微生物细胞培养，简称微生物培养，包括原核细胞培养（细菌培养）和真核细胞培养（霉菌培养和酵母培养）。这些细胞小、且具有细胞壁，细胞周期非常短，如细菌每20-30min增殖1次。　　植物细胞培养指原生质体培养。未考虑分离出原生质体的植物细胞培养，无论是游离的单细胞或组织块，都称作植物组织培养。　　动物组织细胞培养包括接种单细胞悬液进行的培养、接种组织块进行的培养。传代细胞如细胞株、细胞系，通常采用接种单细胞悬液进行的培养，是动物细胞培养常见的方式。原代细胞是指来源于动物组织的细胞团块，往往包含多种细胞类型，并且细胞与细胞之间的细胞质膜有紧密联系。如果培养时不需分离组织中的细胞，直接用组织块进行的培养就是组织培养。如果需要制备成单细胞悬浮液，再接种培养，则属于一原代细胞培养。　　一、细胞型微生物培养　　细胞型微生物包括原核细胞类微生物和真核细胞类微生物。细菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体和立克次氏体等一般属于单细胞原核生物，放线菌是菌丝生长，其菌丝由多细胞组成，但每个细胞往往含多套核物质，属于无隔菌丝。酵母一般是单细胞真核生物，霉菌往往是多细胞真核生物。霉菌菌丝多数时候是有隔菌丝，每个细胞一般含1个细胞核或2个以上的细胞核。　　（一）培养目的　　根据培养基物理性状的差异，分为3种类型：①液体培养，用于增菌培养、鉴别培养等目的；②固体培养，这种培养的目的有增菌、分离、鉴别、保藏等；③半固体培养，一般用于鉴别和增菌目的。　　（二）培养形式　　在液体培养类型中，常见发酵管培养、发酵罐培养、摇瓶培养、多孔板培养等形式。在固体培养类型中，培养皿平板、克氏瓶（扁瓶）平板、试管斜面为常见形式。　　（三）培养仪器　　原核细胞培养所用的培养箱是生化培养箱或厌氧培养箱，前者用于好氧菌培养，后者用于厌氧菌培养，厌氧培养需要钢瓶提供食品级氮气。霉菌培养箱用于霉菌培养，能提供较高的相对湿度，气密性也比较高。　　二、植物组织细胞培养　　植物组织培养是指通过无菌操作分离植物体的一部分，即外植体，接种到培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其产生完整植株的过程。植物组织培养主要有原生质体培养、悬浮细胞培养、花药培养、组织培养、器官培养等形式，其中最常见的是愈伤组织培养。　　（一）培养目的　　由于植物细胞具有全能性，植物组织细胞培养的各种类型均可经过诱导分化形成愈伤组织，发育形成新植株。植物组织培养技术不仅用于快速繁殖，而且有着相当广泛的用途。这些应用包括单倍体育种、种质保存、生理学研究和基因转化等。　　（二）培养类型　　1．植物原生质体培养　　植物细胞培养，狭义上仅指植物原生质体培养，广义上包括植物原生质体培养和植物组织培养。　　脱除细胞壁后的植物细胞称为原生质体。植物原生质体培养是将来源于某个植物器官的组织块中的细胞，用纤维素酶或果胶酶等降解细胞壁，离心收集得到单细胞悬液，然后接种培养。其特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA;②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。　　2．植物组织培养　　包括茎尖分生组织或愈伤组织培养。其中，诱发产生的愈伤组织，在条件适宜情况下，可培养出再生植株。用于以下目的：①研究植物的生长发育、分化和遗传变异；②进行特定品种的克隆，即无性繁殖；③制取特定植物组织细胞的代谢产物。　　3.悬浮植物细胞培养　　在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。　　4．花药培养　　也称单倍体培养。通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完全纯合的植株或品种。　　5．植物器官培养　　植物器官培养是指将植株的胚、花药、子房、根或茎在体外进行的培养。　　（三）培养条件　　人工培养条件，即人工环境，包括：①提供能量来源的光照条件；②保证新陈代谢的温度条件；③提供气一水平衡的湿度条件；④提供生物原料来源的培养基；⑤避免环境微生物污染的无菌环境。人工环境模仿了植物的自然环境，即光照、温度、湿度、土壤和完整植株体内无菌环境。　　光照、温度的选定通常依据所培养植物的生态习性，习惯上采用暗培养与光照培养(8h/d,30001x)相结合交替进行全程的培养，温度控制在25-28℃范围。湿度在组织培养中不需特意地调整，因为培养容器中的相对湿度几乎达到100％，因此，如何控制人工培养环境的重点和难点在于培养基的选择和配制。　　1．培养基　　植物培养基是从无土栽培的营养液发展而来的，在某种意义上可理解为模拟土壤。最初的培养基是马铃薯浸出液，随着植物生理学和生物化学研究的深入，培养基的构成越来越复杂，成分越来越多。　　当琼脂、明胶支持物的发现并且应用到培养基中时，固体培养基随之诞生。固体培养基是组织培养基中最常用的一种培养基类型。不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的，大多在5-6.5范围，一般培养基pH控制在5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1-2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。无论培养目标设计是针对细胞生长还是针对代谢产物的积累，其培养基主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。　　(1)碳源蔗糖或葡萄糖是常用的碳源，果糖比前两者差。其他的碳水化合物不适合作为单一的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可增加培养细胞的次生代谢产物量。　　(2)有机氮源通常采用的有机氮源有蛋白质水解物（包括酪蛋白质水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。有机氮源对细胞的初级培养的早期生长阶段有利。L-谷氨酰胺可代替或补充某种蛋白质水解物。　　(3)无机盐类大量元素和微量元素通常使用无机盐代替，铁盐通常以鳌合铁的形式出现。对于不同的培养形式，无机盐的最佳浓度是不相同的。通常在培养基中含大量元素的无机盐浓度控制在25mmol/L左右。硝酸盐浓度一般采用25-40mmol/L，虽然硝酸盐可以单独成为无机氮源，但是加入铵盐对细胞生长有利。如果添加一些琥珀酸或其他有机酸，铵盐也能单独成为氮源。培养基中必须添加钾元素，其浓度为20mmol/L。磷、镁、钙和硫等微量元素的浓度在1-3mmol/L之间。　　(4)植物生长激素大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。植物激素在组织培养中具有无可动摇的核心地位，包括五大类，即生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、乙烯类和生长抑制素类。在植物组织培养中最常用的是生长素和细胞分裂素。分裂素和生长素通常一起使用，促使细胞分裂、生长。生长素在植物细胞和组织培养中可促使根的形成，最有效和最常用的有吲哚丁酸、吲哚乙酸和萘乙酸，分裂素通常是腺嘌呤衍生物。　　(5)有机酸加入丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且耐受钾盐的能力至少提高到10mmol/L。三羧酸循环中间产物，同样能提高低接种量的细胞和原生质体的生长。　　(6)复合物质通常作为细胞的生长调节剂，如酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁。目前这些物质已被已知成分的营养物质所替代。在许多例子中还发现，有些抽提液对细胞有毒性。目前仍在广泛使用的是椰子汁，在培养基中浓度是1-15mmol/L。　　2．培养器皿　　培养器皿是强调植物组织细胞培养物的形态，有试管、三角烧瓶、罐头瓶、培养皿、扁身培养瓶、凹面载玻片、L型管和T型管等种类。　　3．培养外环境　　植物组织细胞培养需要光照、温度、湿度等条件，满足此类条件的培养箱是光照培养箱、大型的人工气候箱、人工气候室或植物生物反应器。　　三、动物细胞培养　　（一）培养类型　　1．依据培养细胞来源动物分类　　分为无脊椎动物细胞培养和脊椎动物细胞培养。　　(1)无脊椎动物细胞培养指来源于多孔动物门、腔肠动物门、环节动物门、节肢动物门、软体动物门和棘皮动物门的细胞培养。　　无脊椎动物的细胞培养研究晚于哺乳动物，由于无脊椎动物细胞在形态、结构和功能以及营养需求等方面的特殊性，其细胞培养多数停留在原代培养和有限细胞系水平上。　　节肢动物门可分为3个亚门7个纲，其中的甲壳纲、蛛形纲、多足纲、昆虫纲的种类多，分布广，某些种类可供药用，主要代表有虾、蟹、昆虫。从1961年至今，已建立昆虫细胞系800余株。　　(2)脊椎动物细胞培养这些脊椎动物从低级到高级包括鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类。　　脊椎动物细胞培养开展较早，细胞系建立比较完善。哺乳动物细胞培养研究起步早，研究较多，其生物学特性更接近于人体天然产物，是目前生物技术产品研究开发的重点。　　20世纪80年代WHO明确了哺乳动物传代细胞可用于生物制品生产以后，该领域的细胞培养在生物技术药物的研发中获得了长足的发展。据文献报道，已批准上市的生物技术药物中70％是由哺乳动物细胞产生的。　　2．依据细胞生长特性分类　　一般分为贴壁培养和悬浮培养。　　3．依据培养目的分类　　原代培养、传代培养、克隆化培养、扩大培养等。　　（二）培养条件　　1．培养基　　常用的有含血清培养基和无血清培养基，一般是合成培养基，有各种型别的商品培养基供应，如干粉培养基和液体培养基。含血清培养基通常使用胎牛血清、新生牛血清或小牛血清，一般添加量为5%-20%。　　2．培养器皿　　常用培养器皿包括培养皿、培养方瓶、多孔细胞培养板等种类。　　3.培养仪器　　开放性的培养使用专业的CO2培养箱，为动物细胞的生长提供温度、湿度与pH保证，其中，CO2浓度的恒定对稳定培养液的pH至关重要。　　除常用的CO2培养箱以外，生产中还需要动物细胞生物反应器、细胞工厂或滚瓶机等仪器或大型设备。　　4．镜检仪器　　倒置生物显微镜是不可或缺的镜检仪器，用于观察培养物的生长状况，检查是否有微生物污染，初步判断是何种细胞型微生物污染。　　四、微生物细胞、植物细胞与动物细胞在培养上的主要区别　　在生物技术中，人们已经利用细菌、丝状真菌的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质、氨基酸等产物，但是很多有重要价值的生物物质，如毒素、疫苗、干扰素、单克隆抗体、色素、香味物质等，必须借助于动物细胞、植物细胞的大规模培养来制备。　　如果对微生物细胞、植物细胞或动物细胞在培养上的异同点有一定的了解，将帮助学习者更好地掌握动物细胞的基本条件和要求，为哺乳动物细胞培养建立一定的理论基础。

制作培养基真真是微生物实验室的家常便饭，培养基配成后一般需测试并调节pH，还须进行灭菌，培养基由于富含营养物质，易被污染或变质，配制过程中有多个注意事项和操作要点需要我们掌握，接下来就一起看看吧。首先，什么是培养基?培养基，是指供给微生物、植物或动物(或组织)生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)、维生素和水等几大类物质。培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。其次，培养基的种类。培养基种类很多，根据配制原料的来源可分为自然培养基、合成培养基、半合成培养基;根据物理状态可分为固体培养基、液体培养基、半固体培养基;根据培养功能可分为基础培养基、选择培养基、加富培养基、鉴别培养基等;根据使用范围可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基、真菌培养基等。最后，培养基配制须知。培养基配成后一般需测试并调节pH，还须进行灭菌，通常有高温灭菌和过滤灭菌。培养基由于富含营养物质，易被污染或变质。配好后不宜久置，最好现配现用。玻璃器皿的清洗在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。1、新购的玻璃器皿除去包装沾染的污垢后，先用热肥皂水刷洗，流水冲净，再浸泡于1～2%的工业盐酸中数小时，使游离的碱性物质除去，再以流水冲净。对容量较大的器皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部表面均沾有盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒置于洗涤架上将水空干，即可使用。2、用过的玻璃器皿凡确无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用后可随时冲洗，吸取过化学试剂的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。有可能被病原菌污染的器皿，必须经过适当消毒后，将污垢除去，用皂液洗刷，再用流水冲洗干净。若用皂液未能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。洗液的主要成份是重铬-酸钾和浓流酸，其作用是将有机物氧化成可溶性物质，以便冲洗。洗液有很强的腐蚀作用，使用时应特别小心，避免溅到衣服、身体和其他物品上。培养基制备的基本方法和注意事项1、培养基配方的选定同一种培养基的配方在不同着作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。2、培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。3、培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方面军做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。4、培养基各成份的混合和溶化培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。5、培养基pH的初步调正因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显着的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终PH，保证培养基的质量。PH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。6、培养基的过滤澄清液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显着沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至55~60°C的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入1~2个鸡蛋的蛋白，强力振摇3~5分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121°C加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。7、培养基的分装培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎(现试管一般多有用螺旋盖者)。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。8、培养基的灭菌一般培养基可采用121°C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50°C左右的培养基中。琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55℃-60℃时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。9、培养基的质量测试每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24~48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。10、培养基的保存培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。

一、微生物学及微生物学检验实验室的规则在进行微生物学实验时，须时刻牢记实验的对象是病原微生物，任何疏忽都可能导致严重的后果，不仅自身有可能招致感染，且有可能将病原微生物传给他人。因此决不能有丝毫侥幸心理，冒任何不必要的危险。进入实验室时必须遵守下列规则。1.进实验室时必须穿白大衣﹒离室时脱下反折，白大衣要经常清洗消毒。2.每次实验后均要用肥皂洗手，必要时用消毒药水泡手。3.书包、衣物等勿带入实验室，必要的文具、实验指导、笔记等带入后，放在指定的地方。4.每次实验后均用消毒药水擦洗工作台面，并用紫外线灯照射过夜。5.在实验室内不准吃东西、喝饮料和吸烟，不可把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头面等部位。6.进入实验室要保持安静，禁止高声谈话，不准打闹嘻笑。7.必须按照指定的方法，小心地处理传染性材料、培养物和污染的物质，要正确地使用存放污染器材的各种消毒容器。8.接种环使用前后必须进行烧灼灭菌。9.必须小心地避免任何有菌材料的溅出，若不慎污染了工作台、手、眼、衣服和地面等处，应立即报告老师，以便及时作适当处理。10.培养物和传染性材料须放在工作台的安全部位，尽可能保持台面的清洁整齐。11.爱护公物，合理使用实验材料和器材，如不慎损坏了某些器具，应及时报告老师，听候处理。12.实验完毕后清理台面，将需培养的标本及时故入培养箱。关闭水、电、煤气和门窗后离开实验室。二、实验室意外的紧急处理办法1.皮肤破损∶先除去异物，用蒸馏水或生理盐水洗净后，涂2%红汞或2%碘酒。2.烧伤﹔局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。3.化学药品腐蚀伤∶若为强酸，先用大量清水冲洗，再以5%碳酸氢钠溶液洗涤中和，强碱腐蚀伤时先以大量清水冲洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗涤中和。若受伤处是眼部，经过上述步骤处理后，再滴入橄榄油或液体石蜡1～2滴。4.菌液误入口中∶应立即吐入消毒容器内，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口﹔并根据菌种不同，服用抗菌药物预防感染。5.菌液流洒桌面∶将适量2%～3%来苏尔或0.1%新洁儿灭倒于污染面，浸泡半小时后抹去。若手上有活菌，亦应浸泡于上述消毒液3分钟后，再用肥皂和水清洗。6.火警∶如发生火警疫情时须沉着处理，切勿慌张，应立即关闭电闸和煤气阀门。如酒精、乙醚、汽油等有机溶液起火，切忌用水扑救，可用沙土等扑灭火苗。

提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰， DNA质量一直不高，如何消除多糖的影响？参考见解：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA成胶冻状。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比较高，可用以下方法试一试：1、 在 DNA 未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：100 mmol/LTris -HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次。2、 使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。3、 沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。4、 多糖和 DNA 的共沉淀物进行再分离。如用 TE缓冲液反复清洗共沉淀 物，将清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂糖电泳，切下 DNA 部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。还 有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖 。上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上减低 DNA 的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对 DNA 具有 特异性吸附的树脂来纯化 DNA。曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱 ，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G ，或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA。血样4度保存了2月，现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA，有什么解决办法？参考见解：按照常规的酚/lv仿法不可能提不出来，下面是参考方法：1、 先洗出白细胞，最好有1毫升以上血液。2、 加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。3、 加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀，50℃水浴过夜。4、 用等体积的（酚，lv仿，yi戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min离心收集水相。5、 取水层，加入3倍体积-20℃预冷无水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥将DNA溶于适量水中。CTAB法提取水稻基因组DNA， TE 溶解后琼脂糖胶电泳检测，点样孔附近有一条明显的主带。用MBI 公司产的限制性内切酶酶切过夜，鉴定时发现DNA已经被完全切烂，只在溴酚蓝前存在微弱smear状产物。换用酶，更换EP管，灭菌水之后重复几次，结果还是如此。拿其他人的DNA 做对照，酶切结果正常。用异丙醇将DNA 重新沉淀，换了TE溶解，检测主带仍旧清晰，可是用酶切之后DNA还是被切烂。为什么？参考见解：1、 公司的酶不行。2、 如做酶切，DNA最好不用异丙醇（因其不易挥发）而用无水乙醇沉淀。3、 酶量大或作用时间太长了。建议重提DNA，取少许用超纯水溶解（非TE），按照说明书进行酶切。要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性减少DNA的降解；要得到全血基因组DNA，可以先用分层液密度梯度离心将淋巴细胞分离吗？这样做，与沉淀全血细胞然后破坏红细胞得到的结果有何差异？参考见解：1、 觉得还是先分离细胞好，因为DNA和RNA大都是在细胞核内，有红细胞反而不太好。从血里面提RNA，用淋巴细胞分离液先分离有核细胞的，效果还是不错的。2、 现在提取全血的DNA,也就是提取淋巴细胞中的DNA，用密度梯度离心，只是富积淋巴细胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的话，没必要。3、 如果对基因组的要求不高，可以试试这个方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加无菌重蒸水500μl；10 000r/分钟离心3分钟，弃净上清；加20μl 5mol/L KI，旋涡振荡30秒;0.9%NaCl 100μl,150μllv仿/yi戊醇(24∶1)，振荡30秒；10 000r/分钟离心5分钟，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加异丙醇60μl，轻轻混匀，10 000r/分钟离心5分钟，弃上清；加冷无水乙醇1000μl，10 000r/分钟离心5分钟；弃去无水乙醇，37℃烤干；50μl无菌重蒸水或TE，混匀溶解备用。从经福尔马林处理后的组织标本中提取DNA可以吗？参考见解：可以的。100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的吗？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以吗？每次在用酚lv仿yi戊醇抽提后，上层里面都是絮状的蛋白质，离心几次都沉淀不下来，请问是哪里出了问题？参考见解：一般来说，蛋白酶的作用是将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。而溶菌酶的作用是破坏微生物细胞壁，二者作用各异，不可替代。对于实验中的蛋白问题，建议离心后先用竹签挑出蛋白，小心吸取上层清液，再重复抽提几次试试。一般植物DNA提取的时候都不加蛋白酶K，这样提出来的DNA链上的组蛋白等未被蛋白酶消化，不是很难除去吗？那DNA是不是不纯？可以用来酶切吗？参考见解：蛋白酶k的主要作用并不是消化组蛋白，而是消化细胞，在动物细胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物细胞的较易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：1、 消化组蛋白，释放出DNA。2、 消化DNAse，提高DNA分子量。建议还是加蛋白酶k为好，这样提出来的 DNA分子量会高一点，且更纯。提白粉孢子的总DNA，白粉孢子比较小，直接在研磨中加液氮研磨可以吗？参考见解：液氮研磨的方法应该可行的，做动物组织，植物组织多采用这种方法，植物纤维一样可以用液氮研磨，要有耐心，边加液氮边研磨，研磨好后再抽提，应该是可以的。在CTAB法提取DNA时，有一些品种没有DNA析出，是什么原因？参考见解：1、 用预冷的异丙醇来沉淀试试，同时研磨的时候要研的非常非常的细。2、 没有看到析出物并不代表没有沉淀，可以继续下一步试验，溶解的时候少加一点儿。3、 高离子强度下DNA与CTAB能形成共沉淀。可能DNA就这样留在沉淀里了。提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，怎样更好的抑制内源核酸酶的活性？参考见解：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。用试剂盒对农田土壤的的微生物群落DNA进行提取，虽然总DNA提出来了，可是用细菌的通用引物进行PCR的时候却怎么也扩不出来，请有没有什么好的办法可以解决这个问题？参考见解：环境特别是土壤的样品成分复杂，尤其是有腐殖酸具有和DNA类似的性质，因此用一般的国内试剂盒无法提纯。应当选用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。洗涤后硅胶膜上仍有杂色残留？参考见解：细胞裂解不充分，裂解液和样品要快速充分混匀。洗涤产物中DNA量很少或没有？参考见解：1、 样品中细胞或者病毒浓度低。2、 裂解液和样品混合不均匀造成细胞的裂解不充分。3、 蛋白酶K活性下降造成细胞裂解的不充分。4、 温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全，尽量把组织切成小块，延长温浴时间，使裂解物中没有颗粒状物残留。5、 在上柱前，裂解物中没有加乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇。6、 DNA没有有效洗脱，提高洗脱效率，可将离心柱在加入洗脱液后在室温静止至少1min，再离心。7、 洗脱液pH不合适，低pH值会减少DNA产率，确保洗脱液pH在7.0－8.5之间。8洗脱体积太大，超过200ul洗脱体积所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。

众suo周知，海藻由于富含多糖，DNA提取是一大难题，以下是在试验过程中收集的海藻DNA制备方法，经试验验证可行，现在贴出来，以觞众战友。一、可大量培养的海洋细菌1、取1ml目的菌菌液至1.5ml的EP管中，5000r/m离心5分钟弃上清，菌体加入500μl水洗涤一次，5000r/m离心5分钟，弃上清，向菌体中加入200μl悬浮缓冲液。2、在200μl悬浮缓冲液中加人55℃Tirs饱和酚200μl和10%的SDS 45μl混匀，在微型蜗旋混和仪上混匀，55℃温浴15分钟，并且不断振荡混匀。3、12000r/m离心5分钟，取上层水相移至新的EP管中。4、加入等量的lv仿/异戊醇抽提，12000r/m离心5分钟，转移上层水相至新管，反复抽提至界面澄清。5、取上层水相加入0.1倍的3M醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇混匀于-20℃放置2h沉淀DNA。6、12000r/m离心20分钟，沉淀DNA弃上清，用预冷的的70%的乙醇洗2次，在室温下晾干，加入40μl无菌水溶解，-20℃保存。本方法用于海洋假单孢菌、以及部分兰细菌（蓝藻）可行。二、从海水中制备细菌/浮游生物的混合DNA海洋浮游生物生物量较小，往往需要采集大量的海水样本，过滤收集特定粒径的浮游生物。这里介绍的是一种简单、快速、实用的符合环境指示基因PCR扩增需要的浮游生物模板DNA制备方法。1、取40 μL水样，与等体积0.25 mol/L NaOH混合，并于25 ℃温育过夜。2、99 ℃加热10 min，冷却至室温，简单离心收集溶液，依次加入8 μL 1 mol/L HCl，20 μL 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和10 μL 2% （v/v，体积分数）Triton X-100，混合并离心。3、将混合溶液再次在99 ℃加热10 min。4、制备的模板DNA溶液pH值 在8到9之间，可直接用于PCR扩增反应，不需要其它纯化处理。本方法用于海洋弧菌可行。三、褐藻Approximately 500mg of fresh leaves were ground in liquid nitrogen, transferred to the lysis buffer (1.5% CTAB, 75mM Tris-HCl, 1.5mM EDTA, 1.0M NaCl, 0.5mg/ml RNase A), and incubated for 30 min at 65℃. Proteinase K (final concentration of 10 mg/ml) was added and incubation continued for 30 min at 37℃. An equal volume of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) was added, mixed and the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. Approximately 500μl of upper aqueous layer was transferred to a new tube and 50μl of 10% CTAB (10% CTAB, 0.7 M NaCl), an equal volume of phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) was added, mixed and the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. The upper aqueous layer was transferred to a new tube and an equal volume of 1% CTAB (10% CTAB, 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA) was added, mixed and the sample centrifuged at 1,000g for 10 min. The DNA was precipitated. The DNA was washed with 70% ethanol. Then the DNA pellet was air-dried and redissolved in TE (Tris-EDTA) buffer.本方法用于鼠尾藻，可行。四、红藻1、取1g藻体，用蒸馏水洗净，加入大约2ml提取缓冲液[4% SDS, 0.05 M Tris. HCl，pH8.0, 0.1M EDTA, 0.2MnaCl]， 在0℃冰浴中充分研磨后，加蛋白酶K(终浓度100ug/ml)，在50℃水浴 间断震荡3.5-4小时。2、15,000 rpm离心10min，取上清液，加等体积的酚抽提, 15,000rpm离心10min。3、取上清液，再以酚/lv仿/异戊醇(25:24:1)及lv仿抽提，15,000rpm离心10min。4、取上清液，加入二倍体积的无水乙醇使DNA沉淀，离心，用70%的乙醇洗沉淀两次。5、干燥后，溶解在50ul无菌TE(10mMTris, 0.1mM EDTA,PH8.0)中，-20℃储存备用。本方法用于紫菜孢子体、紫菜配子体、江蓠、龙须菜可行。五、甲藻1、取对数生长期的培养物，在 4 ℃下用 冷冻离心机6000 rpm离心 6 min，收集藻细胞。2、收集的藻细胞放于液氮中冷冻半个小时后，在研钵中研磨成粉末，转移到 1.5mL 的灭菌离心管中，加入总体积 700μL 裂解缓冲液(100mM EDTA, pH 8.0；10 mM Tris-HCl, pH 8.0；1% SDS；200 μg/mL Protease K)放于55 ℃温浴 3 h，其间不时摇动。3、待溶液澄清透亮裂解完全后，用一倍体积的平衡酚抽提一次, 吸取上清转移至另一灭菌管中; 上清用一倍体积的平衡酚：lv仿（25:24）抽提一次，吸取上清移至另一灭菌管中；上清再用一倍体积的平衡酚：lv仿：异戊醇（25:24:1）抽提一次，吸取收集上清；收集的上清液加入十分之一体积 3 M 醋酸纳和两倍体积冰预冷的无水乙醇，-20 ℃过夜放置。4、第二天12000 rpm离心20min后弃去上清，DNA 沉淀用 70%的乙醇洗涤两次，晾干。5、最终溶解于 50 μLTE 缓冲液 (10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 mM EDTA)。本方法用于塔玛亚历山大藻、原甲藻可行。六、蓝藻（以前在reply过，现在集中到这里）solution I： 100 mM NaCl, 30 mM Tris.Cl （pH 7.8）, 10 mM EDTAsolution II：0.1 M NaCl，0.2 M蔗糖，10 mM EDTA裂解液： 0.25 mM EDTA, 0.5 M Tris.Cl, （pH 9.2），2.5% SDS，10 mM ?-巯基乙醇TAE： 40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTATE： 20 mmol/l Tris. Cl (8.0), 1 mmol/l EDTA (8.0)1、称取1 g干藻粉置于eppendorf 管中；2、加入0.5 ml solution I，振荡1 min；3、 10,000 rpm离心1 min，弃上清；4、重新加入0.5 ml solution I洗涤，收集沉淀；5、用0.6 ml solution II悬浮沉淀后，加入0.2 ml 裂解液，剧烈振荡1 min；6、55 ?C水浴1 h；7、加入等体积的酚/lv仿/异戊醇抽提两次（10,000 rpm, 8 min）；8、用等体积的lv仿/异戊醇（10,000 rpm, 8 min）抽提1次后收集上清；9、 加入1/10体积的3 M NaAc（pH 5.2）和2倍体积的无水乙醇；10、室温沉淀20 min, 10,000 rpm离心8 min；11、70 %乙醇洗涤沉淀除盐两次并吹干；12、50 ?l ddH2O溶解沉淀；13、 加入RNaseA去RNA，电泳检测后- 20 ?C保存备用。本方法用于螺旋藻、节旋藻可行。

　　PCR产物的直接纯化：一、原理PCR产物一般都含有过量的引物、 Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程,因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多,商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验中, Buffer PCR-A促使大于100bp的DNA--pian断选择性地吸附到 silica膜上。经 Buffer W. BufferW2洗涤去除残留在sica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后,吸附到sica膜上的DNA--pian断经微量水或 Eluent洗脱下来,即可用于各种分子生物学的操作。二、材料与方法1、材料PCR产物2、仪器、用具恒温孵育器(65C)、离心机、移液器、1.5ml离心管3、试剂Buffer_PCR -A Buffer w1；已加无水乙醇的 Buffer V2 Eluent或去离子水4、方法(1)在PCR反应液中加入3倍体积的 Buffer PCR-A若需加入的 BufferPCR-A不足100ul,则加入100ul。(2)将DNA --prep Tube置于2 -ml Microfuge Tube中,将步骤(1)中的混合液移入DNA -prep Tube I中,5500rpm离心1min。(3)弃滤液,将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube中,加入500 ul Bufer W1,5500rpm离心1min。(4)弃滤液,将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube中,加入700山已加无水乙醇的 Buffer V2,5500rpm离心1min,以同样的方法再用700山己加无水乙醇的 Buffer\2洗涤一次。(5)弃滤液,将DNA -prep Tube置回到原2 -mi Microfuge Tube中1400opm离心1min(6)连滤液一并弃掉收集管,将DNA -prep Tube置于一新的1.5ml离心管中,在sia膜中央加入25-30 ll Eluente或去离子水(65℃预热)(7)室温静置2min,1400opm离心1min洗脱DNA。(8)取5山样品,1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果PCR产物切胶回收:1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,计算凝胶重量。(100mg凝胶,计100ul体积)(尽量缩短暴露UV灯下的时间）。2、加入3个凝胶体积的 Buffer DE-A(600uD,混合均匀后,于65°C加热,直至凝胶完全熔化。3、加0.5个 Bufifer DE-A体积的 Buffer DE-B(300uD,混合均匀,当分离的DNA--pian段小于400bp时,加入1个凝胶体积的异丙醇。4、吸取3中的混合液,转移到DNA制备管(置于2ml离心管中),12,000×g离心1min弃滤液。5、将制备管置回2ml离心管中,加500 ul Buffer W,12,000×g离30sec弃滤液。6、将制备管置回2ml离心管中,加700 ul Buffer W2,12000×g离心30sec弃滤液。重复一次。7、将制备管置回2ml离心管中,12,000Xg离心1min彻底去除残余的液体。8、将制备管置于1.5ml离心管中,在制备膜中央,加25~30ul65 Eluent或去离子水,室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA

　　一．原理　　DNA--pian断的分离与回收是基因工程操作中的一项重要技术，例如可收集特定酶切片断用于克隆或制备探针，回收PCR产物用于再次鉴定等。回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会大大增加前期的工作量。　　本实验采用的是V-GENE公司的DNA凝胶回收试剂盒，其原理是：在凝胶融化液（Buffer DE-A）中凝胶块被迅速融化并释放出DNA。加入高离液序列溶液（Buffer DE-B）后DNA--pian断被选择性吸附到silica膜上。经Buffer W1、Buffer W2洗涤去除残留在silica膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到 silica膜上的DNA--pian断经微量水或Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学实验。　　二．材料与方法　　1 材料　　PCR产物（未经纯化）　　2 仪器、用具　　电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、微波炉、台式离心机、移液器、恒温孵育器（55-65℃）、1.5ml 离心管　　3 试剂　　1×TAE电泳缓冲液；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心操作] ；琼脂糖；6×加样缓冲液；NJ 缓冲液；DNA洗脱缓冲液；SPW洗涤缓冲液　　2.4 方法　　(1) 按常规方法于2%琼脂糖凝胶进行电泳。　　(2) 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。　　(3) 称量凝胶重量，以1mg=1μl换算凝胶体积。　　(4) 加入3个凝胶体积的NJ缓冲液　　(5) 悬浮均匀后于55℃-65℃加热7min，期间每2—3min摇晃一次，直至凝胶块完全融化。　　(6) 把DNA—琼脂糖溶液加到一个Mu-Pu DNA回收纯化柱上，并把柱子装在一干净的2ml收集试管内，14000rpm离心1ml，弃去流出液。对于体积大于700μl 的样品，则分别加到不同的柱子上，每次700μl。　　(7) 用700μl无水乙醇稀释的SPW洗涤缓冲液洗涤柱子，加入柱子中后静置2-3min。室温下14000rpm离心1min。　　(8) 弃滤液，以同样的方法再洗涤一次。　　(9) 把柱子装在一个灭菌干净的1.5ml 离心管上，加入30-50μl的DNA洗脱缓冲液或无菌去离子水到柱基质上，14000rpm离心1min以洗脱出DNA。　　(10) 取3μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。　　注：PCR产物的纯化选用直接纯化法还是胶回收法主要取决于PCR产物。若PCR产物电泳时为单一条带，可采用直接纯化法，即将酶、dNTP等多余物质去掉便可；若PCR产物电泳时为多条带，则要根据需要回收特定条带，此时须选用胶回收法。

　　PCR产物的检测方法：　　琼脂糖凝胶电泳　　这是实验室最chang用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。　　用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。　　（1）制胶　　琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml 0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。　　（2）加样和电泳　　上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。　　（3）检测　　将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。　　聚丙烯酰胺凝胶电泳　　聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。　　聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA--pian段的有效范围：　　(1)制胶　　在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。　　制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。　　不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：　　在加入TEMED和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，完全注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。　　（2）加样和电泳　　上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的DNA Marker。　　以2-10V/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭电源，将胶片取出。　　（3）银染　　分开两块玻璃板，将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml 0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min，吸去AgNO3液，用双蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。

洁净室（无菌室）的使用管理要做到以下工作：1、洁净室（无菌室）要符合规范要求：无菌室应采光 良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。面积一般不超过10m2，不小于5m2；高度不超过2.4m。由1—2个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间和缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18—26℃，相对湿度45%—65%。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板 内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（2—2.5w/m3），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达40uw/m2。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。2、建立使用登记制度在登记册中可设置以下项目内容：如使用日期、时间、使用人、设备运行状况、温度、湿度、洁净度状态（沉降菌数、浮游菌数、尘埃粒子数 ）、报修原因、报修结果、清洁工作（台面、地面、墙面、天花板、传递窗、门把手）、消毒液名称等。3、建立使用标准操作规范（SOP）并严格管理:SOP内容至少要有以下几点：（1）规定净化系统使运转时间要求每次实验前应开启净化系统使运转至少1h以上，同时开启净化台和紫外灯。（2）物品进入洁净室（无菌室）基本要求：凡进入洁净室（无菌室）的物 品必须先在第一缓冲间内对外部表面用消毒剂消毒灭菌，再经物流缓冲间、传递窗1h以上，及无菌空气吹干后送入无菌室。注意带纤维、易发尘物品不得带进净化实验室。无菌室内固定物品不得任意搬出。（3）人员进入洁净室（无菌室）要求：实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、带手表、戒指等首饰；不得吃东西、嚼口香糖。应清洁手后进入第一缓冲间更衣，同时换上消毒隔离拖鞋，脱去外衣，用消毒液消毒双手后戴上无菌手套，换上无菌连衣帽（不得让头发、衣等暴露在外面），戴上无菌口罩。然后，换或是再戴上第二副无菌手套，在进入第二缓冲间时换第二双消毒隔离拖鞋。再经风淋室30s风淋后进入无菌室。（4）温湿度观察要求：观察温度计、湿度计上显示的温湿度是否在规定的范围内，并作为实验原始数据记录在案。如发现问题应及时寻找原因，及时报修和及时报告实验室主管，并将报修原因和结果记录归档。（5）沉降菌落计数与浮游菌测定要求：在每次实验同时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数，将结果记录在使用登记本上，并作为实验环境原始数据记录在实验报告上。每周1次，或在无菌检查等必要时，在每次实验同时对操作室和净化台进行浮游菌测定，将结果记录在使用登记本上，并作为实验环境原始数据记录在实验报告上。（6）消毒要求：无菌室每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液（常用消毒剂的品种有：5—20倍稀释的碘伏水溶液、0.1%新洁尔灭溶液、1：50的84消毒液、75%乙醇溶液、3%碘酒溶液、5%石炭酸（来苏儿）消毒溶液、2%戊二醛水溶液、尼泊金乙醇消毒液（处方：对羟基苯甲酸甲酯21.5g；对羟基苯甲酸丙酯8.6g，75%乙醇10ml）等，所用的消毒剂品种与使用要进行有效性验证方可使用，并定期更换消毒剂的品种）擦拭操作台及可能污染的死角，方法是用无菌纱布浸渍消毒溶液清洁超净台的整个内表面、顶面、及无菌室、人流、物流、缓冲间的地板、传递窗、门把手。清洁消毒程序应从内向外，从高洁净区到低洁净区。逐步向外退出洁净区域。然后开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1—2h，以杀灭存留微生物。在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌30min。（7）其他要求：如遇停电，应立即停止实验，离开无菌室。关闭所有电闸。重新进入无菌室前至少开启机房运转1h以上。4、洁净度检查的要求与方法：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法。（1）沉降菌检测方法及标准：以无菌方式将3个营养琼脂平板带入无菌操作室，在操作区台面左、中、右各放1个；打开平板盖，在空气 中暴露30min后将平板盖好，置32.5℃士2.5℃培养48h，取出检查，3个平板上生长的菌落数平均小于1个。（2）浮游菌检测方法及标准：用专门的采样器，宜采用撞击法机制的采样器，一般采用狭缝式或离心式采样器，并配有流量计和定时器，严格按仪器说明书的要求操作并定时校检，采样器和培养皿进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，使用的培养基为营养琼脂培养基或药典认可的其他培养基。使用时，先开动真空泵抽气，时间不少于5min，调节流量、转盘、转速 。关闭真空泵，放入培养皿，盖上采样器盖子后调节缝隙高度。置采样口采样点后，依次开启采样器、真空泵，转动定时器，根据采样量设定采样时间。全部采样结束后，将培养皿置32.5℃士2.5培养48h，取出检查，浮游菌落数平均不得超过5个/m3。每批培养基应选定3只培养皿做对照培养。无菌操作台面或超净工作台还应定期检测其悬浮粒子，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测，并根据无菌状况必要时置换过滤器。5、定期进行洁净度再验证：定期（每季度、半年、1年）或当洁净室设施发生重大改变时，要按国家标准GB/T16292-16294-1996《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》进行洁净度再验证，以确保洁净度符合规定，保存验证原始记录，定期归档保存，并将验证结果记录在无菌室使用登记册上，作为实验环境原始依据及趋势分析资料。并定期对洁净室的环境检测数据进行趋势分析和评估，根据评估结果，了解洁净室设施环境质量的稳定状况及变化趋势，决定是否有必要修订相应的警戒和纠偏限度。6、定期更换新的紫外灯管、更换净化系统的初效、中效、高效头：定期（至少每年1次）更换新的紫外灯管，以确保紫外灯管灭菌持续有效。并同时在使用登记本上做好更换记录，定期归档保存。至少2年1次，或按洁净度验证实际情况，定期更换初效、中效、高效头。以确保净化系统的功能持续有效，并同时在使用登记本上做好更换记录，定期归档保存。7、使用过程中应尽可能减少人员的走动或活动：平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，同向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。8、洁净度不符合规定时立即停止使用：发现洁净度不符合规定时，应立即停止使用，寻找原因，彻底清洁、必须经洁净度再验证符合规定后，才再使用，并同时将情况记录在无菌室使用登记册上，定期归档保存。9、对进入的外来人员或维修人员进行指导和监督：非微生物室检验人员不得进入洁净室（无菌室），对必须进入的外来人员或维修人员要进行指导和监督。10、洁净室（无菌室）的日常管理：建立安全卫生值日制度，一旦发现通风系统、墙壁、天花板、地面、门窗及公用介质系统等设施有损坏现象，要及时报告并采取相应的修复措施，并保存记录及时归档。从洁净室（无菌室）环境中检测到的微生物应能鉴别至属或种，保留鉴别实验原始记录及菌种，作为无菌生产、无菌检查洁净室环境质量、消毒剂有效性评估及污染源调查的依据，并且也是为无菌检查阳性结果的调查提供第一手资料。

试剂、器皿使用管理制度1.试剂、器皿应有专人保管，分类存放，并定期检查使用及保管情况。领用时需填写记录，过期或失效试剂要经审核后作报废处理。2.实验室内保存的少量易燃易爆试剂要放在远离加热操作台的阴凉通风处保管。3.剧毒、危害及易制du品试剂应存放在仓库的专柜内，由两人以上人员保管，领用时要填写相关记录。4.称取化学试剂的器皿应洗涤干净，分开使用。固体试剂的取用遵循“只出不进，量用为出”的原则；液体试剂的取用遵循“只准倾出，不准吸出”的原则。5.挥发性强的试剂必须在通风橱内取用。使用挥发性强的有机溶剂时要注意避免明火，决不可用明火加热。6.纯度不符合要求的试剂，必须经提纯后再用。7.配制各种试剂和标准溶液必须遵守操作规程，配后立即贴上标签，注明名称、浓度、配制日期、有效期和配制人，以免拿错用错。小编提醒您使用和保管各种试液和标准溶液应按照《试剂、标准溶液的使用和保管规定》执行。8.不得使用过期试剂。实验室内务注意这11点1、制定内务管理程序。分为不同的工作区域，针对不同的工作区特点，不同的工作区域的内务管理可以不同。2、在工作面不放置过多的实验室耗材。实验耗材放置在zhi定的位置，最好和相关仪器放置在一起，工作面放置的耗材过多一是不安全，二是耗材比较容易污染损坏。3、应时刻保持工作区整洁有序。做好工作区域的卫生，工作区域实施、仪器摆放按照一定的顺序摆放。4、应zhi定专人使用经核准的方法进行内务工作。若果有必要，内务工作需要按照一定的方法进行，特别涉及到生物安全，放射等危害健康的实验室。5、如果需要，不同风险区的内务程序和装备不应混用。针对如微生物、放射性等危害健康安全的内务，各个区域的程序和装备不同，不要混用这些装备。6、在安全处置后对被污染的区域和可能被污染的区域进行内务工作。7、制定日常清洁（如消毒灭菌）计划。8、zhi定专人监督内务工作，定期评价内务工作的质量。9、实验室的内务规程和所用材料发生改变时应通知实验室负责人。10、实验室规程、工作习惯或材料的改变可能对内务人员有潜在危险时，应通知实验室负责人并书面告知内务管理负责人。11、发生危险材料溢洒时，应启用应急处理程序。

1）进入实验室的学生必须接受安全教育，自觉服从管理，严格遵守实验室的各项规章制度和规定，严格遵守仪器设备的操作规程。2）实验前要认真阅读教材，实验参考书和有关参考资料，做好实验预习报告，并按照任课教师的要求做好实验前各项准备工作。部分实验室需要穿着必要的规范服装。3）进入实验室后，要严格服从实验教师的指导，按照zhi定座次就位，签名，遵守安全规则，严禁穿背心、吊带装、拖鞋、高跟鞋等进实验室；严禁吸烟、吐痰、乱扔纸屑，不在实验室进食，饮水。4）开始任何实验操作前，需了解所有物理、化学、生物方面的潜在危险及相应的安全措施。使用化学药品前应先了解常用化学危险等级、危险性质及出现事故的应急处理预案。5）实验进行过程中，不得随意离开岗位，要密切注意实验的进展情况。6）进行可能发生危险的实验时，要根据实验情况采取必要的安全措施，如戴防护眼镜、面罩或橡胶手套等。7）按实验要求进行操作、调试、检测，如实记录实验数据。8）在实验中，如有疑难问题，要及时请教指导教师或实验室工作人员；学生不得随意调换或拆卸实验仪器设备，严禁私自拆卸仪器设备。9）若实验中出现异常现象，应立即停止实验并进行应急处理，由指导教师排除故障后方可继续实验。10）正确操作气体钢瓶，熟悉各种钢瓶的颜色和对应气体的性质。实验所产生的化学废液应按有机、无机和剧毒等分类收集存放，严禁倒入下水道。11）实验完毕后，应仔细检查水阀、电闸、煤气阀等，并将仪器、设备及连接线等放归原处。摆好桌椅、清洁环境，经指导教师检查同意后，方可离开实验室。最后离开实验室的工作人员应完成彻底检查。12）严禁不经许可将实验室的任何物品带出实验室。

测试样品是从整批商品中抽取出来作为产品质量检测所需，它的作用是，依据判定标准和测试结果并将生产出的产品作为买卖交易中商品的交付标准而做一判定。因此，任何一个检测实验室必须对测试样品进行规范管理。如何做好样品的管理，笔者认为，须从以下几个方面做好样品管理工作。测试样品的获取测试样品的获取一般有这么几个渠道，一是顾客送样，二是实验室接受委托，到采样现场进行样品的采集，将采集的样品做为实验室测试样品。这个环节是基础，无论是客户送样还是实验室自己采集样品，都要认真对待。特别是客户委托对产品进行判定的情况下，一定要在样品获取环节将工作做细。一旦因为样品的代表性差，而对产品批质量做出错误的判定，那将给实验室带来很大的麻烦和损失。特别是实验室接受采样委托，到客户现场进行样品采集时，要严格按照采样标准和客户约定的技术要求，做好采样操作和记录，包括样品的详细信息，采样时的环境条件，采样照片或者音视频，样品封签，都必须一一记录。测试样品的流转实验室获取测试样品后，要尽快对测试样品进行测试。样品进入实验室后，按照样品管理程序，对样品进行编号登记，由样品管理员完成上述工作后，将样品按照测试项目的先后，将样品传递到测试实验室。在这个过程中，样品管理员和测试人员对样品的交接和流转一定得仔细认真，不可出现差错。样品的保存样品保存作为实验室管理的重要一环，实验室都很重视，也比较规范。这里要重点讲到的是，保存的环境条件。一些样品在保存中，对存贮条件要求较高，温度、湿度、微生物、细菌，洁净程度等都有要求，一旦存储的环境条件不满足样品的保存条件，在不符合条件的环境下保存样品，样品就会很快变质。如果对改变后的样品进行测试和判断，实验室的责任风险将是必然，因此，必须对样品的保存环境进行控制。针对样品的存贮要求，实验室应配置相应的环境条件控制设施，以便存储温度、湿度、洁净度等满足存贮要求。样品的处置样品的处置，大多实验室做的很好。处置环节，在按照样品处置程序进行处置的情况下，笔者重点提醒的是，对于高价值样品一定要争的客户的处置同意，必要时须有书面的合同约束，一旦发生纠纷可以较好的维护实验室自身利益。

在实验过程中取用固体样品和液体样品是我们常做的事，所以掌握药品及试剂的取用、称量和溶解就是非常必要的。固体药品的取用原则1．“三不”原则，即“不闻、不摸、不尝”；具体说就是：不要去闻药品的气味，不能用手触摸药品，不能尝试药品的味道。2．节约原则，即严格按照实验规定的用量取用药品；如果没有说明用量，一般按最少量（1～2mL)取用液体，固体只需盖满试管底部即可。最大量，液体不超过容器容积的1／3，固体不超过1／2。3．“三不一要”原则，即实验用剩的药品不能因为要 “节约”而放回原试剂瓶，这样做会污染试剂瓶中未使用的药品。因此，用剩的药品既不能放回原试剂瓶，也不能随意丢弃，更不能带出实验室，要放在zhi定的容器中。4．固体颗粒的取用(一横二放三慢竖)，一般用药匙；块状固体可用镊子夹取。先把容器横放,用镊子夹取块状药品或金属颗粒放在容器口,再把容器慢慢地竖立起来,使块状药品或金属颗粒缓缓地沿容器壁滑到容器底部,以免打破容器.5.粉末状药品的取用，取用时可以用药匙（或者纸槽）。操作要领是：“一斜、二送、三直立”。具体的操作是：先将试管倾斜，把盛药品的药匙（或者纸槽）小心地送入试管底部，再使试管直立起来。注：使用后的药匙或镊子应立即用干净的纸擦干净。液体药品的取用原则液体药品的取用：“多倒少滴”取用不定量(较多)液体—直接倾倒（一倒二向三挨四靠）a. 瓶塞必须倒放在桌面上【防止药品腐蚀实验台或污染药品】；b. 直接倾倒时瓶口必须紧挨试管口，试管45度，并且缓缓地倒【防止药液损失】；c. 贴标签的一面必须朝向手心处【防止药液洒出腐蚀标签】；d. 倒完液体后，要立即盖紧瓶塞，并把瓶子放回原处，标签朝向外面【防止药品潮解、变质】。取用少量的液体—使用胶头滴管a. 应在容器的正上方垂直滴入；胶头滴管不要接触容器壁【防止沾污试管或污染试剂】；b. 取液后的滴管，应保持橡胶胶帽在上，不要平放或倒置【防止液体倒流，沾污试剂或腐蚀橡胶胶帽】；c. 用过的试管要立即用清水冲洗干净；但滴瓶上的滴管不能用水冲洗，也不能交叉使用。取用一定量的液体—使用量筒a. 当向量筒中倾倒液体接近所需刻度时，停止倾倒，余下部分用胶头滴管滴加药液至所需刻度线；b. 读数时量筒必须放平稳，视线与量筒内液体的凹液面的最di处保持水平。(注意：俯视则读数偏大，仰视则读数遍小。)固体试剂的称量1.步骤：调零、放纸片、左物右码、读数、复位。使用托盘天平时，要做到：①左物右码：添加砝码要用镊子不能用手直接拿砝码，并先大后小；称量完毕，砝码要放回砝码盒，游码要回零。左盘质量=右盘质量+游码质量 即：药品的质量=砝码读数+游码读数若左右放颠倒了；药品的质量=砝码读数 － 游码读数②任何药品都不能直接放在盘中称量，干燥固体可放在纸上称量，易潮解药品要放在（烧杯或表面皿等）玻璃器皿中称量。注意：称量一定质量的药品应先放砝码，再移动游码，最后放药品；称量未知质量的药品则应先放药品，再放砝码，最后移动游码。溶液稀释的原则溶液稀释的原则是溶质量不变仪器：烧杯、容量瓶、玻璃棒、胶头滴管、分析天平、量筒1.计算 计算浓溶液的量，以及需要的水，或其他溶剂的量。2.取液 取适合浓溶液的量。3.移液 将浓溶液沿玻璃棒注入容量瓶中。4.洗涤 用蒸馏水洗烧杯2—3次，并倒入容量瓶中。5.定容 倒水或其他溶剂的至刻度线1—2cm处改用胶头滴管滴到与凹液面直。6.摇匀 盖好瓶塞，上下颠倒、摇匀，或采用玻璃棒搅拌均匀。7.装瓶、贴签。有一些在稀释的时候回大量放热的溶液，例如浓硫酸。在稀释的时候，一定要注意，将需要稀释的溶液慢慢的注入到水中，并且不断搅拌。这样才能避免溶液飞溅，使人受伤。药匙使用注意事项1.根据试剂用量不同，药匙应选用大小合适的。2.不能用药匙取用热药品，也不要接触酸、碱溶液。3.取用药品后，应及时用纸把药匙擦干净。4.药匙最好专匙专用，用玻璃棒制作的小玻璃勺子可长期存放于盛有固体试剂的小广口瓶中，无需每次洗涤。

对于实验室检测来说，采样、留样（包括成品留样和物料留样），样品采集应该按照何种原则来，留样应该如何管理？这些问题你是否考虑过？今天一起来看看检测室采样、留样及样品管理制度吧。1、目的为了保证分析数据、样品的准确性和具有可追溯性，便于抽查、复查、满足监督管理要求，分清质量责任，特制订本管理制度。2、依据标准本管理制度在安全采样方面依据：GB 3727《工业化学产品采样安全通则》；GB 4756《石油液体手工取样法》；GB 6678《化工产品采样总则》；GB 6679《固体化工产品采样通则》；GB 6680《液体化工产品采样通则》；GB 5491《粮食、油料检验 扦样、分样法》；GB 5524《植物油脂检验 扦样、分样法 》；GB 9695.19《肉与肉制品 取样方法》；GB 14699.1《饲料 采样》GB/T 5009.1《食品卫生检验方法 理化部分 总则》等标准。3、采样管理要求（1）根据检验计划实施采样。采样必须严格执行第二条规定的标准。采样人员要认真研究并严格按取样标准的规定实施取样操作，保证所取的样品具有代表性和真实性。（2）取样前，根据物料性质准备取样工具和相应的安全防护措施，对涉及人身安全的取样，操作时应特别注意做好防护工作。（3）取样必须现场管理人员，并要求一同前往取样点，由现场管理人员启封开盖。（4）到装配现场取样时，要注意现场作业环境，必要时找操作工配合采样，若现场环境恶劣，没有安全保证，可停止采样操作，并通知生产调度和工艺人员。如确因生产急需非采样不可，有关部门必须采取有效措施保证采样者的人身安全和所采的样品具有代表性和真实性。（5）涉及防爆区域采样，要求使用防爆工具，严禁使用其他不防爆工具。不得在雷电、暴雨期间或风力7级（含7级）的气候条件下进行采样作业。（6）取样完毕后，做好现场取样记录，贴好样品标签，标签内容包括：样品名称、来源、采样部位、批号、产地、采样日期和时间、采样者。（7）采得样品应立即进行分析或封存，以防变质和污染。4、留样管理要求（1）样品的保留由样品的分析检验岗位负责，在有效保存期内要根据保留样品的特性妥善保管好样品。（2）保留样品的容器（包括口袋）要清洁，必要时密封以防变质，保留的样品要做好标识，要按批次或先后顺序摆放整齐以便查找。（3）样品保留量：样品保留量要根据样品分析用量而定，不少于两次全分析量，一般液体为500ml－1000mL ；固体样品保留500－1000g。（4）样品保留时间一般为三个月。（5） 样品过保质期后，要按有关规定妥善处理。5、留样间管理要求（1）样品间要通风、避光、防火、防爆、专用。（2）留样袋要封好口，标识清楚齐全。（3）分类、分品种有序摆放。（4）样品间卫生清洁，要有专人管理样品间。（5）保存期限后，按样品处置程序进行处理。

　　血液标本放置时间对检验结果的影响　　1、对血清电介质浓度测定的影响，试验结果表明血清钾放置1h 后与即刻比较明显升高，差异有显着意义（ P　　2、 对乳酸浓度的影响，血样在室温下放置 15min ，乳酸浓度明显升高，高差异有显着意义（ P　　3 、对血糖测定结果的影响，血清葡萄糖因血细胞的糖酵解每小时会降低 7% ，故采血后应立即检测，如无条件，应及时分离血清。　　4 、对心肌酶谱的影响，试验结果显示肌酸激酶的活性随时间的延长而不断下降，乳酸脱氢酶由于红细胞的通透性改变，血清中酶活性不断上升，羟丁酸脱氢酶活性也在放置过程中不断上升，谷草转氨酶的活性影响不大。血标本如不能及时测定，有必要将血清分离出来保存。　　5 、对血氨测定结果的影响，试验结果显示标本放置不同时间血氨测定结果均较即刻测定明显升高，因此为了保证测定结果的准确性，采血后必须密封并立即送检。　　6 、采集的血液标本，要检测多种项目时，最好一种项目一管血液，防止标本污染。在不能分开时，要注意检验的顺序，如一管血液要检测生化和 PCR ，那必须先检测 PCR 后再检测生化，防止检测生化后的标本污染对 PCR 检测结果的影响。　　7、 各实验室的防寒、降温设备不同，因而应注意温度对检验标本的影响、温度达 30 ℃ 以上时，对一些试验项目有显着影响。　　据报道，测定总蛋白的标本在 30 ℃ 以上室温放置 8h 后，对结果就有影响， 24h 后更显着。 AST 及 ALT 在低温（ 4 ℃）下存放 48h ，分别减低 87% 与 83% ，在 30 ℃ 以上放置 6h ，分别增高 116% 与 129% 。 4 ℃ 放置 8h 以内测钠无明显影响， 48h 后则减至 97% ，室温（ 23 ℃）及高温（ 30 ℃） 时存放均有增高倾向，室温下放置 6h 增高显着。室温、低温及高温放置均可使血糖减低，低温下每小时减低 0.04mmol/L ，室温时减低 0.1mmol/L ，高温时减低 0.2mmol/L 。磷在低温时无变化，在室温下 8h 显示增高倾向， 24h 轻度增高， 48h 增高到 190% ，高温下 8h 增高到 126% ， 24h 及 48h 分别为 237% 和 328% ，显示了显着性增高。实践证明标本在一定温度下存放一定的时间对检验结果有明显的影响。

　　胎牛血清通常在细胞培养中作为基础生长培养基的添加剂，在细胞培养中，血清供应了丰富的高分子蛋白，低分子量营养物，疏水载体蛋白和其他体外细胞生长必要的成分如激素和粘附因子。同时，胎牛血清可以增加培养基的缓冲能力或中和有毒成分，起到保护细胞的作用。在细胞培养过程中是否选择添加血清，主要根据基础培养基化学成分，培养细胞的类型和培养体系而定。今天给大家分享的是牛血清实验中常见的问题解析！搬起小板凳快来围观吧！　　血清实验中常见的问题解析：　　一、 如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损？　　将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。　　长时间储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。因此，推荐在-20℃以下储存血清，并避免反复冻融。　　建议血清应保存在-2O℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。　　二、血清中包含絮状沉淀，它们是什么，怎么处理？　　沉淀包含纤维蛋白和脂蛋白。这是正常特性，不会影响产品性质。要除去沉淀，离心血清(400g，1-2分钟)或者简单的让其沉淀在瓶子底部，将血清小心的转移到另一个无菌瓶里(一般不建议采用过滤的方法除去沉淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤)。大多情况轻轻摇动沉淀并加热至37℃就会再溶解。所以，使用产品时要摇动并加热血清至37℃，沉淀会自然消失。　　三、 培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？　　一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。　　四、 为什么要热灭活血清？　　加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学 研究，培养ES细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。　　五、 有必要做热灭活吗？　　实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。　　而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显着的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物 的分裂扩增。　　非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量!　　六、细胞培养 中出现黑点是污染吗？如何处理？　　一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，首先，要肉眼观察培养基是否混浊，然后，在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。　　七、小牛血清和胎牛血清有何区别与注意事项？　　来源不同：胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰怀孕母牛的时候,通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清，新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。　　组份与比例不同：两者所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组份与比例不同，用途与用法不同：某些细胞必需胎牛血清才能生长，而有些细胞只需小牛血清即可，使用浓度不同，一般在5%-10%，有特殊要求的浓度在20%。　　血清保存和使用须注意：血清应保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超过一个月。　　解冻血清时 ，应先将血清至于2-8℃冰箱，并经常摇匀使之溶解，然后至室温放置使之升温，绝对不可将冷冻的血清直接放入37℃水浴或者温箱中，如放在37℃解冻，颜色加深，粘稠度也会增加，血清在解冻和热灭活后，应按用量分装并于-20℃保存，避免反复冻融。

1、透析血清分子量小于10,000的分子如氨基酸、葡萄糖、盐离子和未结合的蛋白均被移除。透析血清主要用在进行营养成分优化和标定特定成分进行研究的实验中。2、碳吸附血清使用活性和右旋糖苷去除血清中的亲脂类(lipophilic)物质，如某些激素、细胞因子、生长因子等，去除作用对分子量大小并无区分。碳吸附胎牛血清常用于体外培养研究验证激素的作用效果。3、去外泌体血清适用于收集细胞分泌的外泌体时使用。4、低IgG血清用于研究抗体、病毒和病毒反应、细胞表面抗原表位。5、四环素血清应用于使用敏感四环素诱导表达系统的细胞培养(Tet-on, Tet-off)，以及其它对四环素敏感的实验中。6 、IR (辐照)钴60伽马辐照剂量在3.5Mrad. 通过直接与间接作用将生物大分子（如核酸）键结破坏，人畜用药物/疫苗，及对微生物负荷(Bioburden)要求Z高水平的实验。7、HI (热灭活)处理血清56℃, 30Min, 破坏补体，确保细胞与抗体结合不会发生裂解。8、胚胎干细胞（ES）血清是从多个批次的胎牛血清筛选出特定批号，适用于人及小鼠胚胎干细胞、成体干细胞及原代细胞长期培养。9、间充质干细胞（MSC）血清从多个批次的胎牛血清筛选出特定批号，经过骨髓，脂肪组织及脐带来源的间充质干细胞的细胞活性严格测试，通过传代及分化比例测试。其他动物血清10、马血清10%马血清可代替FBS用于支持SRBC的体外抗体应答, 常与牛血清结合或单独作为哺乳动物细胞培养的补充培养基。11、猪血清猪血清在染色体研究中表现非常出色，可用于淋巴细胞培养, 疫苗生产（生产支原体）, 中和脂质体包裹的腺相关病毒（AAV）, 用于诱导大鼠肝纤维化, 作为酶联免疫吸附试验（ELISA）中的标准阴性参考。12、兔血清正常兔血清可作为免疫分析的阻断剂和对照。在免疫组织化学和免疫细胞化学方面，各种研究均采用20%或1:200稀释兔血清作为阻断剂。13、羊血清用于生物医学研究的大多数细胞系和原代培养物上，FBS的合适替代物，病毒分离和鉴定，病毒学研究。用作鱼类细胞培养的有效NBCS替代物。    可成功地代替胎牛血清在生长培养基中长期用于环孢蘑菇的体外繁殖。

生物化学分析的准确性，除取决于分析方法的选择是否合适以及全部分析工作是否严格按照要求进行外，在很大程度上还取决于样品的采取是否有最佳的代表性。如果不遵循科学方法采样，样品缺乏代表性，即使分析工作严谨无误，也得不到正确的结论。因此，必须对样品的采取、处理和保存给予足够的重视。从大田或实验田采回的样品，一般数量较大，称为“原始样品”。再按原始样品的种类（如根、茎、叶、花、果实等）分别选出“平均样品”。再根据分析任务的要求和样品的特征，从平均样品中选出供分析用的“分析样品”。由此可见，分析样品的获得须经一系列复杂而仔细的步骤，在实际工作中一定要以高度认真负责的态度对待。（一）原始样品及平均样品的采取、处理与保存原始样品及平均样品的采取，按分析目的可有两种方法：一种是为了鉴定品质而进行的混合取样；另一种是按植物生育期取样。1．混合取样法：一般种子样品可用混合取样法。把代表一定面积的收获物先经脱粒，然后在木板或牛皮纸上铺成均匀的一层，再按对角线把样品分成4 个三角形，取两个相对的三角形的样品，而将另外两个三角形的样品淘汰。如此操作，一直淘汰至所要求的数量为止。这个取样法叫做“四分法”，这样取得的平均样品在实验室经适当处理即可制成分析样品。豆类及油料种子选取平均样品的方法与谷类种子取样法相同。注意，样品中不要有未成熟的种子或混杂物，不要将簸出去的种子加到平均样品中。如果直接从田里采取植株样品，在生长均一的情况下，可按对角线或沿平行的直线等距离采样。如果植株长势不均匀，则应根据生长的强弱，按比例采取大约5 个点的样品后混合。每个样点取的植株数随植物的种类和采样的时间有所不同。如小麦等密植型作物或其它作物幼苗，可按面积采取或采取样品束（一束样品的植株数视需要而定），象玉米、甘蔗等作物，每个样点采取一株就够了。选取甘薯、马铃薯、甜菜、萝卜等块根、块茎的平均样品时，必须注意到大、中、小三类样品的比例。然后纵切取其一部分（二分之一至四分之一）组织作为平均样品，否则就不具有代表性。一般蔬菜样品也按对角线法采取。番茄样品应选择簇位相同、成熟程度一致的果实，取果实的1/4 组成平均样品。采取苹果、梨、桃、柑橘等水果的平均样品时，一般选1～3 株果树为代表，从植株的全部收获物中选取大、中、小果实以及向阳、背阳部分的果实混合成平均样品。葡萄等浆果，采样时可在不同地点的5～10 株植物上的各个部位包括向阳、背阳以及上、下各部位采样。2．按生育期取样法：在幼苗期取样，因植株较小，采取的株数就比较多，尽管各种作物有所不同，总的原则是所取样品的干重应当是分析用的2 倍。植株逐渐长大，每次采取的株数也相应减少，但绝不能采单株作样品。在各个生育期取样时，都应作观察记录。取样地点一般在边行区，取样点的四周不应有缺株现象。取样后，按分析目的分成各个部分，如根、茎、叶、穗等，然后捆好，附上标签，分别装入样品袋。瓜果、蔬菜取回后因水分较多，容易霉烂，可在冰箱中冷藏，或用于干燥灭菌，或用酒精处理或烘干，以供分析之用。（二）分析样品的处理与保存采回的新鲜植株样品如果混有泥土，不应用水冲洗，可用湿布擦净，然后置空气流通处风干或烘干。烘干样品时，可把植株放入80℃烘箱中，以停止酶活动并驱除水分。烘干样品时，注意温度不能过高，以免把植株烤焦。最好不要晒，以免灰尘沾染或被风刮走。全植株样品应按照根、茎、叶、种子等分开。果实必须剖出时，要用锋利的不锈钢刀子，不允许将其中汁液流失。为了避免糖、蛋白质、维生素等成分的损失，可采用真空干燥或冷冻真空干燥法。风干或烘干的样品，根据其特点分别进行以下处理：1．种子样品的处理：一般谷物种子的平均样品可用电动样品粉碎机粉碎。事先要把机器内收拾干净，最初粉碎出的少量样品可弃去不用，然后正式粉碎，使全部样品通过一定筛孔的筛子，混合均匀，按四分法取出一定数量的样品细粉作为分析样品，贮存于干燥的磨口广口瓶中，同时贴上标签，注明样品的名称、编号、采取地点、处理、采样日期和采样人姓名等。长期保存时，标签应涂石蜡，并在样品中加适当的防腐剂。蓖麻、芝麻等油料种子应取少量样品在研钵内研碎，以免脂类损失。2．茎秆样品的处理：干燥后的茎秆样品也要磨碎。粉碎茎秆的粉碎机不同于种子粉碎机，其切割部分由几付排列方向相反的刀片组成。粉碎后的样品按上法保存。3．多汁样品的处理：一般多汁样品，如瓜果蔬菜等，其化学成分（糖、蛋白质、维生素等）在保存中易发生变化，往往多用新鲜样品进行各项测定。将它们的平均样品切成小块，放入电动组织捣碎机中打成匀浆，如果样品含水量较少，可按样品重量加入适量水，然后捣碎。样品量少时可用手持匀浆器或在研钵内研磨，必要时可在研钵内加少量石英砂。如果所测物质不稳定（如某些维生素和酶等），则上述操作均应在低温下进行。样品匀浆如来不及测定，可暂存冰箱内，或灭菌后密封保存。4．丙酮干粉的制备：在分离、提纯或测定某种酶的活力时，丙酮干粉法是常用的有效方法之一。该种方法是将新鲜材料打成匀浆，放入布氏漏斗，按匀浆重量缓慢加入10倍的低温冰箱内冷却到－15℃～－20℃的丙酮，迅速抽气过滤，再用5 倍冷丙酮洗3 次，在室温下放置1 小时左右至无丙酮气味，然后移到盛有五氧化二磷的真空干燥器内干燥。丙酮干粉的制备在低温下完成，所提丙酮干粉可长期保存于低温冰箱。用这种方法能有效地抽提出细胞中的物质，还能除掉脂类物质，免除脂类干扰，而且使得某些原先难溶的酶变得溶解于水。

一、如何区分不同级别的生物安全柜？生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。生物安全柜可分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级。Ⅰ级生物安全柜可保护工作人员和环境而不保护样品。气流原理和实验室通风橱一样，不同之处在于排气口安装有HEPA过滤器。一级生物安全柜本身无风机。Ⅱ级生物安全柜是目前应用最为广泛的柜型。 与Ⅰ级生物安全柜一样，Ⅱ级生物安全柜也有气流流入前窗开口，被称作“进气流”，用来防止在微生物操作时可能生成的气溶胶从前窗逃逸。与Ⅰ级生物安全柜不同的是，未经过滤的进气流会在到达工作区域前被进风格栅俘获，因此试验品不会受到外界空气的污染。 Ⅱ级生物安全柜的一个独特之处在于经过HEPA过滤器过滤的垂直层流气流从安全柜顶部吹下，被称作“下沉气流”。下沉气流不断吹过安全柜工作区域，以保护柜中的试验品不被外界尘埃或细菌污染。因此，所有的Ⅱ级生物安全柜都可提供工作人员、环境和产品的保护。Ⅲ级生物安全柜是为4级实验室生物安全等级而设计的，是目前世界上最高安全防护等级的安全柜。柜体完全气密，100%全排放式，所有气体不参与循环，工作人员通过连接在柜体的手套进行操作，俗称手套箱(Golve box)，试验品通过双门的传递箱进出安全柜以确保不受污染，适用于高风险的生物试验。二、Ⅱ级生物安全柜的分类及选型有哪些？Ⅱ级生物安全柜按排放气流占系统总流量的比例及内部设计结构，将其划分为A1、A2、B1、B2四个类型。A1型安全柜前窗气流速度最小量或测量平均值应至少为0.4m/s。安全柜内70%气体通过高效空气过滤器过滤后再循环至工作区，30%气体通过排气口的高效空气过滤器排出。安全柜内的污染气流经过高效空气过滤器过滤后可以排到实验室或经安全柜的外排接口通过排风管道排到大气中。A2型安全柜前窗气流速度最小量或测量平均值应至少为0.5m/s。70%气体通过HEPA过滤器再循环至工作区，30%的气体通过排气口过滤排除。安全柜内的污染气流经过高效空气过滤器过滤后可以排到实验室或经安全柜的外排接口通过排风管道排到大气中。安全柜的负压环绕污染区域的设计，阻止了柜内物质的泄漏。B1型生物安全柜前窗操作口流入气流的最低流速为0.50m/s，柜内气体中30%气体通过高效空气过滤器过滤后再循环使用，70%气体通过排气口HEPA过滤器过滤后通过专用风道排入大气中。所有被生物污染的部位均应保持负压，或被负压的通道和负压通风系统包围。B2型生物安全柜前窗操作口流入气流的最低流速为0.5m/s，柜内下降气流全部是由柜外供给，即安全柜排出的气体不再循环使用。柜内的气流经过滤后排入大气，不允许再进入安全柜循环或返流回实验室，可同时提供生物性和化学性的安全控制。所有污染部位均应处于负压状态或者被负压区包围。三、生物安全柜检测依据什么标准？生物安全柜检测现行的主要标准依据有：（1）欧盟EN 12469：2000《Biotechnology-Peformance Criteria for Microbiological Safety Cabinets》（2）美国NSF/ANSI 49—2002《Class II(Laminar Flow) Biosafety Cabinetry》；（3）JG 170-2005中华人民共和国建筑工业行业标准《生物安全柜》；（4）YY 0569-2011中华人民共和国医药行业标准《Ⅱ级生物安全柜》。鉴于生物安全柜危险的使用环境，在安装时以及以后每隔一定时间，要由具有CMA检测资质与能力的第三方检验检测机构按照规定对每一台生物安全柜的整体运行性能进行性能检测，以检查其是否符合国家及国际的性能标准保证使用者的安全。四、生物安全柜检测主要检测哪些指标？生物安全柜检测主要包括物理学检测和生物学检测两个方面，根据检测性质可分为首次检测、后续检测。除生物安全柜的一年一度的常规检测外，下列情况之一时，如安装后、移动后、检修后、更换过滤器后，也必须进行现场生物安全柜检测。按照《Ⅱ级生物安全柜》（YY0569-2015）、《生物安全柜》（JG170-2005）和《消毒技术规范》（2002年版）要求，Ⅱ级生物安全柜检测指标包括高效过滤器检漏、洁净度、下降气流流速、工作窗口进口平均风速、温升、气体流向、照度、噪声、振幅、紫外线灯强度。安装后、移动后、检修后、更换过滤器后还必须加测柜检漏和人员安全性、受度样本安全性和交叉感染。Ⅲ级生物安全柜还须检测静压差。五、使用生物安全柜有哪些注意事项？（1）超净工作台≠生物安全柜。超净工作台看似和生物安全柜非常相似，但超净工作台只保护工作区的样品免受外部环境污染，并不能保护操作人员。（2）请勿使用生物安全柜处理有毒、易燃、易爆等材料。（3）应避免使用明火。因明火产生的热效应会干扰生物安全柜操作区内的气流稳定，且火焰热气会影响滤器的寿命。如必须使用，可根据需要选取即用即燃式灭菌器具或微型接触式燃烧器。（4）请勿在生物安全柜内摆放过多物品，否则会影响安全柜气流和安全性能。（5）合理选择生物安全柜的安装地点。应当尽量远离外部气流干扰因素，例如门窗、空调通风口、人员过道以及其他实验室气流干扰设备（安全柜、通风橱等）。（6）生物安全柜中一般不需要紫外灯。如果使用紫外灯的话，应该每周进行清洁，以除去可能影响其杀菌效果的灰尘和污垢。（7）在安全柜使用前后，请按照程序为安全柜进行表面除菌。使用适当的消毒剂，例如70%的异丙醇溶剂擦拭安全柜的工作区表面，包括前后的近期格栅。（8）注意安全柜自净周期。开启关闭安全柜时，让安全柜自主运行3-5分钟的自净周期。这个自净程序可以清除安全柜的工作区域内可能存在的经空气传播的污染物。（9）确保安全柜在工作时前窗处于正确的额定操作高度。（10）正确着装为操作中提供必要保护。当进行高危险性操作，例如生物安全水平2+到3级操作时，应选用长袖、背面开口的隔离衣和两副手套，并确保外层手套套住隔离衣袖口。不能有暴露在外的肌肤。（11）在安全区域内进行操作。切勿阻塞工作区前后的通风格栅。尽量在工作区的中心部位进行操作。（12）遵循清洁区到污染区的操作原则。生物安全柜的工作区应该被依次划分为三个区域：清洁区、工作区和污染区。生物危害性废弃物袋应放置在污染区内；实验仪器和样品应放置在工作区域；而实验供给品应放置在洁净区内。在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行。六、如何判断高效过滤器需要更换?（1）风速变小。当检测发现洁净度指标正常、下降气流或流入气流流速变小时；或者设备在运行过程中，若设备发出声光报警且是因下降气流或流入气流流速低造成的(显示窗口分别所显示数值低于设计要求)说明过滤器堵塞己十分严重，风机转速己达到最大值，系统无论如何调整都无法达到规定的风速值，此时必须更换过滤器。（2）压力传感器报警。当压力指示器显示值大于170Pa时报警系统报警。（3）检测高效过滤器完整性发现有泄漏。（4）气流模式改变时。通过检测发现，垂直气流（下降气流）出现死角和回流，有烟雾从柜内泄漏出来，或进入柜内的烟雾有外逸时。（5）控制面板上的风机累计运行时间，如果达到10000小时，通常需要更换过滤器，但不是必须更换，还要考虑使用环境的洁净程度，使用习惯等。

近年来实验室事故频发，往事历历在目。吸取教训、总结经验，是预防事故发生的最好办法。目前，大部分实验室都存在着哪些安全问题?应对这些问题的解决方案又有哪些?实验室安全面临的问题技术方面存在的问题1. 规划设计考虑不周，造成安全隐患由于规划设计人员对各类实验室的功能要求缺乏一定程度的了解，尤其是对一些特殊实验室的特殊要求知之甚少，因此在实验室建设的规划设计中对设施和装备的安全要求考虑不周，工程设计上存在漏洞，包括人与机械、作业环境之间匹配不当等，造成了安全隐患。2.安装防护门窗，堵塞安全通道近年来，实验室内贵重实验仪器设备大量增加，为了防止这些设备被盗窃，不少实验室普遍加装护窗，增设全封闭的金属门，有的甚至将双向通道走廊的一头封闭，改为单向通道走廊。一旦发生意外，因通道严重受阻，逃生不畅，后果不堪设想。3.安全设施陈旧落后实验室安全资金投入严重不足，一是消防设施配备不足，不少现有设施因陈旧而无法使用;按规定，实验室应配置固定式灭火系统或移动式消防器具，但因资金缺乏而未配备或配备数量不足。二是实验室用房紧张。一些需要分开存放的物品不能做到分开存放，而且一些设备的安全操作距离也不够。三是环保设施不能满足要求。一些可能产生有毒气体的实验室未配备通风系统，仅用排气扇代替;一些应经过处理才能排放的废水，因设施不完善而放任自流;一些固体废物没有按照国家标准进行处理，作为一般垃圾外运，对社会安全造成隐患。四是缺乏应急动力供应系统。一些实验室设备在使用时不能突然停电，否则会造成设备损坏甚至报废，但因资金缺乏而未配备应急供电系统或双环路供电系统。五是不少高校因为资金问题而没有建立现代化的实验室监控系统，无法有效地做好“四防”工作。管理方面存在问题1. 实验室建设无安全审核制度在实验室的建设工程设计或改造项目中，没有对安全功能进行审核的程序和制度，就是有也不尽完善，以至某些工程完工后给使用者带来安全隐患。2. 安全管理体制不完善，安全责任不明确一是部分实验室安全工作的专门组织机构和体系，难以建立对整个实验室安全工作实行全面管理的领导体制，没有落实法定代表人是单位安全第一责任人的要求。二是部分单位没有专人负责实验室的安全工作，没有配备专职实验室安全员，无法层层落实管理职责，安全责任不明确。三是职能部门缺少专门的科室和专业技术人员，很难实现对实验室安全进行专业管理，与系部的实验室安全管理之间缺乏有效地衔接和必要技术指导。安全事故发生的原因及其应对措施实验室安全事故发生的原因主要为不安全环境和不安全行为，不安全环境是事故的间接原因，不良管理是事故的基本原因，而人的不安全行为是事故的直接原因。大小事故的结果都可能造成生命的伤害和财产的损失，都会影响正常的教学和科研工作。因此，实验室安全管理的中心内容就是防止人的不安全行为，消除物质环境的不安全状态，阻断事故连锁的进程而避免事故的发生。为避免事故的发生，应采取相应的措施。1.对安全环境因素对安全环境因素，要求实验室设计、仪器布局、试剂放置、气源、电源线路、电源功率、通风设置、防感染设置、下水管道、实验室废弃物处置、消防设施等应有合理的设计，制定和公布恰当的实验室安全级别。妥善保养一切通用的和个人用的安全防护用具，对其经常进行检查是非常重要的。2. 对人的不安全因素对人的不安全因素，不仅需要规范的管理制度，实验室安全操作规程，落实实验室安全责任人，更重要的是要使所有的实验室工作人员都应具备一般有关实验室安全、危险以及防止事故的知识。每一个在实验室里工作的人都应该认识到自己对实验室安全所负有的责任，如果发现实验室有任何不安全的因素时，应立即迅速而坚决地加以纠正。进入实验室工作的人员，在开始一项新的实验工作时，应事先了解操作过程中可能存在哪些危险，并预备好预防措施。实验室安全事故的主要类型1. 火灾性事故火灾性事故的发生具有普遍性，几乎所有的实验室都可能发生。酿成这类事故的直接原因是：(1)忘记关电源，致使设备或用电器通电时间过长，温度过高，引起着火;(2)操作不慎或使用不当，使火源接触易燃物质，导致着火;(3)危险化学品泄漏遇火源或热源引发爆炸起火;(4)供电线路老化、超负荷运行，导致线路发热，导致着火;(5)乱扔烟头，接触易燃物质，导致着火;(6)燃烧反应实验或失控化学反应导致的燃烧火焰或高温物质如加热过的坩埚引燃易燃物质;(7)加热用火如酒精灯、电炉等忘记关，致使物料逸出或烧干引发火灾等。2. 爆炸性事故爆炸性事故多发生在具有易燃易爆物品和压力容器的实验室，酿成这类事故的直接原因是：(1)违反操作规程，引燃易燃物品，进而导致爆炸;(2)设备老化，存在故障或缺陷，造成易燃易爆物品泄漏，遇火花而引起爆炸;(3)在实验时误操作导致的燃烧热能释放;(4)爆炸性物品受热或撞击，引发爆炸事故;(5)高压高能气瓶装置操作不当或不合格发生物理爆炸事故(6)生产工艺、设备或系统不完善，导致危险化学品爆炸;(7)密闭容器或狭小空间内进行化学反应，反应突然增加压力、泄漏等发生爆炸事故。3. 化学污染类事故这类事故主要表现在：(1)化学废液收集不当导致环境及地下水污染;(2)废水排放管路受阻或失修改道，造成有毒废水未经处理而流出，引起环境污染;(3)设备老化，存在缺陷和故障造成有毒物质泄漏或有毒气体排放不出，酿成中毒;(4)盛放挥发性的化学试剂瓶，用完后忘记盖盖。4.压力气瓶类事故这类事故主要表现在：(1)压力气瓶遇高温或强烈碰撞引起爆炸;(2)易燃气体在空气中泄漏达到一定浓度时遇明火发生爆炸;(3)有毒气体泄漏造成中毒和环境污染。5.药品类毒性事故这类事故主要表现在：(1)违反操作规程，将食物带进有毒的实验室，造成食物中毒;(2)配置或使用有毒试剂时，不在通风柜中操作，造成人体、皮肤吸收，引起慢性中毒;(3)设备设施老化，存在故障或缺陷，造成有毒物质泄漏或有毒气体排放不畅，酿成中毒;(4)有毒试剂不经减毒处理排放，从而引起环境污染。实验室安全管理对策1.健全实验室安全管理机构，明确管理责任实验室由于专业不同、门类不同，需要有专门的机构负责实验室安全方面的管理。从上至下要建立实验室的安全管理体系，有明确的安全管理层次和安全职责。2.重视安全基础性工作，加强安全标准化建设实验室安全的基础性工作是大力加强安全标准化实验室建设。着重从以下四个方面展开：(1)实验室安全运行组织管理标准化。主要是制定以实验室安全运行为目标的实验室安全管理全过程的各项详细的、可操作的管理标准。(2)实验室安全条件标准化。主要是保证实验室房屋及水、电、气等管线设施规范，实验室设备及各种附件完好，实验室现场布置合理、通道畅通，实验室安全标准齐全、醒目直观。实验室安全防护设施与报警装置齐全可靠。(3)实验室安全操作标准化。主要针对各实验室的单个实验或高档仪器设备制定操作程序和管理规范，实现标准和规范化操作。(4)实验室安全教育制度化。定期进行实验室的必要安全教育工作，做到“未雨绸缪，防患于未然”。同时做好实验室安全通报工作。3.加大实验室安全设施的投入，提高安全系数对现有的实验室在防火、防爆、防毒、防盗、防辐射、防传染等安全设施方面加大投资力度，根据实验室危险因素的具体情况，更新、改造、配备必要的劳动保护设施和用品，安装必要的实验消防、通风、防爆设施，以期及早发现隐患，杜绝事故发生。4.加强实验室安全教育，进行安全培训安全教育是防止事故发生的预防性工作。实验室管理层要充分重视实验室安全教育工作，制定安全教育制度和长期的安全教育培训规划，加大实验室安全教育的投入，定期组织进入实验室工作的教师和对学生进行系统安全技术知识学习的培训，强化安全意识，做好安全管理工作。建议应开设安全教育网页，开辟安全教育专栏，定期组织安全教育讲座，进行一些灭火、自救的演习，不断提高有关人员的安全技术水平，熟练掌握事故应急处理方法，使每一个在实验室工作和学习的人员都具备处置突发事件的能力。小结这是从实验室的技术和管理方面，从人员方面看多是由于化学知识匮乏、操作不规范、安全意识缺乏等原因造成，作为实验室管理人员，首先要规划好实验室分析人员的素质培训问题，因为实验室是“以人为本”的实验室，不管是先进实验室安全意识的培养、实验技能的掌握还是仪器操作、维护保养的培训，都能更好的避免安全事故的发生和确保实验室工作的安全运行。

　　生长是微生物与外界环境因素共同作用的结果。环境条件的改变，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；或者抵抗、适应环境条件的某些改变；当环境条件的变化超过一定极限，则导致微生物的死亡。　　为了抑制和消除微生物的有害作用，人们常采用多种物理、化学或生物学方法，来抑制或杀死微生物。常用以下术语来表示对微生物的杀灭程度。　　灭菌：用物理或化学方法杀灭物体上所有的微生物（包括病原微生物和非病原微生物及细菌芽胞、霉菌孢子等），称为灭菌。　　消毒：用物理或化学方法仅能杀灭物体上的病原微生物，而对非病原微生物及芽胞和孢子不一定完全杀死，称为消毒。用来消毒的药物称为消毒剂。　　防腐：防止或抑制微生物生长和繁殖的方法称为防腐或抑菌。用于防腐的化学药品称为防腐剂。某些化学药物在低浓度时为防腐剂，在高浓度时则成为消毒剂。　　无菌：指没有活的微生物存在。采取防止或杜绝一切微生物进入动物机体或物体的方法，称为无菌法。以无菌法操作时称为无菌操作。在进行外科手术或微生物学实验时，要求严格的无菌操作，防止微生物的污染。　　不同的微生物对各种理化因子的敏感性不同，同一因素不同剂量对微生物的效应也不同，或者起灭菌作用，或者可能只起消毒或防腐作用。在了解和应用任何一种理化因素对微生物的抑制或致死作用时，还应考虑多种因素的综合效应。例如在增高温度的同时加入另一种化学药剂，则可加速对微生物的破坏作用。大肠杆菌在有酚存在的情况下，温度从30℃增至42℃时明显加快死亡；微生物的生理状态也影响理化因子的作用。营养细胞一般较孢子抗逆性差，幼龄的、代谢活跃的细胞较之老龄的、休眠的细胞易被破坏；微生物生长的培养基以及它们所处的环境对微生物遭受破坏的效应也有明显的影响。如在酸或碱中，热对微生物的破坏作用加大，培养基的粘度也影响抗菌因子的穿透能力；有机质的存在也干扰抗微生物化学因子的效应，或者由于有机物与化学药剂结合而使之失效，或者有机质覆盖于细胞表面，阻碍了化学药剂的渗入。　　常见的影响微生物生长与死亡的物理、化学因素主要有：　　1.温度：　　温度是影响有机体生长与存活的最重要的因素之一。它对生活机体的影响表现在两方面：一方面随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快。在一般情况下，温度每升高10℃，生化反应速率增加一倍；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都较敏感，随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。因此，只有在一定范围内，机体的代谢活动与生长繁殖才随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。　　就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在零下12-100℃均可生长。而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。各种微生物都有其生长繁殖的最低温度、最适温度、最高温度和致死温度。　　最低生长温度：是指微生物进行繁殖的最低温度界限，如果低于此温度，则生长完全停止。　　最适生长温度：能够使微生物迅速生长繁殖的温度叫做最适生长温度，在此温度下，微生物群体生长繁殖速度最快，代时最短。不同微生物的最适生长温度是不一样的。　　最高生长温度：是指微生物生长繁殖的最高温度界限。　　致死温度：最高生长温度若进一步升高，便可杀死微生物，这种致死微生物的最低温度界限即为致死温度，致死温度与处理时间有关。　　微生物按其生长温度范围可分为低温微生物、中温微生物和高温微生物三类。　　1.微生物的生长温度类型　　2.氢离子浓度(pH)：　　环境中的酸碱度通常以氢离子浓度的负对数即pH值来表示。环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大，主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。　　每种微生物都有其最适pH值和一定的pH范围。在最适范围内酶活性最高，如果其他条件适合，微生物的生长速率也最高。大多数细菌、藻类和原生动物的最适pH为6.5-7.5，在pH 4-10之间也可以生长；放线菌一般在微碱性即pH7.5-8最适合；酵母菌、霉菌则适合于pH5-6的酸性环境，但生存范围在pH1.5-10之间。有些细菌甚至可在强酸性或强碱性环境中生活。　　微生物在基质中生长，代谢作用改变了基质中氢离子浓度。随着环境pH值的不断变化，微生物生长受阻，当超过最低或最高pH值时，将引起微生物的死亡。为了维持微生物生长过程中pH值的稳定，配制培养基时要注意调节pH值，而且往往还要加入缓冲物以保证pH在微生物生长繁殖过程中的相对稳定。　　强酸和强碱具有杀菌力。无机酸杀菌力虽强，但腐蚀性大。某些有机酸如苯甲酸可用做防腐剂。强碱可用作杀菌剂，但由于它们的毒性大，其用途局限于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。强碱对革兰氏阴性细菌与病毒比对革兰氏阳性细菌作用强。　　3.氧化还原电位：　　氧化还原电位(Φ)对微生物生长有明显影响。环境中Φ值与氧分压有关，也受pH的影响。pH值低时，氧化还原电位高；pH值高时，氧化还原电位低。　　各种微生物生长所要求的Φ值不一样。一般好氧性微生物在Φ值＋0.1伏以上均可生长，以Φ值为＋0.3伏－＋0.4伏时为适。厌氧性微生物只能在Φ值低于＋0.1伏以下生长。兼性厌氧微生物在＋0.1伏以上时进行好氧呼吸，在＋0.1伏以下时进行发酵。　　4.辐射：　　辐射是指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一个地方的能源。它们或是离子或是是电磁波。电磁辐射包括可见光、红外线、紫外线、X射线和Υ射线等。　　(1)紫外辐射 紫外线是非电离辐射，以波长265-266纳米的杀菌力最强。紫外辐射对微生物有明显的致死作用，是强杀菌剂，紫外杀菌灯管在医疗卫生和无菌操作中广泛应用。由于紫外线穿透能力差，不易透过不透明的物质，故紫外杀菌灯只适用于空气及物体表面消毒。　　(2)电离辐射 X射线与α射线、β射线和Υ射线均为电离辐射。在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。常用于一次性塑料制品的消毒，也用于食品的消毒。　　5.干燥：　　水分是微生物的正常生命活动必不可少的。干燥会导致细胞失水而造成代谢停止以至死亡。微生物的种类，环境条件，干燥的程度等均影响干燥对微生物的效果。休眠孢子抗干燥能力也很强，在干燥条件下可长期不死，这一特性已用于菌种保藏，如用砂土管来保藏有孢子的菌种。在日常生活中也常用烘干、晒干和熏干等方法来保存食物。　　6.渗透压：　　水或其他溶剂经过半透性膜而进行扩散的现象就是渗透。在渗透时溶剂通过半透性膜时的压力即谓渗透压。其大小与溶液浓度成正比。　　适宜于微生物生长的渗透压范围较广，而且它们往往对渗透压有一定的适应能力。突然改变渗透压会使微生物失去活性，逐渐改变渗透压，微生物常能适应这种改变。对一般微生物来说，它们的细胞若置于高渗溶液中，水将通过细胞膜从低浓度的细胞内进入细胞周围的溶液中，造成细胞脱水而引起质壁分离，使细胞不能生长甚至死亡。相反，若将微生物置于低渗溶液或水中，外环境中的水将从溶液进入细胞内引起细胞膨胀，甚至使细胞破裂。　　由于一般微生物不能耐受高渗透压，所以日常生活中常用高浓度的盐或糖保存食物，如腌渍蔬菜、肉类及蜜饯等。　　7.超声波：　　超声波具有强烈的生物学作用。超声波的作用是使细胞破裂，所以几乎所有的微生物都能受其破坏，其效果与频率、处理时间、微生物种类、细胞大小、形状及数量等均有关系。　　8.重金属及其化合物：　　一些重金属离子是微生物细胞的组成成分，当培养基中这些重金属离子浓度低时，对微生物生长有促进作用，反之会产生毒害作用；也有些重金属离子的存在，不管浓度大小，对微生物的生长均会产生有害或致死作用。因此，大多数重金属及其化合物都是有效的杀菌剂或防腐剂。其作用最强的是Hg、Ag和Cu。如：二氯化汞又名升汞，是杀菌力极强的消毒剂。0.1-1%浓度的硝酸银常用于皮肤的消毒。　　9.有机化合物：　　对微生物具有有害效应的有机化合物种类很多，其中酚、醇、醛等能使蛋白质变性，是常用的杀菌剂。　　酚：酚又名石炭酸。它们对细菌的有害作用可能主要是使蛋白质变性，同时又有表面活性的作用，破坏细胞膜的透性，使细胞内含物外溢。当浓度高时是致死因子，反之则起抑菌作用。　　甲酚是酚的衍生物。杀菌力比酚强几倍。甲酚在水中的溶解度较低，但在皂液与碱性溶液中易形成乳液。市售的消毒剂煤酚皂液（来苏尔）就是甲酚与肥皂的混合液，常用3-5%的溶液来消毒皮肤、桌面及用具等。　　醇：它是脱水剂、蛋白质变性剂，也是脂溶剂，可使蛋白质脱水、变性，损害细胞膜而具杀菌能力。乙醇是普遍使用的消毒剂，常用于实验室内的玻棒、玻片及其他用具的消毒。50-70％的乙醇便可杀死营养细胞；70%的乙醇杀菌效果最好，超过70%以至无水酒精效果较差。　　甲醛：甲醛也是一种常用的杀细菌与杀真菌剂，效果良好。纯甲醛为气体状，可溶于水，市售的福尔马林溶液就是37-40％的甲醛水溶液。　　10.卤族元素及其化合物：　　碘：是强杀菌剂。3-7%碘溶于70-83%的乙醇中配制成碘酊，是皮肤及小伤口有效的消毒剂。碘一般都作外用药。　　氯气或氯化物：这是一类最广泛应用的消毒剂。 氯气一般用于饮水的消毒，次氯酸盐等常用作食品加工过程中的消毒。氯气和氯化物的杀菌机制，是氯与水结合产生了次氯酸(HClO)，次氯酸易分解产生新生态氧，这是一种强氧化剂，对微生物起破坏用。　　11.表面活性剂：　　具有降低表面张力效应的物质称为表面活性剂。这类物质加入培养基中，可影响微生物细胞的生长与分裂。如肥皂、漂白粉、洗衣粉等。　　12.染料：　　染料，特别是碱性染料，在低浓度下可抑制细菌生长。由于这些染料具有选择性抑菌的特点，故常在培养基中加入低浓度的染料配制成选择培养基。例如：碱性三苯甲烷染料，包括孔雀绿、亮绿、结晶紫等，对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用。　　13．化学疗剂：　　能直接干扰病原微生物的生长繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物即为化学疗剂。它能选择性地作用于病原微生物新陈代谢的某个环节，使其生长受到抑制或致死。但对人体细胞毒性较小，故常用于口服或注射。化学疗剂种类很多，按其作用与性质又分为抗代谢物和抗生素等。

分子生物学实验最大的特点就是好上手、难做好。进行DNA、RNA相关的实验时，细节显得尤为重要。今天，远慕生物介绍3种鉴定RNA质量好坏的方法。从源头开始，把控实验。1. 为什么要确定RNA的质量与DNA不同，RNA是极为脆弱的，由于其单链结构，RNA的碱基和氢键全都暴露在环境中，极易被环境中的各种化学物质和RNA酶降解。一旦降解，后期的实验纯属浪费时间了，然而这一过程往往是不易察觉。良好的实验环境和准确的实验流程控制是保证实验成功的基本条件。外源性酶是影响实验的重要因素。RNA实验需要我们在实验流程中不断自查是否存在问题，而RNA质量检测就是重要的一环。如果RNA质量存在问题，后期的实验结果会惨不忍睹，什么样的都有。闲话不多说，下面就介绍3种评价RNA质量方法。吸光度法测RNA总量即紫外分光光度计检测，经常使用。280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液浑浊度、盐浓度和蛋白等有机物的值。我们只看OD260/OD280。理论上，纯RNA情况下的OD260/OD280的值为2，可接受的范围为1.8-2.0。纯的DNA情况下的OD260/OD280的值为1.8，可接受的范围是1.6-1.8。一般认为RNA中的蛋白或是其他有机物的污染是可以接受的，当R2.2时，说明RNA已经水解为单核酸。一般的，如果你能做到1.9-2.0之间，说明RNA纯度已经很高了。但是如果你采用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会＞2(一般应＜2.2的)。个人推荐的办法是严格采用阈值1.8-2.0作为判定标准，不符合的RNA样品丢弃，重新提取，这样才能最小化误差。电泳法谱测RNA完整性一般而言，RNA琼脂糖实验是为了检测RNA的完整性，但是我们也可以从中看出RNA的质量好坏。我们的目的并不是要检测RNA的分子量，RNA无需变性，所以采用普通的1%含EB琼脂糖凝胶(含EB)即可满足要求。跑胶结束后，在紫外灯的照射下，条带从上到下分别为28S、18S、5S，这是真核生物的特征。28S和18S 条带最明亮、清晰、条带边缘锐利，最重要的是28S条带的亮度大概是18S条带的两倍或者以上，这种情况RNA的质量是很好的，如果需要更细致一点，可能采用Image J测量一下条带的灰度值，其测量方法和蛋白一样。保温法RNA是否酶污染上面2种方法都是采用物理的方法进行检测，但是我们无法得知所抽提的RNA是否有RNA酶污染。很多人没有注意这一点，认为使用了无RNA酶实验器材，哪里还有RNA酶啊。事实就是这么悲惨！甚至认为这是相关试验失败的重要原因。毕竟，很少有人会意识并且验证这一点。RNA酶比较顽强，单纯加温也很难灭活，必须使用DEPC。实验室环境中其实存在很多RNA酶，这些酶大多来源于人的呼吸和唾沫。你可以保证自己带口罩实验，但是你可能很难要求同处一室的其他人都带上口罩。很多高质量的实验室会开通PCR专用实验间，他们的实验往往比较顺利。RNA保温实验原理:很简单，就是取一点样品，人为的升温并保持一段时间，接着通过琼脂糖跑胶的操作。如果存在RNA酶，那么RNA条带的28S和18S肯定模糊不清，而5S会发亮，并且条带拖尾现象严重。网上有一份RNA保温试验方法，还是比较好的。贴上来给大家看看:“从RNA溶液中吸取两份1000ng的RNA加入至0.5ml 的离心管中，并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中，保温1h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别，则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。”

菌落总数作为判定食品被细菌污染程度的标志，也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。今天，小编就和大家说说菌落总数检测中常见的一些问题。菌落总数知识1、食品中测定的菌落总数就是食品的细菌总数吗？不是的，菌落总数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、PH等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，36±1℃培养48±2h，能在平板计数琼脂平板上生长的细菌菌落总数，因此，厌氧或微需氧菌等，由于现有条件不能满足其需求，故难以繁殖生长。2、菌落总数的单位CFU和“个”有区别吗？菌落形成单位叫做CFU。CFU是形成菌落的个数，不等于细菌个数。比如两个相同的细菌靠的很近或粘在一起，那么经过培养这两个细菌将会形成一个菌落，此时就是2个细菌，1CFU。3、菌落总数超标会导致食物中毒吗？不一定，菌落总数测定是用来判断食品被细菌污染的程度及卫生质量，反应食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便被检样品做出适当的卫生学评价。4、菌落总数超标如何追溯？在日常抽检中发现产品菌落总数超标，可以从以下三个环节进行追溯：（1）生产环节如果在不合格食品同批次库存产品多次抽样检验，均出现菌落总数超标的情况，那极有可能是生产环节原辅料、人员、设备环境等受污染所影响；（2）储存运输对同批次其他产品进行多次抽样检验，均未检出菌落总数超标的现象，那么有可是出现在产品装卸搬运过程中；（3）储存摆放环节若在流通环节检出多种食品存在菌落总数超标的情况，则问题极有可能是未按照规定要求存储、摆放食品，致使微生物滋生。实验过程中的问题1、为什么平板计数琼脂需要调节pH？培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。平板计数琼脂是用来检测样品中的菌落总数的，而大部分细菌都是嗜中性的，所以需要调节培养基pH至7.0±0.2，保证细菌生长环境的适宜，从而确保检测结果的准确性。2、为什么菌落总数培养条件为36±1℃培养48±2h，而水产品要求30±1℃培养72±3h？对于未经过任何加工的水产品，其菌落总数培养条件为30±1℃培养72±3h；因为水中本身温度较低，未加工的水产品中微生物主要来源于水体，30℃、72h是水中微生物最适培养温度和时间。而加工水产品和其他产品培养条件都是36±1℃培养48±2h，其实就是产品本身的菌和加工过程中带入的菌的最适培养温度和时间不同的问题。3、如何保证检测结果的有效性？检验过程中需要做空白对照，用来判断培养基、稀释液、平皿或吸管是否存在污染。并做好定期检测空气洁净度，判断实验环境是否符合标准要求。菌落计数小问题1、菌落蔓延的原因及解决办法？菌落蔓延主要有两个原因，一是操作不当；二是样品中含有变形杆菌等运动性强的细菌。操作中需要注意3个关键点：（1）倾注培养基时摇晃平皿使其混合均匀，减少菌块；（2）样品稀释后，尽快倾注平板。从稀释到倾注结束时间控制在30 分钟之内，避免样液干涸造成菌落成团；平板凝固后马上倒置。（3）若样品中含有变形杆菌，则可以覆盖一层培养基。2、如何区分细菌菌落与食品颗粒？如果平板上食品颗粒与菌落形态较为接近，为避免和细菌菌落发生混淆，可多倾注一块平板置于4℃冰箱中放置，在计数时用于对照。另外也可以在已融化而保温在46℃水浴的PCA中加入0.5%TTC溶液，培养后食品颗粒不变色，细菌为红色。注意TTC的浓度不要过高，会有抑制细菌生长作用（食品检测一般不建议使用TTC，会有一定的抑菌效果）。3、异常现象平板如何进行菌落计数？我们通过以下查看：现象    计数方式无任何明显界限的链状菌落   作为一个菌落有几条不同来源的链    每条链均应按一个菌落计算片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀    半个平板的菌落数乘2代表整块平板的菌落数菌落总数是评价食品卫生质量的重要指标，其检测工作在某种程度上具有相当的不可比性，这就要求检测人员要严格执行科学的操作程序，保证科学、准确地得出符合样品实际的检测结果。

一、实验目的：1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时，也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。三、实验用品：1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料：人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2条件下培养。五、方法步骤：1、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡（1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。（2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200μl，使终浓度为1μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞（1）染色：将瓶中的细胞摇匀，取200μl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分钟。（2）滴片：取一载玻片，用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。六、注意事项：1、诱导培养HL-60细胞时间要准确。2、荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。

一、 目的和要求要求学会植物病原真菌、细菌、病毒和线虫的分离、培养和接种的一般方法，并掌握其基本原理；学习植物传染性病害研究中常用的接种方法，比较不同接种方法对病害发生发展过程与外界环境的差异。二、材料和用具新鲜的真菌和细菌病害材料（辣椒炭疽病果、水稻稻瘟病病叶片、水稻白叶枯病叶、烟草花叶病和番茄根结线虫病等）；番茄青枯菌/番茄、水稻稻瘟菌/水稻幼苗、水稻白叶枯病菌/稻苗、烟草花叶病/烟草  喷雾器、纱布、酒精灯、酒精缸、火柴、接种饵（针）、长镊子、玻棒、小木块、解剖刀、刀片、载玻片、蒸馏水（滴瓶）、漂白-粉精片两研缸、漏斗、皱纹纸、毛笔、针、剪刀、三角瓶、试管、记号笔、标签、金刚砂、保湿罩、弥雾机。70％乙醇、0．1％升-汞、灭菌培养皿（吸管）、灭菌水、灭菌培养基（PDA和NA）。三、内容与方法3．1 病原真菌的分离和培养 植物病原微生物分离和培养工作应该在专门的无菌操作室或超净工作台上进行，但是亦可在清洁和安静的房间中进行。工作时在桌面上铺一块沾湿的纱布，所有工作用具放在湿纱布上，尽量少在室内走动，减少空气流动，以减少污染。选用的分离材料应尽量新鲜，减少腐生菌混入的机会。从受病组织边缘靠近健全组织的部分分离，可减少污染，同时这部分病原生物处于较为活动的状态，生长快，易分离成功。植物病原真菌的分离有组织分离法和稀释分离法两种，在病组织上产生大量孢子的病原真菌以及病原细菌的分离都可用稀释分离法。3．1．1 组织分离法 按照以下步骤进行：（1）培养皿准备：取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注明分离日期、材料和分离人姓名。  （2）培养皿平板制备：用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1－2滴（减少细菌污染），然后将熔化而冷至45℃左右的马铃薯琼胶培养基一管倒入培养皿中，轻轻摇动使成平面（分离细菌时则不能加乳酸）。  （3）切取病组织小块（叶斑病类）：取新鲜病叶，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘切取小块（每边长约3―5毫米）病组织数块。（4）表面消毒：将病组织小块放入70％酒精中浸数秒钟后，按无菌操作法将病组织移入0.1％升-汞液中消毒1―3分钟，然后放入灭菌水中连续漂洗三次。也可用漂白-粉精片（1－2片），研磨后加灭菌水10ml，消毒5―10分钟。果实、块茎和枝秆等组织内部的病原菌可用脱脂棉蘸70％酒精涂拭病部表面，通过火焰烧去表面酒精，重复进行2－3次，达到表面消毒。  （5）用无菌操作法将病组织小块移至培养基平面上，每培养皿内可放4－5块。  （6）翻转培养皿，放入26－28℃恒温箱内培养，3―4日后观察结果。  （7）用无菌操作法自培养皿中选择菌落，挑取少许菌丝及孢子，在显微镜下观察。如系玉米小斑病菌孢子，即可用接种针自菌落边缘挑取小块菌落移入斜面培养基，在26－28℃恒温箱内培养，3－4天后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得玉米小斑病菌纯菌种，可置于冰箱中保存。如有杂菌生长，需再次分离获纯培养后，方可移入斜面保存。3．1．2 稀释分离法以棉花红腐病果为材料，按照下列步骤分离：（1）取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，分别编号（1 、2、3），并注明日期、分离材料及分离者姓名。  （2）用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一培养皿中分别注入0．5－1．0ml灭菌水。  （3）用灭菌接种饵从棉花红腐病果上刮取病菌孢子，放入培养皿内的水滴中，配成孢子悬浮液。  （4）用接种饵蘸一饵孢子悬浮液，与第1个培养皿中的灭菌水混合，再从第1个培养皿移三饵孢子悬浮液到第二个培养皿中，混合后再移三饵孢子悬浮液到第三个培养皿中。每次移菌前，接种饵均需在酒精灯火焰上烧过。 ˇ（5）将三管熔化并冷却到45℃左右的培养基，分别倒在三个培养皿中，摇动使培养基与稀释的菌液充分混匀，平置冷却凝固。  （6）将培养皿翻转后放入恒温箱（26－28℃）中培养，3－4天后观察菌落生长情况。  （7）获纯培养后，从菌落边缘挑取菌丝块移入斜面培养3-4天后，放入冰箱保存。  要获得纯净培养，一般需经3次稀释分离（重复3次），当培养物高度一致时才能作为纯培养的菌种保存。3．1．3 真菌的培养植物病原真菌多为好气性真菌，在有丰富营养的培养基上能很好地生长，但它们对温度的要求差异较大，绝大多数的真菌可以在20－30℃间正常生长，但少数要在15－20℃间才能正常生长，少数真菌孢子必须在5℃左右的低温下才能萌发。3．2 病原细菌的分离与培养病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病材料作细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离（少数病例无喷菌现象）。3．2．1 稀释分离法稀释分离法是最经典的标准分离法，方法与真菌孢子稀释分离法基本相同，但要将病组织放在灭菌水中用灭菌玻棒研碎并让组织碎块在水中浸泡30－60分钟（在灭菌培养皿中研碎并浸泡），让细菌充分释放到灭菌水中成为细菌悬浮液再进行稀释分离。 3．2．2 划线分离法除去上述稀释分离法以外，较为方便的方法是划线分离法，步骤如下：（1）预先把NA培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中4－6小时，使表面没有水滴凝结。  （2）配制细菌悬浮液。  （3）在培养皿盖上写上分离材料名称、日期和姓名。  用灭菌的接种饵蘸取细菌悬浮液在干燥的培养基平板表面按图17所示方法划线。划过第1次线后的接种环应放在火焰上烧过，冷却后直接在第1次划线的末端向另一方向划线，同上，灭菌后再划第三、第四次线。  （4）翻转培养皿，放在26－28℃恒温箱中培养，2－3天后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来（C）。  （5）仔细挑取细菌的单菌落移至试管斜面，同时再用灭菌水把单菌落细菌稀释成悬浮液作第二次划线分离。如两次划线分离所得菌落形态特征都一致，并与典型菌落特征相符，即表明已获得纯培养，最hao要经过连续三次单菌落的分离。确保纯化。3．2．3细菌的培养病原细菌的培养条件因种类不同而略异。棒杆菌属细菌的生长适温较低（20－23℃）；假单胞菌中的青枯菌类则要求在较高的温度（35℃）下才能良好地发育；软腐型欧氏杆菌在厌氧条件下生长比好气条件下生长更快，致病力更强。3．3植物病毒分离和纯化植物病毒的分离和纯化比较特殊，由于病毒是专性寄生物，因此不能离开活的寄主。操作时虽然不需无菌操作，但仍必须实行严格的隔离以防止污染和混杂。 ′以有花叶病症状的烟草病叶为材料，进行病毒的“单斑分离”与纯化，步骤如下：  （1）首先用肥皂水洗净双手，特别注意刷去指甲内的污染物。  （2）采摘半片病叶放在消过毒的研钵中，加磷酸缓冲液（0.01M PBS，pH7．2）1ml（5－6滴），研碎。  （3）在供接种用的心叶烟幼苗和苋色藜幼苗健苗顶部平展叶片上，撒少许金刚砂（600目／英寸2），然后用手指蘸取病汁液轻轻涂抹叶片（摩擦接种），写好标签牌，插在盆钵中。  （4）3分钟后用自来水将接种叶冲洗干净，放在温室中培养。  （5）2-3天后在接种叶上即出现坏死性枯斑，初为褪绿，后为黄白色。  （6）剪下单个枯斑，再按上述方法接种健康的心叶烟和苋色藜幼苗，使它再次出现形状大小、色泽均一致的枯斑，即为已经分离纯化的病毒标样。材料经快速干燥后可置低温下保存。  （7）将此枯斑病叶分别接种到黄瓜或普通烟草上，又可得到系统的花叶症状。不同的病毒接种在不同的寄主植物上会变现不同的症状。选用这些特定寄主植物作为鉴别寄主，进行病毒和病毒病害的诊断，可做出初步鉴定。将病组织汁液接种在枯斑寄主上，根据枯斑的特征，还可进一步区分病毒的种类，并作为病毒定量的一种简易方法。3．4 植物病原线虫的分离大部分植物寄生线虫只为害根部，有些还是根内寄生的，少数可为害地上茎、叶、花果。从有病植物材料中和土壤中分离线虫的方法很多，它们各有优缺点，常用的方法有漏斗分离法、浅盘分离法、漂浮分离法等。3．4．1 贝曼（Baermann）漏斗分离法操作简单、方便，适于分离植物材料和土壤中较为活跃的线虫。一般是选用一只口径为10－15cm塑料漏斗，下接一段长约5－10crn带有弹簧夹的乳胶管，漏斗放在木架或铁环上，漏斗内盛满清水，病植物材料或土样用双层纱布包扎好，慢慢浸入清水中，浸泡24小时后样品中线虫因喜水而从材料中游到水中，并因自身重量逐渐沉落到漏斗底部的橡皮管中，慢慢放出5ml管中水祥于离心管中，在1500转／分的离心机中离心3分钟，倾去上层水液，将底部沉淀物连同线虫一起倒在表面皿或计数皿中，在解剖镜下计数，然后将线虫挑至装有固定液的小玻管中备用。样品材料也可用一网筛搁在漏斗口上，使水面能淹没材料，线虫也可以游离出来并沉降到底部。3．4．2 浅盘分离法 用两只不锈钢浅套放在一起，上面一只称筛盘，它的底部是筛网（10目／英寸2），下面一只浅盘略大些是盛水盘（底盘）。将特制的线虫滤纸放在筛盘中用水淋湿，上面再放一层餐巾纸，供分离的土样或材料放在餐巾纸上，在两盘之间隙缝中加水浸没材料，在室温（20℃以上）下保持8天，材料中的线虫大都能穿过滤纸而进入托盘水中，收集浅盘中的水样通过二个小筛子（上层为25目粗筛，下层为400目细筛）。线虫大多集中在下层筛上，可用小水流冲洗到计数皿中。  浅盘法比漏斗法好，它可以分离到较多的活虫，而且泥沙等杂物较少。3．4．3 胞囊漂浮器分离法（Fenwick－Oostenbrink改良漂浮法）对于没有活动能力的线虫胞囊可采用Fenwick漂浮筒漂浮的方法分离，筒内先盛满清水，把10.0g风干土样放在顶筛中。用强水流冲洗土样，使全部淋入筒内，再用细水流从顶筛加入，使土粒等杂物沉入筒底，胞囊和草渣等则逐渐漂浮起来沿倚口倾斜的环槽流到承接筛中（100目）,先把筛中胞囊等沈入烧杯中，再倒入铺有滤纸的漏斗中，收集滤纸上的胞褒。  在解剖镜或扩大镜下，学习用镊子、毛针、竹针、毛笔等工具从水样或滤纸上挑取线虫。3.5 拌种法和浸种法 种子传染的病害可采用这两种接种方法。拌种法是将病菌的悬浮液或孢子粉拌和在植物种子上，然后播种诱发病害。小麦腥黑穗病可采用此法接种。浸种法是用孢子或细菌悬浮液浸种后播种，大麦坚黑穗病、棉花炭疽病和菜豆疫病可用此法接种。3.6 土壤接种法 由粪肥、土壤传染的病害可以采用拌土接种法。土壤接种法是将人工培养的病菌或将带菌的植物粉碎，在播种前或播种时施于土壤中，然后播种。也可先开沟，沟底撒－层病残体或菌液，将种子播在病残体上，再盖土。  有的病原物能在土壤中长-期存活（土壤习居菌），把带菌土攘或带有线虫接种体的土样接种到无菌（虫）土中，再栽种植物，就可以使植物感染，如棉花枯黄萎病、小麦土传花叶病毒和一些线虫病等。对于青枯菌可以采用土壤灌根的方法。3．7喷雾法和喷撒法 这两种方法适用于气流和雨水传染的病害，大部分细菌病害和真菌叶部病都可采用喷雾接种，如水稻细菌性条斑病、玉米大斑病、小斑病。将接种用的病菌配成一定浓度的悬浮液，用喷雾器喷洒在待接种的植物体上，在一定的温度下保湿24小时，诱发病害。3．8伤口接种 除了植物病毒接种时常用的摩擦接种属伤口接种之外，植物病原细菌、病原真菌也常用伤口接种法。许多由伤口侵入，导致果实、块根、块茎等腐烂的病害均可采用。先将接种用的瓜果等洗净，用70％酒精表面消毒，再用灭菌的接种针或灭菌的小刀刺伤或切伤接种植物，滴上病菌悬浮液或塞入菌丝块，用湿脱脂棉覆盖接种处保湿。  水稻白叶枯病的伤口接种常用剪叶接种和针刺接种法。先通过火焰或用75％酒精消毒解剖剪，将剪刀在白叶枯病菌悬浮液中浸一下，使剪刀的刃口蘸满菌液，再将要接种的稻叶叶尖剪去。接种处不必保湿，定期观察病情。细菌悬浮液的浓度为108cfu／ml。3．9 介体接种3．9．1 菟丝子接种 在温室中研究病毒、菌原体等病害广为采用的一种接种方法，先让菟丝子侵染病株，待建立寄生关系或进一步伸长以后，再让病株上的菟丝子侵染健株，使病害通过菟丝子接种传播到健康植株上。3．9．2 蚜虫及其他介体昆虫接种 详见植物病毒的传染方法。所有的接种实验都应设有对照，即用清水代替病菌，用同样的方法接种，观察发病与否。  分别用土壤灌根法接种番茄青枯菌、用喷雾接种法接种水稻稻瘟病菌、用剪叶接种的方法接种水稻白叶枯病菌，注意针对不同病害接种后培养的条件，观察不同病害症状出现的过程。

一、在组织培养中污染来源1. 植物本身具有：（1）植物病原菌有些作物的病害已被透彻研究，因此在大量繁殖时，可立即检查出来，但有些则否，造成若有污染时，不知来源为何。（2）和植物有关的菌类有修植物本身便会和一些菌种共生，或是寄生于植物内部。 2. 植物所带入的污染：内在污染源许多植物表面或大气中生存的微生物，可经由植物自然的开口或伤口进如植物内部，而有一些兼性腐生菌或绝对寄生菌，可藉由载体或是拥有一些侵入的机制侵入植物内部，依其存在的地方分为1. 细胞内－inter2. 细胞间隙－interacellular种类有：virus/bin毒、viroids类病毒、prokarytoes原核生物、fungi真菌、柔膜纲（ex:mite）、立克次体。 3. 操作室：外在污染源在组织大量培养下，除了植物本身外，大部分最有可能的污染来源便是来自操作室。依其可能原因分析为：（1）空气在操作室中，未过滤空气带有大量的微生物，随者操作人员或植株接触时，而污染培养皿。故在国外对于操作室内空气的清洁度分为四种等级：ClassⅠ.没有容易培养的微生物，和作物之主要病原菌Ⅱ.没有容易培养的微生物，和作物特殊病原菌Ⅲ.没有容易培养的微生物Ⅳ.未做检测（2）不完全的灭菌设备或技术因为使用灭菌不完全的设备或是技术，而导致植株或培养皿的污染，例如：有些酵母菌，可避免酒精消毒，还有一些会产生内孢子，而避免火焰消毒。 （3）人员在整个操作室内，人员可说是最大的带菌者，其不管在毛发或是衣服等，都隐藏属不清的菌。在进入操作室前，最好能将作业人员清洁处理，然后换上脱鞋，或是将尘土去掉。（4）细缝的存在因为若操作室有细缝的存在，则造成外果气体直接流入，使得空气中菌数增加。（5）操作台上的滤网不干净因为使用过久，或不当保养，而造成滤网坏掉，而产生更多的污染。（6）蹒及蓟马的存在此为珠形网，具有活动能力，能到处跑来跑去。因此常造成散乱的污染。 4.栽培过程污染在栽培室，组培瓶外和外界气体交换时，亦会有污染进入。污染机率取决于空气中带菌密度与组培瓶空气交换率。 二、污染的种类及形式1. 污染的形成依据污染的来源，可将污染分为三个形式：a.由植物内部或病原菌所造成的污染植物内部或病原菌所造成的污染，所呈现是系统性，及从stageo~stage4中都可发现，而且占有一定的百分比。b. 在制造时所造成的污染如因蹒或是空气中的关系造成的污染，其所表现的方式是散乱（random）性非系统性，且不集中于某一地方，占的百分比也不一定，是机率性。c. 技术上的失误其呈现方式有一定性，例如由此工作台所生产得植株都被污染，表现为带状性，可用卷标方式来追踪，以进而改善。2. 污染的来源分类A、污染的种类，以总体来说可分为下列几种：a.病毒(virus)－常存在植物内部。b.(viroids)常存在植物内部c.细菌－在组织培养中又分依其来源和所在地方分类如下：(a)phlem-eimited生长于韧皮部 xylem-eimited生长于木质部(b)植物病原细菌(c)空气中存在的细菌，但因植物有伤口，或是营养丰富的地方，可分为植物表面的细菌或植物内部的细菌。例如：Bacillus spp.可抗热，在不完全灭菌的玻璃器皿中可发现。(d)菌质体是一种像细菌的微生物，但是本身没有细胞壁，可以在培养基培养，亦可用特殊的抗生素（四环霉素）抑制其生长。其种类有microplasm与spiroplasm。(e)真菌在植物病害中，真菌所引起的病害特别多且严重，且因其会产生孢子，所以会随着空气飘散。一旦落于适当的环境下，一粒小小的孢子便会扩大成一个菌落，污染整个组织培养瓶。例如常见的酵母菌，其菌落为粉红色，若有其出现，则其污染来源可能来自空气。(f)蹒或蓟马此为细小的微生物，具有活动能力，喜欢吃菌丝。在国内使用期限较久的组培场中常出现此问题。(g)立克次体目前未清楚其污染方式。 B、以培养难易区分污染源1. 在培养基中易培养菌类细菌，真菌，蹒。2. 在培养基中不易培养的菌类病毒，类病毒，立克次体，菌质体。 在组织培养过程中，常造成污染或是造成威胁的菌类，称为培养菌类。因常为腐生菌，且营养需求不高（随便吃，随便活）所以常造成成本的增加。而且污染后，常使培养基的pH值降低，洋菜无法凝结，而使植物无法生长或是产生有毒物质或副产品，使得植物生长缓慢，或是干脆就在植物上生长。在培养基上不易培养或是不能培养的菌种，就不会造成太大的威胁。 C、各种菌种其主要传播方式1. 病毒，类病毒，菌质体－常利用机械或利用有载体传播。2. 细菌－可经人力，气流或水，及昆虫等传播。3. 真菌－亦同上，但孢子可经空气传播。4. 蓟马－同上，具活动力，自由运动，应慎防出现。 D、依其菌落生长出现的快慢区别1. 可见的菌落在组织培养中。一些易培养的菌类，其生长特性为快速蔓延整个组培瓶。但此种污染可利用工作人员之视觉观察将之侦测出来将之销毁，对后代植株造成威胁不大。2. 潜藏的菌落－在组织培养中有些不易培养或是在植物内部寄生或共生的菌类或病原菌，在培养时没有表现出来，但是有存在或只有很微弱的表现，但是未被察觉出来。于是便造成了对后代植株的重大威胁及成本的增加。 三、污染种类的鉴定方式1. 针对培养难易菌种鉴定方式A、针对易培养的菌种：其种类为真菌，细菌a.就真菌而言，主要是利用显微镜，视其孢子形态、产孢结构、及菌丝有无隔膜、还有细胞壁之形成加以鉴定。目前亦有使用DNA探针加以分析。b.就细菌而言，则是利用其特殊的生化反应，或是利用选择性的培养基。目前亦有如用fatty acid profiling技术和商业化的test kits加以鉴定。B、不易培养的菌种，如菌质体，病毒，类病毒。a.就菌质体而言，主要是观察其在培养基上菌落的形态。b.病毒而言，分析其核酸的组成与例子的外形。类病毒因没有套膜，以上两种常利用其DNA有同源性而做探针侦测。 C、病原菌的侦测利用柯霍氏法来测其病源性。而利用分子诊断，如血清、ELISA、DNA序列、核酸的探针以鉴定种类。 2. 鉴定菌种常用的方式与应用的微生物种类方法                     目标微生物无种别性指示培养               所有可培养的细菌DNA/RNA 萤光染色法         菌质体及有关原核生物Leaf dip electon microscopy        长条状的病毒，其数目较多者亦适用电泳                 类病毒有种别性ELISA                 细菌及病毒PALIAS                细菌及病毒ISEM                  病毒DNA探针                所有微生物快速诊断的 kits             细菌Fatty acid profiling            细菌3. 一般对细菌的基本测试a.Gram stainb.形状c.游动性d.催化酵素的测试e.氧化酵素的测试f.热稳定性g.行氧化作用或发酵作用 四、针对污染源常使用的防治方法A. 种类1. 热疗－对病毒较有效但须花费时间。处理时，需6-12星期在30-40℃。2. 冷疗法－亦对病毒有效。3. 利用抗生素。4. 以分生组织，不带病毒等污染源。5. 利用培养基中高糖，高盐的浓度。6. 利用抗并du药物。7. 营养需求不同。8. 利用水。9. 抽样检测。 B、防治方法之效果讨论1. 热疗法及冷疗法对病毒有效，但须花时间处理，例如：热疗法处理时间需花6-12星期在30-40℃。2. 利用抗生素这是目前较常用的方法，但是在抗生素加入培养基，其有效浓度常因植物具有半渗透功能，而使浓度无法达到有效浓度。使用抗生素时，需注意下列事项：（1）要知道抑制的微生物为何，再使用抗生素，及对症下药。（2）要决定最小抑制浓度，以降低成本。（3）要确定抗生素不会对植物造成并害或突变。（4）确定抗生素在培养基上是否有作用。（5）使用时，常因需要而多种混合或交替使用。（6）有些抗生素在某些国家是禁止使用，使用前必须做询问此药剂是否合法使用。使用抗生素的缺点（1）可能对哺乳类动物有害。（2）若是使用生长期较长的植物，微生物亦有抗药性产生。（3）容易错误使用：没有针对微生物而使用各种不同的抗生素。

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生理性溶液为代体液，用于维持离体的组织、器官及细胞的正常生命活动。它必须具备下列条件：⑴渗透压与组织也相等；⑵应含有组织、器官维持正常机能所必需的比例适宜的各种盐类离子；⑶酸碱度应与血浆相同，并具有充分的缓冲能力；⑷应含有氧气和营养物质。1．常用生理溶液的配制方法动物实验中常用的生理盐溶液有生理盐水、任氏（Ringer）溶液、乐氏（Locke）溶液和台氏（Tyrode）溶液四种，其成分各异，如下表所示。注意：CaCl2和MgCl2不能先加，必须在其他基础溶液混合并加蒸馏 水稀释之后，方可边搅拌边滴加CaCl2和MgCl2,否则溶液将产生沉淀。葡萄糖应在使用时加入，加入葡萄糖的溶液不能久置。2．几种生理溶液的用途生理盐水：即与血清 等渗之氯化钠溶液，冷血动物采用0.6%~0.65%，温血动物采用0.85%~0.9%。任氏溶液：用于青蛙及其他冷血动物。乐氏溶液：用于温血动物之心脏、子宫及其他离体脏器。用作灌流时，在使用前需通入氧气泡15min。低钙乐氏液（含无水氯化钙0.05g）用于离体小肠及豚鼠的离体器官灌注。台氏溶液：用于温血动物之离体小肠。

一、概述大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（ 如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至-150℃，再将这些小管贮存在-150～-196℃的液氮中。超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油（10%）、二甲亚砜（5%）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。二、材料病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管，液氮罐，防护手套和面罩，永jiu性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。三、方法（1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。（3）将有bin毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。（7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。（8）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。

试剂的有效日期是影响实验结果准确性的重要因素。在实际使用过程中，人们总是习惯于用生产日期来判断化学试剂的有效性，其实这是不对的。化学试剂不像食品和药品有严格的保质期，化学试剂一般没有保质期的具体要求和界限，这与化学试剂的保质期受多方面因素影响有关。要根据化学性质、保存条件等，再结合工作的实际情况判断试剂是否出现变质、 能否继续使用。化学试剂一般没有注明保质期，确定试剂是否变质主要是凭经验和做新旧试剂对比试验。化学试剂的有效期随着化学品的化学性质的改变，有着很大的区别。一般情况下，化学性质稳定的物质，保存有效期就越长，保存条件也简单。一般遵循以下几个原则（一般原则，不是绝对原则）：01、无机化合物，只要妥善保管，包装完好无损，大部分可以长-期使用。特殊试剂要根据试剂性质选择保存条件及确定有效期，例：亚硫酸盐、苯酚、亚铁盐、碘化物、硫化物等应将其固体或晶体密封保存，不宜长-期存放；水溶液亚硫酸、 氢硫酸溶液要密封存放；钾、钠、白磷更要采用液封形式；容易潮解的物质，在避光、阴凉、干燥的条件下，只能短时间（1～5 年）内保存。02、有机小分子量化合物一般挥发性较强，包装的密闭性要好，可以长时间保存（3～5 年）。但容易氧化、受热分解、容易聚合、光敏性物质等，在避光、阴凉、干燥的条件下，只能短时间（1～5 年）内保存，具体要看包装和储存条件是否符合规定。03、有机高分子，尤其是油脂、多糖、蛋白、酶、多肽等生命材料，极易受到微生物、温度、光照的影响，而失去活性，或变质腐败，故此，要冷藏（冻）保存，而且时间也较短。04、基准物质、标准物质和高纯物质，原则上要严格按照保存规定来保存，确保包装完好无损，避免受到化学环境的影响，而且保存时间不宜过长。一般情况下，基准物质必须在有效期内使用。在常温（15?C~25?C）下保存时间一般不超过 2个月。超过两个月要重新标定或检查之后再用。05、培养基：按规定配制并消毒好培养基，冷至室温，保存在阴暗处（尽可能贮藏在冰箱内） ，配制好的培养基应在1个月内用完。06、除另有规定外，试液、缓冲液、指示剂（液）的有效期均为半年。液相用的流动相、纯化水有效期为 15 天。07、除另有规定外，液体试剂开启后一年内有效，固体试剂开启后三年内有效。①空气的影响空气中的氧易使还原性试剂氧化而破坏。强碱性试剂易吸收二氧化碳而变成碳酸盐，水分可以使某些试剂潮解、结块；纤维、灰尘能使某些试剂还原、变色等。②光的影响日光中的紫外线能加速某些试剂的化学反应而使其变质（例如银盐、汞盐、溴和碘的钾、钠、铵盐和某些酚类试剂) 。③杂质的影响不稳定试剂的纯净与否、对其变质情况的影响不容忽视。例如纯净的溴-化汞实际上不受光的影响，而含有微量溴化亚汞或有机物杂质的溴-化汞遇光易变黑。④贮存期的影响不稳定试剂在长-期贮存后可能发生歧化聚合，分解或沉淀等变化。在贮存期和有效期内液体如发现有分层、浑浊、变色、发霉等异常现象，流动相用于样品检测时，样品的保留时间或相对保留时间发生明显变化，固体如发现吸潮、变色等异常现象则应停止使用。