琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物

　　一．原理
　　DNA--pian断的分离与回收是基因工程操作中的一项重要技术，例如可收集特定酶切片断用于克隆或制备探针，回收PCR产物用于再次鉴定等。回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会大大增加前期的工作量。

　　本实验采用的是V-GENE公司的DNA凝胶回收试剂盒，其原理是：在凝胶融化液（Buffer DE-A）中凝胶块被迅速融化并释放出DNA。加入高离液序列溶液（Buffer DE-B）后DNA--pian断被选择性吸附到silica膜上。经Buffer W1、Buffer W2洗涤去除残留在silica膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到 silica膜上的DNA--pian断经微量水或Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学实验。

　　二．材料与方法
　　1 材料
　　PCR产物（未经纯化）

　　2 仪器、用具
　　电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、微波炉、台式离心机、移液器、恒温孵育器（55-65℃）、1.5ml 离心管

　　3 试剂
　　1×TAE电泳缓冲液；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心操作] ；琼脂糖；6×加样缓冲液；NJ 缓冲液；DNA洗脱缓冲液；SPW洗涤缓冲液

　　2.4 方法
　　(1) 按常规方法于2%琼脂糖凝胶进行电泳。
　　(2) 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。
　　(3) 称量凝胶重量，以1mg=1μl换算凝胶体积。
　　(4) 加入3个凝胶体积的NJ缓冲液
　　(5) 悬浮均匀后于55℃-65℃加热7min，期间每2—3min摇晃一次，直至凝胶块完全融化。
　　(6) 把DNA—琼脂糖溶液加到一个Mu-Pu DNA回收纯化柱上，并把柱子装在一干净的2ml收集试管内，14000rpm离心1ml，弃去流出液。对于体积大于700μl 的样品，则分别加到不同的柱子上，每次700μl。
　　(7) 用700μl无水乙醇稀释的SPW洗涤缓冲液洗涤柱子，加入柱子中后静置2-3min。室温下14000rpm离心1min。
　　(8) 弃滤液，以同样的方法再洗涤一次。
　　(9) 把柱子装在一个灭菌干净的1.5ml 离心管上，加入30-50μl的DNA洗脱缓冲液或无菌去离子水到柱基质上，14000rpm离心1min以洗脱出DNA。
　　(10) 取3μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。

　　注：PCR产物的纯化选用直接纯化法还是胶回收法主要取决于PCR产物。若PCR产物电泳时为单一条带，可采用直接纯化法，即将酶、dNTP等多余物质去掉便可；若PCR产物电泳时为多条带，则要根据需要回收特定条带，此时须选用胶回收法。