边可把下边换，碘遇淀粉即变蓝。 卤素氧化亚硫酸，硫化氢中把硫换。 莹石硫酸氟化氢，切记应在铅皿中。 氢溴碘酸真刁难，不用硫酸用磷酸。 氯溴碘和磷酸根，加酸再加硝酸银。 卤化银光易分解，照相降雨铭记心。                    解释1、氯气有毒刺激性，闻氯用手轻扇动：这两句的意思是说氯气有毒，有剧烈的刺激性（吸入少量氯气会使鼻和喉头的粘膜受到刺激，引起胸部疼痛和咳嗽，吸入大量氯气会中毒而死），闻氯气的时候，必须十分小心，应该用手轻轻地在瓶口扇动，仅使极少量的氯气飘进鼻孔。2、氯水消毒又漂白，作用原理次氯酸：这两句的意思是说氯气能溶解于水（1体积的水能溶解约2体积的氯气），氯气的水溶液叫氯水，氯气能跟水发生化学反应，生成盐酸和次氯酸（CI2+ H2O = HCI +HCIO），次氯酸是一种强氧化剂，能杀死水里的病菌，所以自来水常用氯气（1升水里约通入0.002克氯气）来杀菌消毒。次氯酸能使染料和有机色质退色，可用作漂白剂。 3、消石灰氯漂白粉：意思是说消石灰和氯气反应可制成漂白粉（漂白粉是次氯酸钙和氯化钙的混合物，它的有效成分是次氯酸钙），反应式为：2Ca（OH）2+2Cl2=Ca（ClO）2+CaCl2+2H2O。 4、用时常通二氧碳：“二氧碳”指二氧化碳，意思是说用漂白粉漂白的时候常通入空气里的二氧化碳和水蒸气，反应式为Ca（ClO）2+CO2+H2O=CaCO3↓+2HClO。联想：次氯酸是弱酸，比它强的酸都能把它从盐中置换出来，如，Ca（ClO）2+2HCl=CaCl2 +2HClO。 5、硫酸食盐瓶中热，漏斗吸收氯化氢：这两句的意思是说在实验室中是用浓硫酸跟食盐在烧瓶中加热的方法制取氯化氢。吸收氯化氢要在水面倒扣一个漏斗，既可以使氯化氢被充分吸收，又不会发生倒吸现象。 6、氟氯溴碘四元素，颜色渐深气变固：意思是说这四种元素的单质的颜色是逐渐变深的，状态是由气态变到固态（氟是淡黄绿色气体、氯是黄绿色气体、溴是红棕色液体、碘是紫黑色固体）。7、半径密度渐递增，溶点沸点亦上升：意思是说这四种元素的的原子半径、离子半径、及其单质的密度是逐渐增大的，熔点和沸点也逐渐升高。联想：组成和结构相似的物质随着分子量的增大，分子间的作用力也增大，表现在熔点和沸点的升高上，如有机物中的同系物。 8、固碘加热能升华：意思是说固体碘在加热时能发生升华现象。联想：常利用碘的这个特性把碘从其它物质中分离出来。9、有机剂中溴碘溶：意思是说溴和碘易溶解于有机溶剂中，如：汽油、苯、四氯化碳、酒精等。 联想：①医疗上用的碘酒就是碘的酒精溶液；②利用这个性质还可以把溴和碘从其它物质中萃取出来。 10、四位皆求水和氢，条件程度各不同：这两句的意思是说氟氯溴碘都能跟水和氢气反应，但是需要的条件和反应的程度各不相同。 11、上边可把下边换：意思是说卤族元素中，排在上边的能把排在下边的从盐中置换出来，如：2NaCl+F2=2NaF，2NaBr+Cl2=2NaCl+Br2，2NaI+Br2=2NaBr+I2。 12、碘遇淀粉即变蓝：意思是说碘遇到淀粉就变成蓝色，常用此性质鉴别微量的碘或淀粉。 13、卤素氧化亚硫酸，硫化氢中把硫换：意思是说卤素（X2）都能把亚硫酸氧化成硫酸，都能置换出硫化氢中的硫。反应式为：H2SO3+X2+H2O=H2SO4+2HX，H2S+X2=2HX+S。14、莹石硫酸氟化氢，切记应在铅皿中：意思是说在实验室中是用莹石跟硫酸在铅皿中反应制取氟化氢，反应式为：CaF2+H2SO4=CaSO4+2HF↑联想：不能用玻璃仪器，是因为氟化氢能腐蚀玻璃：4HF+SiF4=SiF4+2H2O。 15、氢溴碘酸真刁难，不用硫酸用磷酸：意思是说制备qin溴酸和氢dian酸时，不能用浓硫酸，而必须用磷酸，反应式为：NaBr+H3PO4=HBr↑+NaH2PO4；NaI+H3PO4=HI↑+NaH2PO4联想：因为，浓硫酸具有强氧化性，可把生成的HBr和HI氧化Br2和I2；反应式为：2HBr+H2SO4=SO2↑+Br2+2H2O，2HI+H2SO4=SO2↑+I2+2H2O。 16、氯溴碘和磷酸根，加酸再加硝酸银：“氯溴碘”在此指CI-、Br-、I-。这两句的意思是说CI-、Br-、I-和PO43-的鉴别方法是分别加稀硝酸然后再加硝酸银。有白色沉淀生成者则是CI-、有淡黄色沉淀生成者则是Br-、有黄色沉淀生成者I-、无沉淀生成者为PO43-（这是因为PO43-和Ag+也能生成类似AgI的黄色沉淀Ag3PO4，但是它可溶解于稀硝酸中）。 17、卤化银光易分解，照相降雨铭记心：意思是说：卤化银见光都易分解，故有两大用途：一是在照相业做感光材料；二是用于人工降雨。九、烷烃的命名碳链蕞长称某烷，靠近支链把号编。简单在前同相并，其间应划一短线。             解释1、碳链蕞长称某烷：意思是说选定分子里蕞长的碳链做主链并按主链上碳原子数目称为“某烷”。 2、靠近支链把号编：意思是说把主链里离支链较近的一端作为起点，用1、2、3。。。等数字给主链的各碳原子编号定位以确定支链的位置。 3、简单在前同相并，其间应划一短线：这两句的意思是说把支链作为取代基，把取代基的名称写在烷烃名称的前面，在取代基的前面用阿拉伯数字注明它在烷烃主链上的位置，而且简单的取代基要写在复杂的取代基前面，如果有相同的取代基，则要合并起来用二、三等数字表示，但是表示相同的取代基位置的阿拉伯数字要用逗号隔开，并在号数后面连一短线，中间用“-”隔开。例如，2，4-二甲基-3-乙基庚烷，2-甲基丁烷；十、乙烯硫酸乙醇三比一，温计入液一百七；迅速升温防碳化，碱灰除杂蕞合适。乙烯分子含双键，氧化加成皆不难；高锰酸钾紫红去，卤素氢气氢卤酸。乙烯聚合好塑料，燃焰明亮出黑烟；乙烯水化制乙醇，氧化得醛又得酸。解释：1、乙烯分子含双键，氧化加成皆不难：这两句的意思是说因为乙烯中含有双键，所以易被氧化，也都能发生加成反应。2、高锰酸钾紫红去：意思是说乙烯可以使酸化的高锰酸钾溶液退色。3、卤素氢气氢卤酸：意思是说乙烯可以跟卤素、氢气、氢卤酸发生加成反应。4、乙烯聚合好塑料：意思是说乙烯聚合，可得到好的塑料聚乙烯。5、燃焰明亮出黑烟：意思是说乙烯燃烧火焰明亮而且产生黑烟。6、乙烯水化制乙醇：意思是说乙烯在一定条件下跟水反应生成乙醇。7、氧化得醛又得酸：意思是说乙烯在催化剂作用下被氧化得到乙醛，乙醛进一步被氧化又得到乙酸。十一、常见化学药品的贮存硝酸固碘硝酸银，低温避光棕色瓶；液溴氨水易挥发，阴凉保存要密封。白磷存放需冷水，钾钠钙钡煤油中；碱瓶需用橡皮塞，塑铅存放氟化氢。易变质药放时短，易燃易爆避火源；实验室中干燥剂，蜡封保存心坦然。解释：1、硝酸固碘硝酸银，低温避光棕色瓶：意思是说硝酸、固体碘和硝酸银都属于受热见光易分解的物质，所以必须存放在棕色瓶里，并放在阴凉处。2、碱瓶需用橡皮塞：意思是说盛放碱液的试剂瓶要用橡皮塞。3、塑铅存放氟化氢：意思是说氟化氢（氢氟酸）易腐蚀玻璃，因而必须存放在塑料或铅制器皿中。4、易变质药放时短：意思是说易变质的药品存放时间较短，即，不能长久贮存，蕞hao现用现配制。联想：常见易变质的药品有：①  氢硫酸放久了，则大部分将挥发，部分被空气氧化；②  氯水长期存放将因慢慢分解而失效；③  亚铁盐长期存放，则易被氧化为铁盐；④酸化的高锰酸钾溶液长期存放则慢慢退色。5、易燃易爆避火源：意思是说易燃物质（如，二硫化碳、酒精、丙酮、苯、硫、磷、镁粉等）和易爆炸的物质（如，lv酸钾、硝酸an等）存放时要远离火源。6、实验室中干燥剂，蜡封保存心坦然：意思是说实验室中用的干燥剂极易吸水，因而要用蜡封保存。

危险化学品的安全要求1.使用危险化学品的单位，其使用条件（包括工艺）应当符合法律、行政法规的规定和国家标准、行业标准的要求，并根据所使用的危险化学品的种类、危险特性以及使用量和使用方式，建立、健全使用危险化学品的安全管理规章制度和安全操作规程，保证危险化学品的安全使用。2.使用危险化学品从事生产并且使用量达到规定数量的化工企业，应当取得危险化学品安全使用许可证。危险化学品使用量的数量标准，由国务院安全生产监督管理部门会同国务院公安部门、农业主管部门确定并公布。3.申请危险化学品安全使用许可证的化工企业，应当具备下列条件：（1）有与所使用的危险化学品相适应的专业技术人员；（2）有安全管理机构和专职安全管理人员；（3）有符合国家规定的危险化学品事故应急预案和必要的应急救援器材、设备；（4）依法进行了安全评价。3.申请危险化学品安全使用许可证的化工企业，应当向所在地设区的市级人民政府安全生产监督管理部门提出申请，并提交证明材料。设区的市级人民政府安全生产监督管理部门应当依法进行审查，自收到证明材料之日起45日内作出批准或者不予批准的决定。予以批准的，颁发危险化学品安全使用许可证；不予批准的，书面通知申请人并说明理由。安全生产监督管理部门应当将其颁发危险化学品安全使用许可证的情况及时向同级环境保护主管部门和公安机关通报。对于实验室来讲，主要是使用要求，具体的大家可以参考《危险化学品安全管理条例》

培养基为什么出现沉淀？自己购买干粉培养基配制后，总是会出现沉淀的现象。现总结可能是以下几种原因。一、称量错误天平称量不准确、计算称量错误导致配制培养基的浓度不正确，都有可能导致岀现部分沉淀。二、水质不佳多数培养基的制备需要使用纯化水、去离子水配制，而天然水中含有含有较多的矿物盐离子，若错误的使用了自来水，矿泉水配制，或使用的纯化水离子未除净，都有可能导致培养基灭菌后岀现浑浊现象或沉淀（磷酸盐含量高的培养基更易出现此类问题。三、培养基pH不正确偏酸或偏碱的pH有可能使培养基中的部分金属离子产生沉淀。四、容器不干净新开封的容器或容器清洗不干净，内壁留有杂质，都会导致灭菌后的培养基中有杂质出现。五、培养基本身有沉淀培养基配方中无机盐成分较多，或培养基本身含有不溶性成分，灭菌后会有沉淀存在，此为正常现象，不影响使用。例如MC、TTB、BS等，配方中含有不溶物，灭菌后有沉淀。六、溶解不充分培养基灭菌前应充分搅拌热至完全溶解，方可进行灭菌。若灭菌前未将培养基溶解完全就进行灭菌处理，灭菌后易出现絮状或团块状沉淀，如 Fraser培养基含有大量磷酸盐，若灭菌前未进行充分溶解，灭菌过程中磷酸盐易结成块灭菌后不溶解。七、灭菌方式不正确或灭菌过度含有不耐热成分的培养基，若灭菌过度或加热过度，都有可能导致灭菌后的培养基颜色不正确或岀现沉淀。如亚硒-酸氢钠胱氨酸増菌液(SC)，正常制备好的培养基应为淡黄色透明液体，澄凊无沉淀，若加热过度则培养基中亚硒-酸氢钠分最终制备的培养基会出现红色沉淀。八、添加剂加入时温度不正确卵黄、血液等对温度敏感的添加成分，若加入时温度过高或温差过大，易岀现凝块或絮状沉淀。

生物安全柜在致病菌检测过程中起着至关重要的作用，本文为大家提供了生物安全柜操作规程的制定思路，希望对大家工作有所帮助！1、安全柜应放置于十万级以下的初级净化间。操作前应打开紫外灯，照射30min，后将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免双臂频繁穿过气幕破坏气流；并且在移入前用75%酒精擦拭物品表面消毒，以去除污染。2、打开风机10min，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作。将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止2min，使柜内气流稳定后再进行操作。3、生物安全柜内不放与本次实验无关的物品。物品应尽量靠后放置，不得挡住气道口，以免干扰气流正常流动。4、操作时应避免交叉污染。为防止可能溅出的液滴，应准备好75%的酒精棉球或用消毒剂浸泡的小块纱布，避免用物品覆盖住安全柜的格栅。5、在实验操作时，不可完全打开玻璃视窗，应保证操作人员的脸部在工作窗口之上。在柜内操作时动作应轻柔、舒缓，防止影响柜内气流。6、安全柜应定期进行检测与保养，以保证其正常工作。工作中一旦发现安全柜工作异常，应立即停止工作，采取相应处理措施，并通知质量部经理。7 、检验完成后，关闭玻璃视窗，保持风机继续运转10min，同时打开紫外灯，照射30min。8、安全柜应定期进行清洁消毒，可用75%酒精或0.2%新洁尔灭溶液擦拭工作台面及柜体外表面；每次检验工作完成后应全面消毒。9、柜内使用的物品应在消毒缸消毒后再取出，以防止将标准菌株残留带出而污染环境，造成生物危害。10、使用方法：10.1安全柜采用LED液晶面板控制，控制面板包括的功能键有：电源开关键、杀菌灯键、风挡键（快速、慢速、无风）、照明键。10.2插上220V交流电源后，按下控制面板上的所示电源开关开启即可使用；需要灭菌时，按灭菌灯键；风挡键有三级（快速、慢速、无风）循环，默认为无风，按一次为慢速，再按为快速，第三次则回到无风，如此循环；平时操作照明，只需按照明键即可。11 设备的维护保养：11.1每次检验操作后用75%的酒精（其他杀菌剂视用户使用的材料而定）彻底对安全柜内部工作区域表面、侧壁、后壁、窗户进行表面净化。切勿使用含有氯的杀菌剂，因为它可能对安全柜的不锈钢结构造成损坏。同时对紫外灯和电源输出口表面进行清洁。当清洁安全柜内部区域时，操作人员除了手放以外，身体的其他任何部位不能进入安全柜。11.2长时间未实验时也得每两周进行清洁维护，按5.1进行，定期清洁不锈钢表面会使之保持表面的光滑美观。11.3每月用湿布对安全柜外部表面进行擦拭，尤其是安全柜的前面和上部，把堆积的灰尘打扫干净。并检查所有的维护配件的合理使用情况。11.4根据实际情况，每个季度或者半年检查安全柜的任何物理异常或故障，如有异常及时报修；将初效过滤器拆下清洗，防止积尘将导致进风量不足，而降低洁净效果。11.5每年请具备资格的认证技术人员对安全柜进行性能认证，依据紫外灯使用寿命效果，进行紫外灯的更换；当正常调节或清洗初效空气过滤器后，仍达不到理想的截面风速时，则应调节风机的工作电压（旋动旋钮），从而达到理想的均匀风速（将调节风速旋钮从左向右，从低速向高速缓慢调节，新工作台不应调至最高风速）。11.6在使用十八个月后当风机工作电压调整至最高点时，仍不能达到理想风速时，则说明高效空气过滤器积尘过多（滤料上滤孔已基本被堵，要及时更新），一般高效空气过滤器的使用期限为十八个月；更换高效空气过滤器时，应注意型号规格尺寸（原生产厂家配置），按箭头风向装置，并注意过滤器的周边密封，绝对无渗漏现象发生。

一、目的：建立培养基适用性检查操作规程，保证培养基的质量，确保检验结果的准确性。二、适用范围：本规程规定了培养基适用性检查方法和操作要求，适用于微生物实验室计数用培养基、控制菌检查用培养基的适用性检查。三、内容：1、简述1.1 培养基适用性检查试验可用于确定实验室所使用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基、按处方自行配制培养基所用不同批次的原材料等)、制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查要求。1.2 计数用培养基适用性检查包括需氧菌、霉菌及酵母菌总数计数。1.3 控制菌检查用培养基适用性检查包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。2 计数用培养基适用性检查微生物限度检查中计数用培养基有5种，胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、R2A琼脂培养基、平板计数培养基。2.1 培养基及配制2.1.1 培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂对照培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂对照培养基；R2A琼脂培养基、R2A琼脂对照培养基；平板计数培养基。2.1.2 配制：照《培养基配制标准操作规程》配制。2.2 试剂及稀释剂配制2.2.1 试剂：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、聚山梨酯80、氯化钠。2.2.2 稀释剂配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：称取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液14.63g,加水1000mL溶解，分装，灭菌（121℃、15min）。0.05％（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取已经灭菌好的聚山梨酯80（1mL），加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀，即得。0.9％无菌氯化钠溶液：称取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000mL，分装，灭菌（121℃、15min）。3 试剂及消毒液配制3.1 试剂新洁尔灭溶液、84消毒液、苯酚、75％医用消毒酒精。3.2 消毒液配制3.2.1 84消毒液：取84消毒液1ml，加水60ml(1：60)，摇匀即得。3.2.2 0.1％新洁尔灭溶液：取新洁尔灭溶液20.4ml，加水至1000ml，摇匀，即得。3.2.3 5％的苯酚溶液：称取苯酚5g，加水至100ml,摇匀，即得。3.2.4 75％酒精棉球：取灭菌脱脂棉撕成小块并揉捏成团，置于广口瓶内，加入75% 医用消毒酒精，充分浸润，即得。4 试验用菌株及菌液制备4.1 试验用菌株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26003］铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC(B)10104］枯草芽孢杆菌（Bacillus s aureus）［CMCC(B)63501］白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC(F)98001］黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC(F)98003］4.2 菌液制备4.2.1 仪器与用具仪器：生化培养箱（30～35℃）、霉菌培养箱（20～25℃）、恒温水浴锅。?用具：酒精灯、打火机、吸耳球、试管架、大试管（20×200mm、15×200mm）、锥形瓶、硅胶塞、刻度吸管（1mL、2mL、5mL/10mL）、吸管桶、接种环、培养皿（90mm）、不锈钢培养皿桶、不锈钢吸管桶、玻璃专用笔。5 菌液制备方法5.1 金黄色葡萄球菌菌液制备方法5.1.1 用无菌接种取金黄色葡萄球菌斜面中底部菌落一环，在装有pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL的试管内壁上轻轻摩擦，使环上的菌苔全部洗于溶液中，振摇混匀。5.1.2 用1ml无菌吸管吸取上述均匀菌液0.1mL加入装有9.9mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，混匀，作为10-1级。5.1.3 以此类推，10倍递增稀释至每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液，备用。5.2 枯草芽孢杆菌菌液制备方法照金黄色葡萄球菌菌液制备方法同法操作。5.3铜绿假单胞菌菌液制备方法照金黄色葡萄球菌菌液制备方法同法操作。5.4 白色念珠菌菌液制备方法。5.4.1 用无菌接种取白色念珠菌斜面中底部菌落一环，在装有pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml的试管内壁上轻轻摩擦，使环上的菌苔全部洗于溶液中，振摇混匀。5.4.2 用1ml无菌吸管吸取上述均匀菌液0.1ml加入装有9.9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，混匀，作为10-1级。5.4.3 以此类推，10倍递增稀释至每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液，备用。5.5 黑曲霉液制备方法5.5.1 取黑曲霉的斜面一支，加入20ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液于上述斜面培养物中，将孢子洗脱。5.5.2 用管口带有薄的无菌棉花的无菌吸管吸出全部孢子悬液，装入另外一支无菌试管中，混匀，作为原液。5.5.3 用1ml无菌吸管从试管中吸取0.1ml至另一支装有9.9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，混匀，作为10-1级。5.5.4 以此类推，10倍递增稀释至每1ml含菌数不大于100cfu的孢子悬液，备用。5.6 注意事项5.6.1 每一稀释级，均需制备2个菌数计数平皿。（每一稀释级取2个无菌平皿，每皿接种1ml菌液，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固后于30～35℃培养箱培养18～24h，计数；白色念珠菌、黑曲霉倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基中，混匀，凝固后于20～25℃培养箱培养96h，计数。5.6.2 每递增一稀释级，必须另换一支吸管。5.6.3 稀释时，吸管插入上一级试管内不低于液面2.5cm，反复吸吹数次。5.6.4 吸液时，应先吸至高于吸管刻度上部少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至下一稀释试管的内壁近液面处（切勿接触液面）缓慢地放出全部试液。5.6.5 所用稀释菌液吸管均需放入装有5％苯酚溶液的消毒缸内，24小时后才能洗涤。5.6.6 菌悬液制备后，若在室温下放置应在2h内使用，若在2～8℃冰箱保存的菌悬液可以在24h内使用。黑曲霉孢子悬液可在2～8℃冰箱保存，在验证过的贮存期内使用。6 计数用培养基的适用性检查6.1 实验操作6.1.1 胰酪大豆胨琼脂培养基接种方法分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液于无菌平皿中，倾注约20ml胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，轻轻摇匀。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查将接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养皿、对照培养皿于30～35℃培养不超过3天；将接种白色念珠菌、黑曲霉的培养皿、对照培养皿于20～25℃培养不超过5天。6.1.2 沙氏葡萄糖琼脂培养基接种方法分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液于无菌平皿中，倾注约20ml沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，轻轻摇匀。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查将接种白色念珠菌、黑曲霉培养皿、对照培养皿于20～25℃培养不大于5天。6.1.3 R2A琼脂培养基接种方法分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液于无菌平皿中，倾注约20mlR2A琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，轻轻摇匀。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查将接种铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养皿、对照培养皿于30～35℃培养不大于3天。6.1.5 平板计数琼脂培养基接种方法分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液于无菌平皿中，倾注约15ml该培养基，每株试验菌平行制备2个平板，轻轻摇匀。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查将接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养皿、对照培养皿于30～35℃培养不超过3天；将接种白色念珠菌、黑曲霉的培养皿、对照培养皿于30～35℃培养不超过5天6.2 观察与计算观察被检培养基上铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落形态、大小与对照培养基上铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落形态、大小是否一致。依次计算被检培养基上铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落平均数与对照培养基上铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆、白色念珠菌、黑曲霉的菌落平均数的比值。6.3 结果与判断若被检固体上的菌落数平均数与对照培养基菌落数平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致，各菌适用性检查符合规定。若被检固体上的菌落数平均数与对照培养基菌落数平均数的比值低于0.5～2范围，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落不一致，则判断该培养基的适用性查不符合规定。7 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基有液体培养基和固体培养基。7.1 培养基及制备培养基：脱水培养基、对照用培养基。制备：照培养基配制规程新鲜配制。7.2 试验用菌株及菌液制备试验用菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC(B)44102］金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26003］枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCCB(B)63501]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC(B)10104］沙门菌（Salmonella paratyphi B）［CMCC(B)50094］白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC(F)98001］7.3 控制菌检查用培养基需要测试的能力及判断指标7.3.1 液体培养基促生长能力检查取不大于100CFU的试验菌分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃）或（42～44℃）及最短培养基时间下培养。与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊。指示特性检查取不大于100CFU的试验菌分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃）或（42～44℃）及最短培养基时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基中试验菌生长情况/指示剂反映情况应与对照培养基一致。抑制能力检查取不大于100CFU的试验菌分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃）或（42～44℃）及最长培养基时间下培养，试验菌应不得生长。7.3.2 固体培养基促生长能力检查取试验菌液（含菌数不大于100CFU）分别接种于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃或（42～44℃））及最短培养基时间下培养。与对照培养基比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。指示特性检查取试验菌液（含菌数不大于100CFU）分别接种于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃）或（42～44℃）及最短培养基时间下培养。被检培养基上试验菌的菌落形态特征、菌落颜色及指示剂反应情况应与对照培养基一致。抑制能力检查取试验菌液（含菌数不少于100CFU）分别接种于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃）或（42～44℃）及最长培养基时间下培养，试验菌应不得生长。7.4 培养基能力测试列表控制菌检查用培养基适用性检查项目、菌株及判断指标7.5 实验操作7.5.1 胰酪大豆胨液体培养基促生长能力检查接种方法：分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液于该培养基中，接种量不大于100cfu，摇匀，培养。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查：30～35℃培养不超过3天。7.5.2 沙氏葡萄糖液体培养基促生长能力检查接种方法：接种白色念珠菌于该培养基中，接种量不大于100cfu，摇匀，培养。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查：20～25℃培养不超过3天。7.5.3 RV沙门菌增菌液体培养基促生长能力检查接种方法：分别接种不大于100cfu的沙门菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，与对照培养基管比较。抑制能力检查接种方法：分别接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基管比较。7.5.4 麦康凯液体培养基适用性检查促生长能力检查接种方法：分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在42～44℃条件下培养18～24h，与对照培养基管比较。抑制能力检查接种方法：分别接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在42～44℃条件下培养24h，并将被检培养基与对照培养基管比较。7.5.5 麦康凯琼脂培养基适用性检查促生长能力+指示特性的检查接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h。7.5.6 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基促生长能力+指示特性的检查接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的沙门菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h。7.5.7 三糖铁琼脂培养基、指示能力接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的沙门菌于被检培养基和对照培养基高层斜面上，便进行穿刺。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h。7.5.8 甘露醇氯化钠琼脂培养基促生长能力+指示特性的检查接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h。抑制能力检查接种方法：用涂布法分别接种不少于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基比较。7.5.9 溴化十六烷基3甲铵琼脂培养基促生长能力检查接种方法：用涂布法接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，与对照培养基比较。抑制能力检查接种方法：用涂布法分别接种不少于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基比较。7.5.10 肠道菌增菌液体培养促生长能力检查接种方法：分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，与对照培养基管比较。抑制能力检查接种方法：分别接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基管比较。7.5.12 平板计数琼脂培养基促生长能力检查接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基比较。抑制能力检查接种方法：用涂布法分别接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基对照培养基比较。7.5.13 念珠菌显色培养基促生长能力检查接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基比较。抑制能力检查接种方法：用涂布法分别接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基对照培养基比较。7.5.14 MUG培养基促生长能力+指示特性的检查接种方法：分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板中。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h。8 注意事项8.1 培养基的配制方法和灭菌程序发生变更时，应再次对培养基进行适用性检查。8.2 培养基批号发生变更时，应再次对培养基进行适用性检查。8.3 培养基供应商发生变更时，应再次对培养基进行适用性检查。9 记录每一次进行培养基的适用性检查后在《培养基适应性验证记录》上记录。

标准品（对照品）使用中常见问题，主要包括：1）.对照品含量，2）.储存运输温度，3）.新老批次，4）.产品稳定性5）.残留溶剂对照选择6）.剧毒对照品7）.对照品质量标准和复测一、1.1EP对照品含量问题：Q:我在哪里可以找到测定中使用的化学参考标准的指定含量？A:CRS分析的指定内容在我们的在线目录中提供的说明书中提供，用于定性分析（HPLC，TLC），因此您无法找到标准纯度的信息。其他CRS用于定量分析（测定确定），在这种情况下，标准纯度被公布。如果CRS没有定量内容，则在任何情况下都不应将其解释为含量为100％。 对于含量测定，必须明确指明含量，在任何情况下，用户都不应将其视为100％。但是，当一个杂质对照品用于相关物质检测或控制相应杂质时，如果没有指明含量，则为了估算，则视其为100％。Q:为啥有时候EDQM（EP）对照品的双标签？A：EDQM将要把当前所有标准品的外包装瓶上帖上双层标签，目前已经有大部分产品被换成双层标签了，但还有少数部分还没被贴到，还是单层标签。贴双层标签的目的是为了便于使用者在做实验（特别是做申报）时，把外面的一层标签揭下来贴在所写的实验记录中，以证实这个产品的来源（这里有部分客户看着是双标签误以为是贴牌啥的，这是误解）。Q:EDQM（EP）对照品瓶子和报告批次不完全一致？A：1、EP小批次的情况--在具体情况下，由于填装和贴标等原因，小批次均是由同一批次的大包装原料药提出来的（比如实物瓶子上的批次信息是batch1.1,1.2,1.3等，但是随货COA却是batch 1.0，2.0，3.0，其实是一样的，之前有多次遇到客户提及，故作说明）。二、储存，运输温度差异标准品（对照品）的储存，运输温度有何差异？A：常见的标准品的保存方法有：1.常温保存：通常用于化学性质比较稳定的标准品，建议保存于干燥阴凉的地方。2.+4度冷藏：用于常温下不是很稳定的物质，保存于实验室冷藏箱中（可控温度）。3.-20度冷冻：用于化学性质不稳定，常温下容易分解的物质。4.-80度保存：一些具有生物活性的物质，需要保存于特定的-80度的冰箱。运输条件：相对于长期保存的条件，运输过程由于时间比较短，所以运输条件相对来说要求没有保存条件那么严格。长期保存条件为常温和+4度的标准品都可以在常温条件下运输，-20度保存的标准品在运输时可以放入冰袋来降低温度，而-80度保存的物质则需要在运输时加入干冰。但是干冰的有效时间只能维持1天左右，所以这类型的物质不适合于长途运输。三、标准品（对照品）的新老批次变更：药典标准品如何保证在效期内使用？A:大部分国家药品标准物质不设有效期，而是对现行有效的在售批次进行持续的质量稳定性监测。一旦发现量值不适用，将立即发布停用通知。某品种现售批次的前一批次标准物质，若官方没有发布停用通知或公布有效使用期限，按说明书规定的条件保存，中检院一般在6个月内可以正常使用； EP的可以参考EP在线标准品数据库； USP的通常是在当前批次售完后的3-12个月。对于法定标准品，都建议用户随用随买或根据生产和检验计划来购买，不要事先大量囤积，因为一旦新批号开始对外供应了，将不再对老批号进行质量监测，用户如若继续使用，其特性量值及适用性请自行验证。Q:新批出来了，是不是旧批就不能用了？原则上是，中检院对仓储的在售标准物质进行质量监测，一旦发现量值不适用，将立即在中检院网站发布停用通知。某品种现售批次的前一批次标准物质，若中检院没有发布停用通知或公布有效使用期限，按说明书规定的条件保存，一般在6个月内可以正常使用。建议用户随用随买或根据生产和检验计划来购买，不要事先大量囤积，因为一旦新批号开始对外供应了，我院将不再对老批号进行质量监测，用户如若继续使用，其特性量值及适用性请自行验证。四、标准品（对照品）的稳定性：Q：由于对照品包装规格大，需要反复使用多次才能用完，如何确保产品的稳定性？A：对照品的稳定性，一般而言，来源于监管当局认可机构的对照品，只要是能够按照提供者推荐的贮存条件保存，无需再开展稳定性研究。对于其他来源的对照品，应考虑开展稳定性研究，包括质量标准中对照品使用时需要配制成的溶液稳定性。根据稳定性研究结果及其他研究数据，确认对照品的包装、保存条件、复验期(有效期)；明确是否对包装进行必要的处理，如充氮、密封等；说明对照品使用时特别进行的操作，如是否需要干燥处理及处理条件、可否多次使用等。五、如何选择残留溶剂用对照品？Q：残留溶剂有哪些，怎么确定和分类？A：1.具体可以参考《化学药物有机溶剂残留量研究技术指导原则》[附录] 药物中常见的残留溶剂及限度。2.一般主要从原料药制备工艺（路线，后续溶剂和中间体）和制剂及其临床应用（剂型和给药途径，处方工艺，适应症，剂量和用药周期）来确定溶残。3.目前大致分4类，第一类溶剂（致癌物、疑为人体致癌物或环境危害物的）；第二类溶剂是指有非遗传毒性致癌（动物实验）、或可能导致其他不可逆毒性（如神经毒性或致畸性）、或可能具有其他严重的但可逆毒性的有机溶剂；第三类溶剂是GMP或其他质量要求限制使用，对人体低毒的溶剂；第四类溶剂是指在药物的生产过程中可能会使用到，但目前尚无足够的毒理学资料的溶剂。关于对照品的选择，目前对于溶残对照并未形成普遍的共识，就当前遇到的客户对于溶残对照的认可和采购顺序做个总结：1.药典级对照品（中检所，EP，USP等）2.食品级（主要是食品环境类厂家包括：Dr.E,sigma,accustand,cfw,坛墨，振翔等）3.还有医药杂质对照品厂家（TLC,QCC等）4.蕞后就是一些高纯试剂（TCI，阿拉丁，百灵威，麦克林，泰坦等）六、致突变杂质用剧毒对照品如何购买？Q：致突变杂质用剧毒对照品如何购买？A:1.首先致突变杂质，我们狭义理解为基因毒性杂质，在EDQM有关文献报告里面提到了30多种结构，存在基因毒性可能，其中蕞常见的是N-亚硝胺类和甲基磺酸酯类（明细详见文献）。2.剧毒类对照品首先是化学品，所以应该归属到危险化学品，危险化学品有单独的采购程序，具体参照《危险化学品安全管理条例》。3. 依法取得危险化学品安全生产许可证、危险化学品安全使用许可证、危险化学品经营许可证的企业，凭相应的许可证件购买剧毒化学品、易制爆危险化学品。4.危险化学品生产企业、经营企业销售剧毒化学品、易制爆危险化学品，应当如实记录购买单位的名称、地址、经办人的姓名、身份证号码以及所购买的剧毒化学品、易制爆危险化学品的品种、数量、用途。销售记录以及经办人的身份证明复印件、相关许可证件复印件或者证明文件的保存期限不得少于1年。剧毒化学品、易制爆危险化学品的销售企业、购买单位应当在销售、购买后5日内，将所销售、购买的剧毒化学品、易制爆危险化学品的品种、数量以及流向信息报所在地县级人民政府公安机关备案，并输入计算机系统。简言之：先备案，再找有资质的企业采购，合法合规，规避风险。七、对照品能提供质量标准并定期复检吗？Q：对照品能否提供质量标准？A：对于这个质量标准我们分两部分看，一是药典对照品，参考标准就是各国药典各论。第二就是一些对照品厂家提供的对照，目前来看还没有厂家能提供产品的质量标准，因为目前我们接触的这些对照品，准确的定义叫化学对照品，还不是真正意义上的标准物质，所以大部分厂家现在能做到的就是提供产品的检测方法和条件。Q：对照品会定期复检吗？A：会，一般的复检都是安排在产品效期截止前半年。但是目前很多我们涉及的杂质对照品，经常产品效期还没到，厂家就卖完了，所以基本上很少看到同一个批次有多个复测报告。其次还有一个问题是有些客户采购了杂质对照品，直到效期过了都还没使用完，但是厂家已经卖完了，涉及到产品还能否继续使用的问题同时也反馈了厂家的产品稳定性研究工作的问题。

微生物培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，微生物培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。为了达到特定要求的研究，需要进行培养基配制和灭菌，那么微生物培养基该如何配制与灭菌呢?1.配制溶液向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后补足所需水分，对蛋白胨、肉膏等物质，需加热溶解，加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。配制固体培养基时，先将上述已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦。2.调节pH值用pH试纸(或pH电位计、氢离子浓度比色计)测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。3.过滤用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。4.分装已过滤的培养基应进行分装。如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中。如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基，则须将培养基分装于锥形瓶内。分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。装入试管的培养基量，视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升(1/4～1/3试管高度)，如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。5.加棉塞分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。6.制作斜面培养基和平板培养基培养基灭菌后，如制作斜面培养基和平板培养基，须趁培养基未凝固时进行。(1)制作斜面培养基。在实验台上放1支长0.5～1米左右的木条,厚度为1厘米左右，将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。(2)制作平板培养基。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入10毫升，以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物。

微生物菌种菌剂有很多种分类，按微生物菌种菌剂中特定的微生物大致可以分为细菌、放线菌（比如抗生菌）、真菌（如菌根真菌类）、固氮蓝藻菌等。当然，还可以按微生物菌种菌剂的作用机理等进行分类。微生物菌种菌剂是一种含有活微生物的特定制品，以微生物生命活动的过程和产物来改善作物营养件，发挥土壤潜在肥力，刺激作物生长发育，抵抗各种病虫害，从而提高作物产量和品质。它并不像一般的肥料那样，可以直接给作物提供养料物质。1、按微生物菌种菌剂制品内含物可分为单纯的微生物菌剂和复合(或复混)微生物菌剂等.例如,鹤壁人元生物微生物菌剂属于真菌菌剂,固氮类菌剂和复合微生物菌剂。2、按微生物菌种菌剂制品中特定的微生物种类分为细菌菌剂、放线菌菌剂(如抗生菌类)、真菌菌剂(如菌根真菌类)、固氮蓝藻菌剂等；3、按微生物菌种菌剂作用机理分为根瘤菌类菌剂、固氮菌类菌剂、解磷菌类菌剂、解钾菌类菌剂；微生物菌剂的作用主要是与营养元素的来源和有效性有关,或与作物吸收营养、水分和抗病有关,总的来说以下几个方面：1、增进土壤肥力：这是微生物菌剂的主要功效，可以改善土壤团粒结构，增强土壤的物理性能和保护植物根免受病原微生物的入侵和土壤颗粒的损失。2、制造和协助农作物吸收营养。3、增强植物抗病和抗旱能力。微生物菌种菌剂在作物生长所需的养分有着举足轻重的地位，不仅为作物提供了生长所需的各种养分，微生物菌种菌剂也起到了抵抗病虫害的作用。

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。鉴于HPLC在全行业运用越来越广泛，因此每一个实验室分析人员都应该熟练掌握并应用HPLC，对于一些常见的故障分析应该做到游刃有余，才能在运行故障的时候即使解决问题，提高工作效率。为此小编整理了常见HPLC故障及对策分析方案，不要错过哦。1、保留时间发生漂移或快速变化原因？关于漂移问题：① 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置， 保持柱温恒定；② 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 ；③ 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡。关于快速变化问题① 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定；② 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出；③ 流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合。2、出现拖尾或双峰的原因？① 筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子；② 存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子；改换流动相或更换选择性好的柱子 ；③ 可能柱超载，减少进样量。3、HPLC柱验收测试时柱压过高为什么？柱压过高是HPLC柱用户蕞常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。① 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保 护柱的问题，若柱压仍高，再检查；② 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降， 否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；③ 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；只用于使用过的柱子。④ 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。4、为何出现鬼峰？①进样阀残余峰－－每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗；②样品中未知物－－处理样品；③柱未平衡－－重新平衡柱,用流动相作样品溶剂（尤其是离子对色谱）；④三氟乙酸（TFA）氧化－－每天新配,用抗氧化剂 ；⑤水污染（反相）－－通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水 。5、为何出现峰拖尾？①柱超载——降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 ；②峰干扰——清洁样品,调整流动相；③硅羟基作用——加三乙胺,用碱致钝化柱,增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,纯化样品 ；④柱内烧结不锈钢失效——更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 ；⑤柱塌陷或形成短路通道——更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件；⑥死体积或柱外体积过大——连接点降至蕞低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管 ；⑦柱效下降——用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱。6、除了流速外，还有哪些因素能引起压力改变？改变流动相组成和温度；改变柱长、柱内径和填料粒度；柱突然阻塞压力升高（正常情况下其它条件不变柱压都是逐渐升高的）。7、怎样才会使峰位发生重排？在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的保留时间，不会发生峰位的重排。下列条件改变可能发生峰位重排：流动相中换了强溶剂；PH值的改变；柱填料的改变；柱温的改变；流动相的组成改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）。8、除了在线脱气，常用的实验室脱气方式还有哪些？加热回流脱气，脱气效果蕞佳，但无法保持；氦脱气，此方法脱气效果佳，能除去百分之九十以上的空气，但氦气价格太贵，所以用的不多；真空脱气，效果仅次于氦脱气，但脱气过程中容易造成样品溶液挥发损失；超声脱气，只能脱去约百分之三十的空气，但在实验室中蕞常用。目前还是尽量争取用在线脱气，方便且效果好。

在药物行业中，关于对照品和标准品我们并不陌生，但有些文献中常常会混淆对照品和标准品，认为对照品等同于标准品，其实不然，它们是两种不同的概念，那么接下来我们先来了解一下对照品和标准品的含义吧！一、定义标准品——一般是用于生物测定、抗生素或者生物类药品进行含量测定、检测的标准物质。对照品——从字面上来看，就是鉴别、检查以及含量测定、修正检定仪器性能的标准物质。当同种药物所需测定方法不同，那么选择的对照品还是标准品就会有所不同，比如非那西丁需要借助熔点来校准物质时，就会选择熔点标准品，而测定含量时，选择使用的就是对照品，故而同一物质需要对照品还是标准品，是由测定需求所决定的。二、标准品、对照品种类生物制品标准物质分为二类：国家生物标准品系指用国际标准品标定的，或我国自行研制的用于定量测定某一制品效价或毒性的标准物质，其生物活性以国际单位(IU)或以单位(U)表示。国家生物参考品系指用国际参考品标定的，或我国自行研制的用于微生物(或其产物)的定性鉴定或疾病诊断的生物试剂、生物材料或特异性抗血清或指用于定量检测某些制品的生物效价的参考物质，如用于麻疹活疫苗滴度或类毒素絮状单位测定的参考品，其效价以特定活性单位表示，不以(IU)表示。三、对照品和标准品能否混用？一般情况下，对照品和标准品测量的方向不同，所以会进行区分测定，但在现实生活中，对于对照品和标准品混用是药物检验中也是常有的事情，因为同一批对照品不同标定方法的含量有很好的相关性，也并不完全相同，有时差别会很大。那么什么情况下会存在对照品和标准品混用呢？情况一：在日常科研中几乎找不到相应的对照品，故而科研人员会选择标准品替代对照品，长此以往自然而然就混淆了对照品和标准品。情况二：卫生部所提供不够详尽的对照品说明书，尤其是在关键部分并没有提出对对照品质量要求以及标定方法的介绍，令人们在使用标准品和对照品出现了混淆的情况。情况三：使用对照品或标准品的人们对于它们并没有正确的认识，在不充分了解的情况下容易导致出现混用对照品和标准品。情况四：中国药典正文中也存在对照品混用的情况，比如含量测定的标准品或对照品用来检查溶出度，而含量测定的方法和溶出度分析方法又不同，所以容易引起混用。

API是用于制造药物制剂的活性成分，通常是原料药通过化学合成、半合成以及微生物发酵或天然产物分离获得，经过一个或多个化学单元反应及其操作制成的。原料药的药物合成工艺研究是药物研究和生产的重要组成部分，处于药物研发的基础，是药品质量形成的重要环节。下面来简单介绍以下原料药合成工艺研究中涉及的关键要素。药物合成是药物化学的中心，是药物改造以及验证设计药物的关键，在医药工业中占有极重要的地位。通常优良的药物合成工艺具有以下特点：（1）可行性－采用申报的工艺路线是否能够制备出目标化合物。（2）可控性－ 重现性要好，要能保证不同批次之间，产品质量的一致性，并符合质量标准的要求。（3）合理性－工业化的可行性，工艺路线对原材料、设备、反应条件等的要求；优选低毒性的溶剂、试剂；环境保护和劳动保护；成本核算。1、首先合成路线的选择与设计要有依据，要有合理性。(1)合成路线设计和选择的一般程序包括：a.对拟合成的目标化合物进行文献调研，设计或选择合理的合成路线；b.对所选择的路线进行初步分析，对该化合物的国内外研究情况、知识产权状况有一个总体的认识；c.对所采用的工艺有一个初步的评价，通过以上研究为药物的评价提供可靠依据。(2)对于新的化学实体根据其结构特征，综合考虑：a.起始原料获得的难易程度；b.合成步骤的长短；c.收率的高低；d.反应的后处理、反应条件是否符合工业生产、环保要求； 确定合理的合成路线。根据国内外对类似结构化合物的文献报道，进行综合分析，确定适宜的合成方法。（3）对于结构已知的药物通过文献调研，对该药物制备的研究情况有一个全面的了解，重点关注：a.可行性（原材料是否易得，反应条件是否能工业化）；b.可控性 （反应条件是否温和、易控）；c.稳定性（中间体质量是否可控、终产品质量和收率是否稳定）；d.先进性（所采用路线与文献路线比较的先进性）；e.合理性（成本及原料、试剂、溶剂的价格和毒性等）。2、其次起始原料、试剂和有机溶剂要有标准，强调规范性。对于起始原料的控制，GMP的要求从源头控制产品的质量。（1）对于合成产品有如下要求：a.物料的清单：列出原料药生产工艺中使用的材料（如原材料、起始材料、溶剂、试剂、催化剂）名称，说明各自的使用工序，确认关键物料；b.物料的检测方法：阐明这些物料的质量控制信息；c.关键物料供应商COA：质量标准和检验报告书；以动、植物或其组织器官为原材料的---提供原材料科属种、产地、采集季节、采集物保存条件等，并提供其质量要求生物合成的抗生素要提供菌种科属种和培养基的组成。（2）起始原料的选择原则:a.质量稳定、可控，应有来源、标准和供货商的检验报告，必要时应根据合成工艺的要求建立内控标准。b.对特殊的专用中间体，更是强调要提供相关的工艺路线和内控质量标准。c.对起始原料在制备过程中可能引入的杂质应有一定的了解，特别是对由起始原料引入的杂质、异构体，应进行相关的研究并提供质量控制方法；对具有手性中心的起始原料，应制订作为杂质的对映体异构体或非对映异构体的限度。对原料药合成路线的长短，FDA认为起始物料的确定在制备工艺中，拟定的起始原料应当与原料药的最后中间体间隔多步反应；并且，在间隔的反应中应当有分离纯化的中间体。这样可以有效降低由于起始原料之前的制备工艺变更可能对原料药质量带来的负面影响。应当注意一个反应可能包括多个纯化步骤，但应当视为一步反应。如果工艺中对最后中间体进行分离纯化处理，那么合成最后中间体的反应可以看作一步反应，而游离酸（或游离碱）与盐之间的相互转化则不应看作一步反应。并且要在起始原料中确定一个关键原料，该原料也应在符合GMP条件的车间进行生产。（3）溶剂、试剂的选择原则:　应选择毒性较低的试剂；有机溶剂的选择一般应避免使用一类溶剂，控制使用二类溶剂；应对所用试剂、溶剂的毒性情况进行说明，以便于在生产过程中加以控制。3、最后，合成中间过程要进行控制，强调可控性。对于中间过程的控制分为对制备中间体的质量控制和对工艺条件和工艺参数的选择、优化和控制。（1）对制备中间体的质量控制提供的资料应能够表明如何通过研究确定了关键中间体、一般中间体，如何通过对中间体的不同控制实现过程控制，从而更好的保证终产品的质量包括中间体的纯化方法、内控质量标准、检验结果、对杂质谱的分析。FDA对于主要中间体的归纳分为：a.枢纽中间体：可由不同方法合成的中间体;b.关键中间体：通常是分子中重要部分第一次形成的中间体。如：具有立体异构的分子第一次引入手性原子的中间体。c.最终中间体：原料药合成最终反应的前一步。（2）对工艺条件和工艺参数的选择、优化和控制工艺操作步骤的描述应详细；工艺条件, 如：反应装置、温度、压力、时间、溶剂、p H值、光照等的控制应严格；反应终点（ 提示原料转化为目的生成物的程度、杂质的生成情况等）的判断应明确。原料药制备工艺的研究是药品开发的起点，同时也贯穿于药品开发的全过程。在原料药制备工艺的研究中特别强调重视全过程的控制、数据的积累、杂质分析以及对起始原料和试剂控制的重要性，目的是确定一条可行、可控、稳定的生产工艺，同时也为质量研究提供依据。同时，对原料药制备工艺的评价不是孤立的，应结合质量控制、安全性和有效性的评价进行。从药品审评的角度，希望能对真实的工艺进行评价，以期达到对药物进行合理、全面评价的目的。

由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标记方式、同型对照等。流式抗体的选择：1 流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择蕞基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。2 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。3 流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。FACS Calibur仪器为例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常来说，PE蕞强，适用于弱表达抗原。FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道：流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。如：实验者同时检测三个指标，可以在图1中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响蕞后结果。因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。同型对照的选择：流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，相当于实验的阴性对照。同型对照选择与标记抗体同种属来源，同亚型，同荧光标记的抗体。比如：抗人的CD3的PE标记的抗体，小鼠的IgG2a。同型对照选择PE标记的小鼠的IgG2a。流式抗体使用注意事项：1、建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响，因此需要优化试验条件。注：不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异，例如传统流式细胞术 （采用鞘液流系统）需要1×106个细胞为起始上样量，抗体用量为10μl，而微流式细胞术 则只需5×105个细胞，抗体用量减少到5μl。2、直标的流式抗体应该4℃避光保存，不要冷冻。3、尽量选择经实验验证的流式抗体，以保证实验结果。

免疫荧光方法中的重要环节1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果蕞佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7－8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）9、拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。 

设备用具：切片机、恒温箱、溶蜡箱、玻璃缸、载玻片、盖玻片、手术刀片、镊子、包埋盒。试 剂 ：10％福尔马林、酒精、二甲-苯、固体石蜡、苏木-精、酸水、氨-水、酒精伊红染色剂型、加拿大树胶（二）HE染色石蜡切片的制作过程步骤一：取材与固定：取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。步骤二：脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲-苯中透明，以二甲-苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。步骤三：浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。步骤四：切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。步骤五：脱蜡常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木-精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲-苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。步骤六：染色HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木-精水溶液中染色数分钟。②酸水及氨-水中分色，各数秒钟。③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。步骤七：脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲-苯使切片透明。步骤八：封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。

在产品微生物检测过程中，实验员们会接触到许多不同的微生物种类，小编就来总结下检测实验中常检出的微生物。大肠菌群大肠菌群，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。一般食品中大肠菌群超标，表示食品受动温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。人吃了大肠菌群超标的食物可能会导致：肠道传染病、食物中毒等。霉菌霉菌，是丝状真菌的俗称，意即"发霉的真菌"，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不像蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。霉菌在我们的生活中无处不在，它比较青睐于温暖潮湿的环境，一有合适的环境就会大量的繁殖，必须采取措施来阻止霉菌的繁殖或切断其传播途径，就可以摆脱霉菌的污染。霉菌毒素对人主要毒性表现在神经和内分泌紊乱、免疫抑制、致癌致畸、肝肾损伤、繁殖障碍等。酵母酵母是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称，一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌，有的为致病菌。空气中、人体中都存在一定数量的酵母菌，只要在合适的环境就会快速繁殖;吃了酵母菌污染的食品易造成食物中毒，有些免疫力低的人群亦可能发生酵母菌感染。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受到污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。沙门氏菌沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌主要污染肉类食品，鱼、禽、奶、蛋类食品也可受此菌污染。沙门氏菌食物中毒全年都可发生，吃了未煮透的病、死牲畜肉或在屠宰后其他环节污染的牲畜肉是引起沙门氏菌食物中毒的最主要原因。由沙门氏菌引起的食品中毒症状主要有恶心、呕吐、腹痛、头痛、畏寒和腹泻等，还伴有乏力、肌肉酸痛、视觉模糊、中等程度发热、躁动不安和嗜睡，延续时问2～3d，平均致死率为4.1%。志贺氏菌志贺氏菌即通称的痢疾杆菌。痢疾贺志贺氏菌是导致典型细菌痢疾的病原菌，在敏感人群中很少数量的个体就可以致病。志贺氏菌食物中毒是指由志贺氏菌引起的细菌性食物中毒。引起食物中毒的志贺氏菌主要是宋内氏志贺菌。主要发生在夏秋季，引起中毒的食品主要是热肉制品等。志贺氏菌侵入肠粘膜组织并释放内毒素引起症状。潜伏期一般10-14h。症状为剧烈腹痛、腹泻(水样便，可带血和粘液)、发热、里急后重显着。严重者出现痉挛和休克。溶血性链球菌溶血性链球菌又称沙培林,对热和化学清毒剂均敏感，常引起扁桃体、咽部、中耳等感染。亦为肾盂肾炎、产褥热、猩红热的病原体。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：（1）食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；（2）食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；（3）熟食制品因包装不善而使食品受到污染。溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。

菌种的遗传特性需要在一定条件下才能表现出来。由于培养条件不适当，使菌种处于不利于发酵生产的生理状况，其结果也表现为菌种衰退。菌种处于不利于发酵的生理状况有以下三个方面的原因。1、一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异株混合组成，这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。一个由单菌落发育而来的菌种在固体培养基上分离，可以长出许多种形态培养特征的菌落。这些不同的菌落类型在代谢和生长繁殖速度等方面有一定差异。培养条件可以影响各变异株在培养物中的比例而改变该菌种的特性。同一个菌种的单孢子分离在不同的培养基上，所生长出的单菌落，其形态培养特征有显著差异，各种类型菌落所占的比例也不同。如灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)在豌豆琼脂培养基上，单孢子分离呈现出3～4种菌落类型，而在黄豆粉培养基上仅出现两种菌落类型。在开始菌种选育工作时，要研究单菌落的分离培养基，找出能呈现较多菌落类型的分离培养基。菌落类型和发酵产量之间存在着某种程度的相关性。在选种实践中，人们经过对菌落形态的考察，有意识地丢弃一些被认为是低产的菌落，挑选那些可能是高产的菌落。2、菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成，因而影响发酵。菌种培养基营养贫乏也同样不利于发酵。因为菌种在营养贫乏的培养基中多次传代，会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰老甚至死亡。因此，自然选育或菌种培养所用的培养基应选择具有菌种传代后生产能力下降不明显、菌体不易衰老和自溶的正常形态菌落、孢子丰富的培养基。3、在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变。这种改变可能以类似于生理性迟延或细胞分化的机制保持较长一段时间。由于菌种的衰退将会引起发酵过程的产量急剧下降，一旦发生菌种衰退，就必须采取有效的预防和防治措施，防止菌种的优良性状发生退化。同时若发现某些优良性状退化，应及时进行分离纯化，使生产菌种保持稳定的优良特性。防止菌种衰退的措施主要有菌种的复壮、提供良好的环境条件、定期纯化菌种、防止自身突变等各个方面。

微生物菌种冷冻干燥和液氮保藏菌种技术一、安瓶管开封1．用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管。2．用火焰将安瓿管顶端加热。3．滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂。4．用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。二、菌株恢复培养1．用无菌吸管，吸取0.3～0.5ml适宜的液体培养基，滴人安瓿管内，轻轻振荡，使冻于菌体溶解呈悬浮状。2．取0.1～0.2ml菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面／平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液体培养基内，然后在建议的温度下培养。3．若未能活化，或活化后有疑问时，请于收到菌种1个月内，通知保藏中心，经查证无误后，即免费补寄。三、注意事项1．菌种活化前，请将安瓿管保存在6一10℃的环境下。2．厌氧菌的培养，如无特别说明，自开封至接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态。3．某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长，此时请将步骤二(2)重复一次。液氮超低温保藏程序1、容器的选择：使用带螺旋盖的2ml塑料安培瓶。2、检查安培瓶是否渗漏：用0.05%的亚甲基蓝水溶液在4℃浸泡30-45分钟，冲洗干净，弃去含有蓝色染料的安培瓶，其余的安培瓶备用。3、打印标签（激光打印）。4、容器的灭菌：先用蒸馏水漂洗干净安培瓶，再用蒸馏水在灭菌锅中121℃浸泡灭菌15分钟，干燥并将打印好的标签放入安培瓶中，略拧紧螺旋盖，再行121℃灭菌30分钟。5、保藏菌菌龄：处于zui大生长量阶段或对数生长期后期。6、保护剂：选用5-10%的甘油或二甲基亚砜作保护剂。1）甘油的准备：在121℃灭菌15分钟，2-8℃贮存。甘油一般以两倍zui终所需浓度的水溶液保存，然后与同等量的细胞悬液混合。若不用细胞悬液，则以zui终所需浓度的水溶液保存。2）二甲基亚砜：用0.22um的聚四氟乙烯过滤膜过滤除菌。过滤膜预先用甲醇和二甲基亚砜漂洗。无菌的二甲基亚砜以10-15ml装量2-8℃避光保存。7、分装：在无菌条件下，将细胞悬液（从平板上打下直径为5cm的菌块）分装于安培瓶中，并注入保护剂，拧紧螺旋盖。8、将安培瓶固定在铝夹上，贴好标签。为了便于取用，一般一个铝夹上仅放一个菌株。9、将控温系统先预冷到4℃，再将铝夹放入其中。以每分钟1℃降温至-40℃，然后以每分钟10℃降温至-90℃。降温以后，将铝夹转移至处于液氮中的储存器中保存。10、菌种的复活：将液氮保藏的菌种取出，迅速放入37℃水浴中解冻。一般需2至2.5分钟,等完全解冻后，再及时转接到合适的培养基中培养。

PCR反应的五要素1、引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC蕞好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3’端的碱基，特别是蕞末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最hao有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以蕞低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。2、酶目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3、dNTPdNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。4、模板模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。5、Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显着的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

　　实验材料1、活材料：培养3d的黑曲霉（Aspergillus niger）、根瘤菌（Rhizobium sp.）、培养24h的大肠杆菌（E. coli）、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、培养5d的吸水链霉菌“5102”（Sterptomyces hygroscopicus “5102”）、培养24～48h的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的斜面菌种；其它自选的微生物材料，包括实验室已有的和自己从环境中分离得到的均可。2、培养基：原则上可以参考以下培养基：完-全培养基、缺C培养基、缺N培养基、缺P培养基、缺K培养基、缺Zn培养基、葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（含琼脂10g/L，每管12 mL）、牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基、牛肉膏蛋白胨培养液、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；也可以自己选定其它合适的培养基。3、试剂： 0.2mol/L K2HPO4、0.2mol/L硼酸、0.2mol/L NaOH、0.1mol/L柠檬酸；1g/L HgCl2，200??g/L链霉素，200??g/L青霉素，50g/L石炭酸；或者其它合适的试剂。实验用品接种环、酒精灯、9 mL无菌水、1 mL无菌吸管、无菌水、无菌平皿、玻璃刮铲、灭菌五角星形图案纸（牛皮纸或黑纸）、紫外灯箱、无菌镊子、直径0.6cm的无菌圆形滤纸片；或其它实验用品。实验设计方案的基本要求本实验是在已经做了微生物的一些基本实验和综合实验的基础上进行的，实验设计方案中应简明地阐述实验目的、原理、材料、实验方法、观测结果以及结果分析等内容。（一）拟订实验目的实验目的应该写明：通过何种设计方案，采用哪种方法，说明哪些因素对微生物生长有影响，影响程度如何；从本次实验本人可以获得哪些收获等等。（二）确定实验原理对自己的实验设计方案、方法从理论上说明依据。如微生物生长需要哪些营养物质，包括有机物、矿质营养元素；微生物与氧气的关系；微生物的生长温度范围；微生物生长繁殖需要的酸碱度即pH值环境；紫外线对微生物的作用；化学药剂对微生物的生长抑制或杀死作用等等，应根据试验目的灵活选择。（三）确定实验材料实验材料应根据自己的实验目的来确定，可以是实验室已有的活菌种，也可以是自己从环境中分离得到的微生物材料。（四）设计实验方法实验方法的确定也应该根据实验目的进行。应该包括菌种的选择、配制何种培养基、需要哪些器材和药品、怎样接种、怎样培养、怎样观察结果等等。可供参考的实验方法如下：1、营养元素对黑曲霉生长的影响⑴制备培养基：本实验分组配制培养基，培养基配方见附录1-8。培养基分装试管，每管装量4～5mL，0.1MPa灭菌30min后备用。⑵孢子悬液制备：取无菌水1支，用接种环从黑曲霉斜面菌种管中挑取菌体2～3环，放入水中，充分混匀，备用。⑶接种：每人取完-全、缺C、缺N、缺P、缺K和缺Zn培养液各一支，用1 mL无菌吸管按无菌操作法接种黑曲霉孢子悬液0.5 mL。本实验按每4人取一套培养基不接种作为对照。⑷观察：接种后，将培养管置28℃温度下培养5～7d ,观察黑曲霉菌丝及孢子生长情况。★该试验用细菌类微生物作试验菌种能观察到明显的结果吗？为什么？2、氧气对微生物生长的影响⑴菌悬液制备：用接种环按无菌操作法取根瘤菌、巴斯德梭菌、大肠杆菌1～2环分别放入三支无菌水中制成菌悬液。⑵接种：取已熔化并保温在50℃左右的培养基6支，用无菌吸管分别及取菌悬液0.2 mL接种到培养管中，每种试验菌接种2个重复，接种后立即置振荡器上混匀，并冷凝。⑶培养：置培养管于28～30℃下培养3d。⑷结果检查：取出培养管，观察并记录每支培养管的上、中、下各层次中细菌的菌苔大小，菌体集中分布的位置，以了解氧气对几种细菌生长的影响。3、温度对微生物生长的影响⑴接种：取牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基8支，用接种环按无菌操作法分别在斜面上划线接种大肠杆菌与枯草杆菌，勿划破培养基。⑵培养：将已接种的斜面培养基，分别放在4℃、28℃、37℃和45℃四种温度下培养。⑶观察：培养48h、72h后观察生长状况，根据菌苔的大小确定其生长最适温度。4、氢离子浓度对微生物生长的影响⑴培养基制备：分组按下列配方配制不同pH值的培养基，并用pH计校证pH值，然后分装入试管中，每管装量5～6 mL,0.1Mpa灭菌30min备用，见表。⑵接种培养：取供试pH培养基三组用接种环按无菌操作法于试管中分别接入大肠杆菌、吸水链霉菌、黑曲霉。在37℃下培养48h。⑶检查结果：出取培养物，观察并记录实验结果。

　　大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。　　一、接种与分离方法　　根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。　　1．平板划线分离培养法　　对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。平板划线分离法通常有两种方法：　　（1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的?）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。　　（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。　　琼脂斜面接种法　　主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。　　3．穿刺接种法　　此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。　　4．液体培养基接种法　　用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。　　5．倾注平板法　　本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。先数6个方格（每格为1cm2）中菌落数，求出每格的平均菌落数，并算出平皿直径，然后按下列公式计数，求出每毫升标本中的细菌数。　　全平板菌落数=每方格的平均菌落数×лr2　　每ml标本中的细菌数=全平板菌落数×稀释倍数　　6．涂布接种法　　本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。

支原体污染检测方法一般根据支原体种类不同，采取不同的方法进行检测。目前常用的检测方法有：1. 试剂盒检测法：目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检测。2. 观察细胞的形态和生长特征：支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并出现细胞病变，以此可依次对支原体污染进行检测，但有些情况下支原体污染引起的病变特征与病毒感染相似，因此不能准-确诊断。3. 分离培养法：大多数支原体可出现特有的典型菌落。因而可依次尽心检测，该方法准-确、可-靠，但时间长，敏感性不够高。4. DNA结合荧光素染色法：利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst 33258）侦测支原体污染。荧光染料会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。5. 电子显微镜和免疫电子显微镜法：电子显微镜或者免疫电镜下对样本进行观察，此法较准-确，但受条件限制，时间长，敏感性不高。6. 间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性强。未污染的细胞、支原体污染细胞、电镜检测支原体污染预防及处理组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保-证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留可以采用一定的抗生素进行处理，对支原体蕞有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等。目前，市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有-效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。另外，配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。支原体污染后果细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。

　　业内周知，混合稳定细胞株具有许多不同的稳定细胞株。因为稳定化的整合过程常常与失活的宿主内源基因的插入同时进行，稳定化的混合细胞株或比较多个单克隆稳定化的细胞株是实验准确数据的基础。由此，我们浅析常见的3种稳定细胞株筛选的发展情况。　　其一、96孔单克隆稀释法筛选稳定细胞株　　96孔单克隆稀释法可用于低整合率的转染法，或用于稳定悬浮细胞系的单克隆细胞系和筛选实验。该方法的优点在于理论上可得到非常均匀的单克隆抗体，且能稳定筛选细胞悬液，是目前筛选稳定且高产率细胞株的理想方法。其缺点是工作量较大，需要大量劳动力来不断的分板、循环筛选稳定细胞株，已达到筛选高产率的稳定性单克隆细胞的目的。　　其二、单克隆环法筛选稳定细胞株　　单克隆环法主要用于整合率低的转染法以及获得单克隆细胞株。单克隆环法具有工作量小的优点，只要把转染体细胞按一定的细胞密度放入新的培养皿，用合适的药物筛选并在培养皿中进行扩增，适合少量劳动力作业，其劣势可能难以获得高产率的稳定细胞株。　　其三、逆转录病毒的混合克隆技术筛选稳定细胞株　　此法可用于制备稳定混合细胞株，其优点在于能在短时间内得到稳定的细胞株，且能在任何时候将细胞稀释成新的培养皿，倾向于整合靠近转录始端的位点的基因，容易激活下游基因，但同时这些整合到转录活性基因的基因很容易导致整合部位基因的插入失效，影响到克隆的纯度。高等细胞株中存在非整合细胞，这种混合细胞内的细胞稳定结合，不会失去生长的优势。

　　细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。　　一、脂质体(Liposome)转染方法原理　　脂质体作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。　　优点:与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性，它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下蕞方便的转染方法之一。　　二、脂质体转染操作步骤　　(1)细胞培养：取6cm细胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃ CO2培养密度至40%~60%，密度过大，转染后不利筛选细胞。　　(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)　　A液：用不含血清培养基稀释1ug 质粒DNA。　　B液：用不含血清培养基稀释2ul脂质体。　　分别将A液与B液轻弹混匀，静置5分钟。　　(3)吸取B液加入至A液中，轻弹混匀。室温中置10-15分钟。　　(4)转染准备：用1mL不含血清培养液漂洗两次，再加入4mL不含血清培养液。　　(5)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。　　(6)瞬时转染后，可在48h-72h细胞长满之后，提取细胞蛋白或者RNA，验证敲减/过表达效率。　　注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

 蛋白酶K在BSE的检测中用来消化PrPc,用来区别致病的PrPsc,它的正确使用对检测特异性和敏感性都有重要影响。概述: 蛋白酶K是一种非特异性、枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶, 具有很高的比活性。EDTA等鳌合剂或SDS等去垢剂不能使蛋白酶K失活, 该酶在较广的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性来源: 源于白色念球菌(Tritirachium album)反应条件: 蛋白酶K在较广的缓冲液pH范围(pH 4-12.5), 温度范围(37-60℃), 盐浓度(如: 3 M GuHCl)或尿素(4 M)条件下均有活性。在一些去污剂如: Tween20(5%), Triton X-100 (1%)和SDS(1%)条件下也有活性比活性: 30 units/mg分子量: 28.9 kDa单位定义: 在250 μl反应体系, 37℃条件下1分钟内能分解释放相当于1 μmol酪氨酸的folin-阳性氨基酸和肽所需要的蛋白酶K的量定义为一个单位(1)贮存条件: 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM CaCl2和50%甘油。贮存于-20℃Proteinase K，中文名为蛋白酶K。不含DNase，不含RNase，进口分装，可直接使用。可以用于消化各种蛋白。用于各种常见的分子生物学、细胞生物学等相关实验，例如基因组DNA抽提、酶的消化去除等。酶活力，>30U/mg。在37℃，以血红蛋白为底物，1分钟内可以产生相当于1微摩尔酪氨酸Folin阳性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定义为一个单位蛋白酶K酶活力。在很宽的pH范围内有效，有效的pH范围为pH4.0-12.5，最佳pH范围为pH7.5-8.0。蛋白酶K的最佳反应温度为65℃，但在65℃或更高的温度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解。很多时候反应温度选择50-55℃。在0.2-1%SDS或约10mM尿素存在的情况下，蛋白酶K显示更高的酶活性。蛋白酶K的常用工作浓度为0.05-1mg/ml，根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH是否适合、温度是否适合等因素确定具体的工作浓度。常用浓度的EDTA、Triton X-100、Tween 20、Sarkosyl、盐酸胍对蛋白酶K的活力影响不大。

在基层从事畜牧兽医工作的人士都知道，对动物进行疫病监测是经常要做的一项重要工作。进行疫病监测就要对动物进行采血并制备血清。由于受基层技术条件、工作环境及采集设备等条件的限制，往往基层兽医人员从猪血中分离不出血清。这种情况普遍存在于所有的乡镇、村级畜牧兽医人员当中。现今，市里、县里要求各乡镇场每个季度都要报送动物血清。一些单位只能应付了事。但，由于报送的猪血清不合格而不能很好地完成任务，常常会受到上级领导的责备。的确，制备猪血清有一定的难度。但，只要你掌握了其中的一些技巧，就会轻而一举地制备出合格的猪血清来。如果你有兴趣的话，请接着往下看。1.采集目的及对象1.1用做疫苗抗体监测 要选择接种过待检疫苗且接种期超过一周以上三个月以内的健康生猪。1.2用做疫病监测 可对辖区内所有的生猪进行采血。一般每个自然屯选择两三个点即可。规模猪场及村外养殖小区可增设1—2个采血点。1.3用做自家苗 主要选择某种疫病康复一周以后或接种过某种疫病疫苗一周以上的健康生猪。2.采血部位及方法2.1小猪 一般体重25kg以内的仔猪，主要采集前腔静脉内的血液。其方法是：助手将猪仰卧保定，用碘酒将猪胸前口凹陷处消毒，取无菌注射器使针与猪体呈45°夹角缓缓刺入2-3cm，边刺入边做抽血动作。这样，很容易就会将血液采出。2.2大猪 一般体重在25kg以上的中大猪，主要采集耳静脉血。其方法是：助手用保定器将猪站立保定，术者一手固定一侧猪耳，选择耳面上较粗直的血管用碘酒消毒，用人用点滴软管针刺入静脉，再用试管采集流出的血液。每个试管采集5ml即可。3.血清的析出将试管或注射器（注意：先要将注射器活塞向后拉一两厘米，欲留出血清析出的空隙）放入盛有40°—45°热水的水槽或瓷缸内，并呈30°左右夹角。热水要多一些，并随时用温度计测温。若温度降低则更换新水，使热水浴始终保持在规定的温度内。一般经过30—40分钟，血清即可析出。如果用注射器抽取的，也可将其放在热炕头上（当然，热炕面温度不能太高也不能太低，一般在50°左右即可），并将活塞后拉一两厘米，针头一端垫高一些。再在上面盖上保温棉被或棉垫，经过半小时至一小时左右血清即可析出。4.制备血清失败的原因4.1大多数兽医在采血时一次采集过多，然后将采集的血液又分倒在其他的容器内。4.2热水浴的温度没有保持好。4.3有时还多次地将试管或其他盛血容器从热炕上或热水浴中拿起观看，使血液摇动，同时也造成了局域温度不稳定。5.制备猪血清技巧5.1避免溶血。血样采集完后，不要晃动，尽量保持相对静止状态，斜放在试管架或水杯中。如是用注射器采集的，先将其平放在平板上或水杯中。5.2及时加温。待血样全部采集完后，将其移至热水浴中或热炕上。5.3保持温度恒定。如果是使用热水浴进行加温，应放入一只温度计，观察温度的变化情况。并随时补充新的热水来维持温度的恒定。5.4观察血清析出情况。一般加温半小时后观察一次即可。正常情况下，此时已有少量血清析出。

【目的和要求】1. 了解pH对酶促反应速度的影响。2. 学习测定酶的最适pH的方法。【实验原理】酶促反应受环境pH的影响极为显著。 通常各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活力，一种酶表现其活性最高时的pH值，称为该酶的最适pH。低于或高于酶的最适pH时，酶的活性逐渐降低。不同酶的蕞适pH值不同。本实验仍以乳酸脱氢酶催化的反应为例，学习测定酶的最适pH的方法。【实验试剂和器材】（一）试剂：1. 不同pH值的缓冲液:100ml 0.33M柠檬酸，100ml 0.33M磷酸，3.54g 硼-酸，343ml 1M NaOH, 加水直到1升。用HCl滴定成pH值3.0、3.5、4.0、4.5直到12的不同pH值缓冲液。2. 0.01M NADH3. 0.1M 丙酮酸钠4. LDH【实验试剂和器材】（一）试剂：0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.0）；0.01M NADH; 10M 丙酮酸钠；LDH（二）器材：紫外分光光度计 ，移液枪，吸头，1.5ml小离心管，离心管架【实验方法】（一）酶活性的测定：方法同实验7中的步骤1。（二）pH对酶促反应速度的影响：1. 在1.5 ml小离心管中分别加入：(总体积为1ml反应液)2. 混匀以上试剂，倒入比色皿中，然后将比色皿放入分光光度计后读取340nm处OD值，加入0.02ml LDH使用液，迅速搅匀，使反应开始，测定反应1分钟OD值的变化。3. 根据所测得的OD值的变化，计算出反应初速度。

精-确的蛋白质定量是蛋白质相关实验所必需的，这些实验涉及分子生物学，细胞生物学，生物化学，发育生物学和神经科学的研究课题。依托不同的科学原理，目前已经发展出多种不同的蛋白测定方法，科研工作者广泛使用的方法比如紫外吸收法（UV），双缩脲法，考马斯亮蓝法（Bradford）、Folin-酚试剂法（Lowry）、BCA（Bicinchoninic Acid）法、凯氏定氮法等等，各有千秋。今天小编就BCA法，Bradford法，2种常见蛋白定量方法的原理、优缺点以及BCA法实验操作步骤给大家做详细介绍，看看哪一种方法能获得你的支持？BCA（Bicinchoninic Acid）法1、原理：BCA (bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，562nm处有蕞高的吸收值，可在540-595nm测定其吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。2、特点：BCA蛋白质测定方法灵敏度高，操作简单，正常情况下可在45分钟内完成测定；且试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。不方便的是这种方法需要提前制作标准曲线。灵敏度：例如Abbkine的定量总蛋白的蛋白质定量试剂盒（BCA法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，蕞低检测蛋白量达到5ug。优点：BCA方法适用于表面活性剂存在下的蛋白质浓度检测，可兼容高达5%的SDS，TritonX-100及Tween等。缺点：由于BCA方法依靠铜离子进行显色反应，如果溶液中含有与铜离子反应的螯合剂比如EDTA或者还原性试剂比如DTT、TCEP和β-巯基乙醇等，结果将受到很大程度的影响。此外，BCA方法的检测结果也会受到蛋白质内半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影响。3、实验所需仪器及试剂：恒温水浴锅、可见光分光光度计、离心机、旋涡混合器、试管4、实验操作：标准液制备：梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品。将8个EP管按照1到8进行标记，将BSA标准品稀释成1mg/mL工作液，准备浓度梯0，50，100，200，400，600，800，1000 ug/mL。BCA工作液制备：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）加样孵育：吸取20μL各个稀释浓度的蛋白质标准品或待测蛋白质样品，加入96孔板底部或试管中，向孔/管中再加入200uL BCA工作液轻轻摇晃混匀。在37°C下孵育30min，冷却至室温。测定：冷却到室温后，以空白为对照，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。5、浓度计算：在excel表中输入对应的标准曲线值和蛋白样品值，选定标准曲线的OD值和标准品蛋白浓度。考马斯亮蓝法（Bradford）1、原理：Bradford法也称作考马斯亮蓝法，是由Bradford于1976年建立的。该方法的原理是，带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用。考马斯亮蓝G250（Coomassie brilliant blue G250），是一种甲基取代的三苯基甲烷，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的蕞大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由游离状态下的棕红色变为蓝色。并且在一定浓度范围内，稳定的染料-蛋白复合物的OD值与蛋白质含量呈线性关系。通过分光光度计或者酶标仪以标准品蛋白做标准曲线，随后检测目标蛋白595nm波长处的吸光值，即可换算出目标蛋白浓度。2、特点：简单便捷：仅需一种反应试剂即可完成检测，操作十分便捷，完成一个样品的测定只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性蕞好，不用考虑时间的限制。灵敏度：例如Abbkine的蛋白质定量试剂盒（Bradford法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，蕞低检测蛋白量达到5ug。反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量。优点： Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，如：K+ 、Na+ 、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP 和β-巯基乙醇等。缺点：由于蛋白-染料稳定复合物之间是分子间作用力，故Bradford法会受到表面活性剂如：去污剂、1N的NaOH 、SDS、Triton X-100，Tween 20等的干扰。除此之外，不同靶标蛋白中碱性氨基酸（范德华力作用）以及芳香族氨基酸（疏水作用）含量不一，对考马斯亮蓝的结合能力差异较大；而且随着蛋白浓度增加，线性关系会出现偏差。注意：由于高浓度洗涤剂会影响检测结果的可靠性，必须确保样品中的SDS的浓度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween 20,60,80低于0.06％。检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质，前者采用考马斯亮蓝G250，后者采用考马斯亮蓝R250，G250和R250分子基本骨架一样，但是G250多了两个甲基，与蛋白反应迅速，染胶慢且脱色困难，故用于蛋白定量；R250与蛋白反应较缓慢，染胶较快且易于洗脱，故用于PAGE胶染色。通过以上两种蛋白定量的方法的对比，我们可以发现对于BCA法和Bradford法，每一种方法都有自身的优势和缺陷，因此针对同一样本采用不同的方法进行检测，检测结果也可能出现偏差。所以我们在使用时，应当根据实验条件挑选蕞合适的检测方法，这样实验数据才会更可靠!